一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种调控植物开花的大豆E3泛素连接 酶基因 GmPUB2的应用。
【背景技术】
[0002] 开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程，开花时间是一个重要的农艺 性状，它决定着作物是否适应于特定地区的光温及生长栽培季节。植物开花是植物从营养 生长到生殖生长转折的关键点，具有很强的可塑性。在各种外界环境和内部因子的影响下， 植物会选择在适当的时间开花而转入生殖生长。通过调节开花期，使植物延迟或提前开花， 可以控制植物的营养生长或生殖生长，避免冷害或其它逆境对作物的伤害，同时可以有效 地利用土地资源，进行合理的轮作。在最适合的时期开花可以达到最大的效益，促进光合产 物的积累、分配及有效利用，对提高作物产量意义重大。
[0003] 在长期的进化过程中，植物形成了一套完整的机制，用于调节自身的生长发育以 适应或抵御外界生物和非生物胁迫。在这些进程中，E3泛素连接酶是泛素-26S蛋白酶系 统中决定识别特异性底物的关键因子，该系统是目前已知所有真核生物体内具有高度选择 性的最为重要的蛋白质降解途径，细胞内许多生命进程的蛋白质均可被泛素化途径修饰和 降解，包括生物与非生物逆境抗性、细胞周期、信号传导和转录等。近年来，E3泛素连接酶 在植物对生物和非生物胁迫响应调控中的功能得到越来越多的研究，其在植物生长发育的 调控也逐渐被人们所认知，但未见大豆E3泛素连接酶参与调控植物开花的报道。因此，研 究大豆E3泛素连接酶基因在植物开花调控网络中的作用具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种控植物开花的大豆E3泛素 连接酶基因 GmPUB2。
[0005] 本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。
[0006] 本发明的又一目的是提供该基因的应用。
[0007] 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在调控植物开花中的应用。
[0008] 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在培育晚开花植物中的应用。具 体是将GmPUB2基因通过表达载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。所 述GmPUB2基因 cDNA核甘酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在培育早花植物中的应用。具体 是将GmPUB2基因通过沉默载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。
[0010] 含有所述的调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2的表达载体在培育晚 开花植物中的应用。本发明提供了含有上述大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2的表达载体 pMDC83 -CaMV35S -GmPUB2。将 GmPUB2 基因克隆到 pMDC83,获得 pMDC83 -CaMV35S -GmPUB2。
[0011] GmPUB2基因的沉默载体在培育早开花植物中的应用。本发明提供了含有上述大豆 E3泛素连接酶基因 GmPUB2的沉默载体TRV :GmPUB2。将GmPUB2基因构建到TRV介导的沉 默载体中，获得TRV :GmPUB2。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 利用现有的植物基因工程技术，并通过根癌农杆菌介导的子叶节转化法将目标基 因 GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显 晚于野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体， 对过表达目标基因 GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早 于对照植株。
【附图说明】
[0014] 图1转GmPUB2基因拟南芥目标基因的检测
[0015] WT为野生型植株，L1、L2、L3和L4为转基因株系。
[0016] 图2野生型植株和转基因株系中GmPUB2的表达量对比
[0017] WT为野生型植株，LU L2、L3和L4为转基因株系，GmPUB2/ACT表示大豆基因 GmPUB2的荧光定量表达量与拟南芥内参基因 Actin表达量的比值。
[0018] 图3野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥的抽薹情况对比
[0019] 图中上中下3层分别表示野生型拟南芥与GmPUB2转基因拟南芥在第26天、第27 天和第28天的抽薹情况。
[0020] 图4野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥第25天的开花情况
[0021] WT为野生型植株，L3和L4为转基因株系，白圈标记的是第25天野生型植株和转 基因株系已开花的植株。
[0022] 图5转基因拟南芥中的GmPUB2基因沉默后的开花时期
[0023] 空白对照表示未作任何处理的转基因拟南芥，沉默空载对照表示转基因拟南芥用 空白沉默载体进行处理，沉默GmPUB2基因表型指转基因拟南芥用含有目标基因的沉默载 体进行处理后的表现情况。
[0024] 图6转GmPUB2基因拟南芥和转基因拟南芥GmPUB2沉默株系中GmPUB2的表达量 检测
[0025] CK为转基因拟南芥植株，VIGS为转基因拟南芥沉默株系，GmPUB2/ACT表示大豆基 因 GmPUB2的荧光定量表达量与拟南芥内参基因 Actin表达量的比值。星号代表差异的显 著性（*Ρ〈0· 05 ;**Ρ〈0· 01)
【具体实施方式】 [0026] （结合附图具体说明）
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 实施例1 :GmPUB2基因的获得
[0029] I. RNA 提取：
[0030] (1)样品处理：采集约IOOmg的大豆叶片组织在液氮中磨碎，加入ImL裂解液RZ， 晃动混匀。
[0031] (2)将匀浆样品在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
[0032] (3) 4°C，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无 RNase的离心管中。
[0033] (4)加入200 μ 1氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。
[0034] (5)4°C，12000rpm离心10min，样品会分成三层：RNA主要在水相中，把水相转移到 新管中，进行下一步操作。
[0035] (6)缓慢加入0. 5倍体积无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，4°C，12000rpm离心 30sec，弃掉收集管中的废液。
[0036] (7)向吸附柱CR3中加入500 μ1去蛋白液RD，4°C，12000rpm离心30sec，弃废液， 将CR3放入收集管中。
[0037] (8)向吸附柱CR3中加入700 μ 1漂洗液RW，室温静置2min，4°C，12000rpm离心 30sec，弃废液。
[0038] (9)重复操作步骤8
[0039] (10)将吸附柱放入2ml收集管中，4°C，12000rpm离心2min，去除残余液体。
[0040] (11)离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。
[0041] (12)将吸附柱CR3转入一个新的I. 5ml离心管中，加65 μ I RNase - Free ddH20， 室温放置2min，4°C，12000rpm离心2min。收集溶解的RNA，保存于-80°C备用。
[0042] 2. cDNA 的合成：
[0043] (1)取-80°C保存的RNA(彡2 μ g)冰上溶解。配置下列反应体系：
[0045] (2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：
[0046] 37 〇C 15min (反转录反应）
[0047] 85〇C 5sec (反转录酶的失活反应）
[0048] 4 〇C 2min
[0049] ⑶-20°C保存备用。
[0050] 3. cDNA 的克隆
[0051] (I)PCR 扩增
[0052] 根据大豆的全基因数据库（http://phytozome. jgi. doe. gov/pz/portal. html)，利 用 Primer5. 0 软件设计特异性引物：上游引物 Fl :5' - GATACATAGAMCAATCGMATTA - 3'（SEQ ID NO. 3)，下游引物 Rl :5' - CTGTTTCTACCMTATGACCT - 3'（SEQ ID NO. 4)。
[0053] 以大豆cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
[0054]
[0055] 按照下列条件进行PCR反应：
[0057] (2) PCR 克隆
[0058] 利用克隆载体pMD19 - T vertor具有T -粘性末端、Taq酶扩增产物具有A -粘性 末端的特性，可将大目标基因 PCR扩增纯化产物和pMD19 - T vertor连成环状质粒。其反 应体系如下：
[0060] 16 tC反应过夜，转化至大肠杆菌感受态细胞中进行培养。
[0061] 挑取单菌落进行扩大培养，经菌液PCR扩增鉴定阳性后，送深圳华大科技股份有 限公司进行测序。测序结果表明该基因是具U - box结构域的E3泛素连接酶基因，命名为 GmPUB2(Glycine max plant U-box 2，GmPUB2)。通过 NCBI 数据库序列比对，GmPUB2 基因 登录号为XM_003544928,全长为1885bp，SEQ ID NO. 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0062] 实施例2 :植物表达载体的构建
[0063] I. attB - GmPUB2 产物的获得
[0064] 根据Gateway体系，在扩增目标基因的特异引物5'端加接头attBl及attB2,然后 以KOD聚合酶进行DNA扩增，扩增得到带接头（attB)的目的基因全长片段。
[0065] attBl+GmPUB2F2 :5' - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT - 3'（SEQ ID NO. 5)
[0066] attB2+GmPUB2R2 :5' - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT - 3'（SEQ ID NO. 6)
[0067] 以大豆cDNA为模板，用attBl+GmPUB2F2及attB2+GmPUB2R2作为上下游引物进行 PCR 扩增，PCR 条件为 94°C 2min，94°C 30sec，68°C 2min，35 个循环，68°C 5min。PCR 产物送 至华大基因进行测序验证后，用I. 〇%琼脂糖凝胶分离分析，回收目的片段并纯化。
[0068] 2.入门质粒pDONOR - GmPUB2的构建
[0069] 上述纯化片段的两段分别带有attBl及attB2序列，其序列在BP clonase酶的催 化作用下与pDONOR入门载体上的attP序列发生位点特异性重组，生成attL序列，把目的 基因整合到pDONOR入门载体中。BP反应体系如下：
[0071] 25°C反应2h后，向反应体系中加入ΙμL的K蛋白酶溶液，37°C孵育IOmin以 终止反应。所得产物用热激法转化入大肠杆菌