专利名称：中国明对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶蛋白与应用，尤其涉 及一种中国明对虾泛素连接酶基因及其编码的泛素连接酶与其在制备具有抗病毒活性的 重组蛋白中的应用，属基因工程技术领域。
背景技术：
众所周知，无脊椎动物虽然不存在适应性免疫，但它们具有强大的先天免疫防御 反应，主要包括细胞和体液免疫，依靠这些防御反应清除或消灭病原。除此之外，近来许多 研究发现泛素-蛋白酶体系统在免疫信号转导过程中发挥重要的调控功能，该系统是目前 已知最重要且有高度选择性的蛋白质降解体系。泛素系统可以通过识别某些酪氨酸磷酸化 标记的免疫细胞膜受体使其降解，从而终止免疫信号转导。另外，在免疫系统重要转录因 子NF-kapa-B活化的不同阶段也有泛素系统参与。通过作用于免疫信号转导过程的多个环 节，泛素系统调控免疫应答及炎症反应。泛素连接酶E2(Ubiquitin-COnjugating enzyme, E2)是泛素与蛋白结合所需的第二个酶，属于E2蛋白超家族，细胞中含有多个基因，每个基 因都含有一个保守的14-16KD的核心区域，为(Ubiquitin_conjugating，UBC)结构域，这一 区域可能参与E2和E3的结合。在UBC结构域中包含一个非常保守的半胱氨酸残基，此残 基直接参与泛素分子的共价连接。我们的研究发现中国对虾泛素连接酶E2基因及其编码 的泛素连接酶具有明确的抑制白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的功 能。与传统抗病毒药物相比，原核表达的重组蛋白药物具有以下优点①稳定性较高， 在100°C加热lOmin条件下仍能保持一定活力；②对正常真核细胞几乎没有毒性，③抗病毒 专一性强，针对多种对虾致病性的白斑综合症病毒具有明显的抑制效果。因此极有希望将 重组蛋白药物开发成为一类新型的高效抗病毒药物。对甲壳类水产养殖中的疾病防治具有 重要的实际意义。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)，俗称中国对虾、中国虾，是我国重要的 水产养殖品种。中国对虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是 一种营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且中国对虾的虾壳的提取物在工业、农业、医 药和化工业中有着广泛的应用价值。但是自上世纪90年代以来，中国对虾受到了白斑病病 毒的严重影响，造成了巨大的经济损失。因此，中国对虾的疾病预防和治疗方面的研究格外 重要。诸多研究表明，在对虾等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或 肽类，如对虾素、甲壳肽(crustins)等，但是在相关的报导中，未见有中国明对虾的泛素连 接酶基因及应用的报导。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种编码从中国明对虾中克隆泛素连接酶基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明的另一个目的是提供从中国明对虾中 克隆的泛素连接酶氨基酸序列。本发明还提供了该基因序列的用途，泛素连接酶的用途。
本发明的中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中所 示信息为Gin Phe Ser Val Gly Pro Val Gly Thr Asp Leu Phe His Cys Gin Ala Thr Val Met Gly25303540Pro Arg Gly Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ser Val Asp Phe Pro Lys Ser45505560Tyr Pro Phe Gin Pro Pro Gin lie Lys Phe Lys Thr Pro lie Tyr His Met Asn Val Gly65707580Pro Tyr Gly Asp lie Cys Leu Asp lie Leu Asp Lys Asn Trp Ser Pro Ala Leu Ser lie859095100Ser Lys Val Leu Leu Val lie Cys Val Leu Met Thr Asp Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu105110115120Arg Phe Asn Leu Arg Asp Glu Tyr Lys Lys Asp Val Ser Val Tyr Glu Asn Asn Ala Arg125130135140Gin Trp Thr Arg Gin His Ala Met145148。本发明还提供了所述的SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的变异体，它编码具有1个 氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，即Cys86-Ser。本发明的中国明对虾泛素连接酶cDNA的克隆方法是利用中国明对虾的肝胰腺 构建cDNA文库，根据其他物种同源序列设计兼并引物进行PCR扩增，对所得序列进行相似 性比对，得到了泛素连接酶的cDNA的3’端序列，然后进行5’端快速扩增，获得全长序列。可以利用本发明的中国明对虾泛素连接酶基因制备原核表达载体，转化大肠杆 菌，表达具有抗病毒活性的重组蛋白。利用本发明获得的重组的泛素连接酶蛋白可用于抗病毒的饲料添加剂、动植物基 因转化和药物开发。
图1为重组中国明对虾泛素连接酶纯化后的电泳图；其中，泳道1，诱导前菌液总蛋白；泳道2，诱导后菌液总蛋白；泳道3，纯化的中国 明对虾泛素连接酶蛋白；泳道M，蛋白分子量marker。图2为重组蛋白FcUbc对病毒感染的对虾的成活率的影响示意图；将重组蛋白FcUbc与病毒WSSV孵育，再注射对虾(图中的FcUbc+WSSV组)36小 时后的死亡率30%左右。作为阳性对照组，①HaGK+WSSV组表示另外1种重组蛋白与病 毒WSSV孵育，然后注射对虾，36小时后100%死亡；②WSSV组表示病毒不经任何处理，直 接注射36小时后100%死亡。Tris-HCl组作为阴性对照表示只给健康对虾注射Tris-盐 酸缓冲液，对虾死亡率与FcUbc+WSSV组相当。图3为重组的FcUbc对WSSV复制的影响；其中，(A)图为半定量PCR扩增WSSV的 片段结果。(B)图为实时定量PCR进行病毒的绝对定量；对虾分为四组处理，分别注射PBS(阴性对照)，WSSV(阳性对照)，BSA+WSSV, FcUbc+WSSV ；分别在24h、48h和72h提取基因组，扩增WSSV片段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例l中国明对虾泛素连接酶cDNA的克隆
1)总RNA的提取采用现有技术一步法提取总RNA。
2)cDNA第一链合成4微升总RNA，加l微升SmartF(5，一TAC GGC TGC GAG AAGACGACA GAA GGG一3’)和l微升01 igoanchor R(5，一GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGACTl6(A／C／G)一3’)，72℃反应5分钟，后加5倍Buffer 4微升，dNTP 1．25微升，RNA酶抑制剂0．625微升，l微升M—MLV逆转录酶，无RNase的灭菌水12．875微升42℃反应60分钟，70℃lo分钟终止反应。
3)中国明对虾泛素连接酶cDNA 3’端快速扩增
根据其他物种中泛素连接酶的保守序列设计兼并引物Fl，与通用后引物3’primerPCR扩增泛素连接酶3’端
正向引物Fl 5’TTCCTTCCTTCTATGCTCACG 3’
反向引物3’pr imer 5’GTCGACATCGATACGCGTGGTC 3’
PCR反应链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件
首先将下列试剂混在一起
。lOx Taq DNA聚合酶缓沖液2．5微升(u 1)
．模板CDNAl u l
。正向引物(10mM)l u l
。反向引物(10mM)l u l
。脱氧核苷酸混合物(dN／P)2 u l
。Taq DNA聚合酶0．125 u l
．灭菌丞17．375 t-t l
。总体积25 u l
PCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸lo分钟。
4)反应产物纯化利用申能博彩公司产品3S柱离心式琼脂糖DNA纯化试剂盒，操作步骤按产品说明书进行。
5)PCR产物连入克隆载体转化克隆菌株取纯化产物3 u l，连接于pBluescript载体(／aKaRa公司产品)。转化到大肠杆菌DH5(11菌株，在含有氨苄青霉素(100微克／毫升)、5一溴一4一氯一3一吲哚一13一D一半乳糖苷(X—gal 0．2微克／毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IP／G 0．1摩尔／毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(3毫升，含100微克／毫升安苄青霉素)中培养过夜。
6)质粒纯化收取过夜培养菌液2毫升，离心(6000转／分，3分钟)收集细胞。
7)序列测定与同源检索取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全19动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较，与泛素连接酶的相似性很高。
8)中国明对虾泛素连接酶cDNA 5’端快速扩增
根据得到的泛素连接酶3’端基因片段，在其内部设计反向引物Rl(5’一CCC TTGCTT CCCTTT CAT AAC一3’)。以肝胰腺cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR(5’一TAC GGCTGC GAGAAG ACG ACA GAA-3 ’)引物和反向引物R1为引物进行PCR扩增，获得中国明对虾 泛素连接酶cDNA的5，序列。将3，和5，端序列拼接，即获得SEQ ID NO. 1所示克氏原鳌虾甲壳肽cDNA基因全 长核苷酸序列。实施例2 原核重组表达载体构建、表达与纯化(1)根据中国明对虾泛素连接酶的序列和表达载体pET30a(NOVagen公司)的克隆 位点，设计引物FcUbc ExF 5' TACTCA GAATTC ATGACGGCACTGCAGAGAATA 3' (EcoR I)FcUbc ExR 5' TACTCA CTCGAG CGTGAGCATAGAAGGAAGGAA 3' (Xho I)本发明选择了 pET30a克隆位点的EcoR I和Xho I酶切位点，因此，设计引物时在 上游引物引入了 EcoR I酶切位点，下游引物上引入了 Xho I酶切位点。(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选以肝胰腺cDNA为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为94°C，2min预变 性;94°C，30s，55°C，45s，72°C，45s，35 个循环；72°C延伸 lOmin。1 %的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。将PCR产物作制备电泳，用申能博彩公司产 品3S柱离心式琼脂糖DNA纯化试剂盒回收、纯化PCR产物，经过EcoR I和Xho I内切酶酶 切，同样表达载体pET30a经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的Xho I和EcoR I内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4 DNA连接酶连接，转化 DH5a感受态细胞，LB+Kana平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37°C振荡扩增 培养并抽提质粒，EcoR I和Xho I双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-FCUbC。 接转化E. coli表达菌株BL21 DE3感受态细胞，涂布LB+Kana平板，37°C倒置过夜培养。(3)筛选表达菌株从上述LB+Kana平板上挑取5个单克隆菌落，3ml LB+Kana液体培养基37°C振荡 过夜培养，次日，取30 ill过夜培养液加入到3ml LB+Kana液体培养基中转培养，37°C振荡 培养3h，至0D6(K1在0. 5 0. 7之间，然后加入IPTG至终浓度为lmmol/L，继续37°C振荡培 养诱导表达4h。诱导前，从不同样品中取出0. 5ml菌液，电泳检测时以未诱导菌株为对照。表达完后，各取0. 5ml菌液，6000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导菌株的样 品，重悬于100 ill去离子水中，以此为电泳样品作12. 5%的SDS-PGAE。根据电泳结果是否 存在诱导表达的重组泛素连接酶的条带，鉴定重组表达菌株。选取表达量高的菌株进行下 面的大规模表达和纯化。(5)重组泛素连接酶表达与纯化挑取表达菌株单克隆在LB+Kana液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日，按照体 积比1 100加入到200ml LB+Kana培养基中转培养，37°C振荡培养3h后，再加入IPTG至 终浓度为lmmol，再37°C振荡诱导培养4h。诱导前取出0. 5ml的菌液，作为诱导前对照样品。 诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7000r/min离心lOmin收集细胞，细胞重悬于20ml 预冷的1 XPBS，加入200 ill 20%的Triton X-100,充分混勻后冰浴中进行超声波破碎细 胞，超声循环为超声3秒(s)；间隔3s ；全程15min。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴 中混勻，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液lOOOOr/min离心15min， 收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。
重组蛋白以包涵体的形式存在，以常规方法经过包涵体变性、复性和常规的组氨 酸标签亲和层析，即获得到了重组蛋白——泛素连接酶，SDS蛋白电泳(SDS-PAGE)结果如 图1所示，该重组蛋白的分子量与根据序列预测的分子量大小一致。实施例3 中国明对虾泛素连接酶重组蛋白具有抗病毒的功能(1)半定量PCR对FcUbc的抗病毒效果进行定性分析将日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)分为四组，分别于腹节和尾节之间的薄 膜处注射 Tris-HCl、WSSV、HaGK+WSSV 和 FcUbc+WSSV。其中 FcUbc 浓度为 20 μ g/mL, WSSV 浓度为3. 2*105/ml，每只虾注射总体积100 μ L。或者利用重组蛋白浸泡对虾(20mg/L)，统 计对虾的死亡率(如图2所示)，并然后利用下列方法检测病毒在对虾体内的复制。在24h、48h和72h，使用东洋纺的基因组DNA纯化试剂盒(Τ0Υ0Β0，Genomic DNAPurification Kit)提取对虾鳃组织的基因组，利用此基因组为模板，首先用肌动蛋白 (actin)进行定量。然后扩增WSSV的片段。结论如图3 (A)所示，在24h和48h，FcUbc+WSSV 一组几乎检测不到WSSV片段；与阳性对照相比在72h，FcUbc+WSSV 一组扩增的WSSV非常 弱，说明了 FcUbc重组蛋白具有明显的抑制WSSV复制的作用。(2)实时定量PCR对WSSV拷贝数进行定量分析用同样方法取得鳃组织基因组后，稀释10倍作为实时定量PCR的模板，根据本实 验室已有的WSSV拷贝数绝对定量的标准曲线，对每一个样本基因组中病毒拷贝数进行绝 对定量，做出柱状图分析。结论如图3(B)所示，与前面半定量PCR相符合，FcUbc+WSSV — 组在72h (即WSSV度过潜伏期开始在细胞内大量增殖时)WSSV的拷贝数显著低于两组阳性 对照，说明了重组的泛素连接酶有显著的抑制病毒增殖的作用。通过以上两种检测方式，说明中国明对虾泛素连接酶重组蛋白确实是通过抑制病 毒的复制而达到降低对虾死亡率的作用。
权利要求
一种中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为(a)序列特征*长度784碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgacggcac tgcagagaat aaccaaggag atgcaggacc tggccgacga cccgctgggc 60cagttctcgg tgggccccgt gggaaccgac ctcttccact gccaggcgac cgtcatgggg 120ccccgtggct cgccctacga aggcggcctc ttcgacctca gcgtcgattt ccccaaatca 180taccctttcc agcccccgca gattaaattt aaaactccaa tctaccacat gaacgtcggc 240ccatacggag atatctgcct tgacatactg gataaaaact ggtcccccgc tctctctatc 300tctaaagttc tgctggtgat ctgcgttctc atgacggacc caaatcctga cgacccgtta 360agattcaacc tccgagacga atataagaag gacgtctcgg tctacgagaa caatgcacgc 420cagtggacac gccagcatgc tatgtgattc cttccttcta tgctcacggg cttgtcaact 480tgctgctcgc atgaatgtca gtatatgctc acgtggatga tgaaattata tcgaagtgaa 540ccgtaataca gatacgatgg aaacatcatt attcctaaac atacacatca tgcttaaaac 600aagtatgctc atatgtaaac cattatatac tcacactcat atgaggaaag gtgcttaagt 660tgttaatttg tatatgttgg catttgttat gaaagggaag caagggtcgt tgaattgttg 720atcttctgtt tttcttttct tcaattgaat taaaatacaa acgttaaaaa aaaaaaaaaa 780aaaa 784。
2.权利要求1所述的中国明对虾泛素连接酶基因编码的泛素连接酶多肽，其氨基酸序 列如SEQID NO. 2所示，其中所示信息为(a)序列特征*长度148氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述:SEQID NO. 2Met Thr Ala Leu Gln Arg lie Thr Lys Glu Met Gln Asp Leu Ala Asp Asp Pro Leu Gly 5101520Gln Phe Ser Val Gly Pro Val Gly Thr Asp Leu Phe His Cys Gln Ala Thr Val Met Gly 25303540Pro Arg Gly Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ser Val Asp Phe Pro Lys Ser 45505560Tyr Pro Phe Gln Pro Pro Gln lie Lys Phe Lys Thr Pro lie Tyr His Met Asn Val Gly 65707580Pro Tyr Gly Asp lie Cys Leu Asp lie Leu Asp Lys Asn Trp Ser Pro Ala Leu Ser lie 859095100Ser Lys Val Leu Leu Val lie Cys Val Leu Met Thr Asp Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu 105110115120Arg Phe Asn Leu Arg Asp Glu Tyr Lys Lys Asp Val Ser Val Tyr Glu Asn Asn Ala Arg 125130135140Gln Trp Thr Arg Gln His Ala Met 145148。
3.权利要求2所述的SEQID NO. 2所示氨基酸序列的变异体，其特征在于它编码具 有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。
4.权利要求1所述的中国明对虾泛素连接酶基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中 的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于其方法是通过基因重组技术使中国明对 虾泛素连接酶基因在大肠杆菌中表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种中国明对虾泛素连接酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提供了其重组表达与纯化方法。本发明还提供了中国明对虾泛素连接酶基因编码的泛素连接酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并提供了该基因序列的用途、泛素连接酶的用途可以利用中国明对虾泛素连接酶基因制备原核表达载体，转化大肠杆菌，表达具有抗病毒活性的重组蛋白。利用本发明获得的重组的泛素连接酶蛋白可用于抗病毒的饲料添加剂、动植物基因转化和药物开发。
文档编号C12N9/00GK101942464SQ20101025480
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者王金星, 赵小凡 申请人:山东大学