检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物，包括扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物以及一对测序引物。将Touch-downPCR扩增和Sanger测序相结合，可用于准确地和特异性地检测急性髓性白血病患者体内ASXL1基因c.1934dupG位点的突变情况。
【专利说明】检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别涉及检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的方法和引物。
【背景技术】
[0002]急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干/祖细胞发生累积的获得性基因改变，导致细胞增殖、分化和凋亡途径发生变化的一种恶性血液疾病。
[0003]ASXLl基因编码染色体连接蛋白polycomb家族的一个成员，并且与后天的基因表达调控相关。ASXLl基因所编码的蛋白包含了与植物同源的区域和细胞核受体盒区域，并且能够作为配体依赖的视黄酸受体共活化物发挥作用。已证实该蛋白能够通过由NCOAl基因编码的具有组蛋白乙酰转移酶活性的蛋白或由LSDl基因编码的组蛋白去甲基化酶发挥直接作用。与TET2基因突变不同的是，ASXLl突变与其它继发的遗传性异常互相排斥。就ASXl突变而言，骨髓增生异常综合征(MDS)和骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者的突变发生率为10%，AML患者的突变发生率为17%，而慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)患者的突变发生率大于40%。ASXLl突变在MDS患者中是频繁发生的分子畸变，预示患者预后不良。对AML患者进行ASXLl突变筛查可能有助于进行临床危险分级和制定治疗方案。
[0004]在MPN中，ASXLl基因的绝大多数突变发生在第12外显子，其他外显子的突变较少见。最常见的ASXLl基因突变是c.1934dupG位点突变，在所有ASXLl基因突变当中，它所占的比例为50%以上，该突变为一个鸟嘌呤核苷酸(c.1934dupG)的重复，它会导致移码(Gly646TrpfsX12)。
[0005]目前检测ASXLl基因c.193`4dupG突变位点的方法有限制性片段长度多态性(SSCP)，基因测序，荧光定量PCR等，SSCP技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断，由于方法本身的技术限制，检测灵敏度低。由于检测单碱基突变，采用荧光定量PCR的SYBR Green染料法检测基因突变存在引物特异性差的问题，检测结果假阳性率很高。要达到高特异性的要求，荧光定量PCR (探针法)的检测方法就需要设计一对引物和两条MGB探针，其中一条探针检测ASXLl基因野生型位点，另一条探针检测ASXLl基因
c.1934dupG突变位点，而且还需要使用与之相配套的实时荧光定量PCR仪，检测成本比较高，给临床应用带来了不便。
[0006]考虑到灵敏度、提高检测特异性和节约成本等因素，本发明设计了扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，并利用这对扩增引物对送检样本进行Touch-down PCR扩增，让PCR扩增产物纯化后变性，随后利用一对测序引物直接进行Sanger测序，就可以准确和特异性地检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点。其中，Touch-down PCR(也被称作降落PCR)是指每一个(或η个)循环退火温度逐步降低0.5至10C，直到达到一个较低的退火温度，然后在该温度下继续循环10至20次左右。Touch-downPCR扩增可确保正、反向扩增引物与样品DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。特别地，本领域技术人员不能保证每次提取出的样品DNA模板纯度非常高，而且即便所提取出的样品DNA模板纯度足够高，但是该DNA模板可能存在多个与目的基因同源性较高的序列，因此采用Touch-down PCR就可确保正、反向引物最大限度地与目的基因序列结合，从而提高扩增反应的特异性。
【发明内容】
[0007]本发明提供用于检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的引物，所述引物包括:扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为:
[0008]ASXL1-exon12-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0009]ASXL1-exonI2-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0010]进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为:
[0011 ] ASXLl-exonl2-S-F:CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0012]ASXLl-exonl2-S-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0013]进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为:ASXLl-exonl2-F:ASXLl_exonl2-R-R=1:1。
[0014]进一步地，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为:ASXLl-exonl2-S_F:ASXLl-exonl2-S-R=l:l。
[0015]进一步地，所述正`、反向扩增引物的扩增反应条件为:第一阶段，95 °C预变性IOmin ;第二阶段，变性温度94°C 30sec，退火温度64°C 90sec，延伸温度72°C 30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5°C ;第三阶段，变性温度94°C 30sec，退火温度58°C30sec，延伸温度72°C30sec，循环24次；第四阶段，72°C IOmin ;第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4°C下保存。
[0016]本发明还提供一种检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的方法，其包括如下步骤:
[0017](I)提取样品 DNA;
[0018](2)利用一对扩增引物 ASXLl-exonl2_F 和 ASXLl-exonl2_R 对(I)中的 DNA 进行扩增，获得ASXLl基因c.1934dupG突变位点的扩增产物；
[0019](3)利用一对测序引物ASXLl-exonl2-S_F和ASXLl-exonl2-S_R对⑵中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
[0020](4)将(3)中的基因序列与ASXLl基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
[0021]ASXLl-exonl2-F:CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0022]ASXL1-exon12-R: TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
[0023]ASXL1-exon12-S-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0024]ASXL1-exonI2-S-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0025]进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为:第一阶段，95°C预变性IOmin ;第二阶段，变性温度94°C 30sec，退火温度64°C 90sec,延伸温度72°C 30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.50C ;第三阶段，变性温度94°C 30sec，退火温度58°C 30sec，延伸温度720C 30sec，循环24次；第四阶段，72°C IOmin ;第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4°C下保存。
[0026]本发明还提供一种检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括2XPCR Buffer、dNTPs、KOD FXDNAPolymerase^ddH2O 以及一对扩增引物 ASXLl-exonl2_F 和 ASXLl_exonl2-R,所述测序体系包括测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和Bigdye TerminatorV3.1 以及一对测序引物 ASXLl-exonl2-S-F 和 ASXLl-exonl2-S-R，其中
[0027]ASXL1-exon12-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0028]ASXL1-exon12-R: TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
[0029]ASXL1-exon12-S-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0030]ASXL1-exonI2-S-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0031]进一步地，所述试剂盒还包括ASXLl基因野生型参考序列ASXLl-ref。
[0032]进一步地，所述测序纯化液包括碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0033]本发明的有益效果:利用扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，构建了稳定的Touch-down PCR扩增体系。Touch-down PCR扩增富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩`增效率达到最佳，并通过Sanger测序检测目的基因突变多态性，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1样品I的Sanger正向测序结果图。
[0035]图2样品2的Sanger正向测序结果图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0037]实施例1
[0038]用于检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的引物，所述引物包括:扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为:
[0039]ASXL1-exon12-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0040]ASXL1-exonI2-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0041]进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为:
[0042]ASXLl-exonl2-S-F:CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
[0043]ASXL1-exonI2-S-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
[0044]一种检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的试剂盒，包括:样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液；测序体系反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。[0045]检测体系PCR 反应液包括:2XPCR Buffer ；2mM dNTPs ；K0D FX DNAPolymerase (IU/ μ I);扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物ASXLl-exonl2-F(10 μ m)和 ASXLl_exonl2-R(10 μ m)。
[0046]测序体系包括:测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDI (高度去离子甲酰胺)、测序引物:ASXLl-exonl2-S-F(3.2ym)、ASXLl-exonl2-S-R(3.2μπι)，以及 Bigdye Terminator V3.1 (购买自美国Applied Biosystems公司),其中测序纯化液包括奸碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I (EXONI) 1.2U。
[0047]检测体系PCR反应液试剂配制如下:
【权利要求】
1.用于检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的引物，其特征在于，所述引物包括:扩增ASXLl基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为:
ASXL1-exon12-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R: TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为:
ASXL1-exon12-S-F: CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R: TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为:ASXLl-exonl2-F: ASXLl_exonl2-R -R=1:1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为:ASXLl-exonl2-S-F: ASXLl-exonl2_S-R =1:1。
5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为:第一阶段，95 0C预变性IOmin ;第二阶段，变性温度94 °C 30sec，退火温度64 °C 90sec,延伸温度72 V 30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5 °C;第三阶段，变性温度94 V 30sec，退火温度58 V 30sec，延伸温度72 V 30sec，循环24次；第四阶段，72 V IOmin;第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 1:下保存。
6.一种检测ASXLl基因c.1934dupG突变位点的方法，其包括如下步骤: (1)提取样品DNA； (2)利用一对扩增引物ASXL1-exon12-F和ASXL1-exon12-R对(I)中的DNA进行扩增，获得ASXLl基因c.1934dupG突变位点的扩增产物； (3)利用一对测序引物ASXLl-exonl2-S-F和ASXLl-exonl2-S-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列； (4)将(3)中的基因序列与ASXLl基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
ASXL1-exon12-F:CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R:TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
ASXL1-exon12-S-F:CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R:TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
7.如权利要求6所述的方法，步骤(2)的扩增反应条件为:第一阶段，95V预变性IOmin ;第二阶段，变性温度94 V 30sec，退火温度64 V 90sec，延伸温度72 V 30sec,循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5 °C;第三阶段，变性温度94 V 30sec，退火温度58 V 30sec，延伸温度72 V 30sec，循环24次；第四阶段，72 V IOmin ;第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 1:下保存。
【文档编号】C12N15/11GK103757103SQ201310720112
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李文静, 陈奕磊, 王淑一 申请人:成都艾迪康医学检测实验室有限公司