专利名称：重组鼠李糖乳杆菌工程菌株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物分子生物学领域，具体涉及提高抗氧化能力的重组鼠李糖乳杆 菌工程菌株及其制备方法。
背景技术：
乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细 菌的泛称，是国际公认的一大类益生菌，乳酸菌发酵产品已经成为最主要的功能性食品。乳 酸菌大多数属于兼性厌氧细菌，生长过程一般不需要氧气，而且氧气的存在可能对其造成 危害。氧化胁迫主要来自于各种活性氧品种(Reactive oxygen spicies，R0S)，包括超氧 阴离子(02_)、过氧化氢(H202)、羟基自由基(·0Η)等，ROS能够破坏蛋白质、核酸、细胞膜等 生物大分子，导致细胞衰亡，其中· OH危害性最大。在进化过程中，细菌细胞内出现了各种抗氧化酶类，其中最重要的是超氧化物歧 化酶(Superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)，前者能够降解02_，后 者能够清除H2O2，最终阻止· OH的积累，保护细胞不受氧化压力的危害。然而，大多数乳杆 菌属缺乏超氧化物歧化酶基因，只有少数菌种含有过氧化氢酶基因，因而耐氧化压力弱。研究表明，鼠李糖乳杆菌是一种典型的具有益生功能的乳杆菌，其染色体上不含 有CAT和SOD基因，抗氧化胁迫能力较弱，作为一种常用的功能性乳酸菌，在发酵产品加工 过程中会受到各种氧化条件的危害，造成产品品质下降。近年来，通过导入外源基因的方法提高受体菌株抗氧化能力的技术飞速发展。人 们将来自于植物乳杆菌、清酒乳杆菌、枯草杆菌和嗜热链球菌中的CAT基因和SOD基因转入 各种耐氧能力弱的乳酸菌受体中，成功提高了这些乳酸菌的抗氧化水平，在鼠李糖乳杆菌 中却并未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组载体，携带有细菌过氧化氢酶基因和超氧化物歧化 酶基因，能够表达出过氧化氢酶和超氧化物歧化酶。所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳杆菌，所述超氧化物歧化酶基因克隆自嗜热链 球菌。所述超氧化物歧化酶基因还包括其自身启动子。所述PCR扩增过氧化氢酶基因的引物为5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3， 和5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3 ’ ；所述PCR扩增超氧化物歧化酶基因的引物为 5’ -CCGCTCGAGCAAGATTTTGTAAG-3 ‘和 5’ -GGGGTACCTGAGGATGATTCTAGAC-3 ’。本发明的另一个目的是提供一种重组鼠李糖乳杆菌工程菌株，该菌株含有能表达 过氧化氢化酶和超氧化物歧化酶的重组载体。本发明的另一个目的是提供一种重组鼠李糖乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如 下步骤
1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和嗜热链球菌的基因组中扩增过氧化氢酶 基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因串联构建到大肠杆 菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502(Sorvig et al. ,2003)上，获得重组质粒；3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；4)通过电穿孔法将重组质粒转化到鼠李糖乳杆菌AS 1. 2466。其中鼠李糖乳杆菌 AS 1. 2466为中国普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所保藏的标准菌 株，保藏号为CGMCC 1.2466T。本发明的另一个目的是提供所述的重组鼠李糖乳杆菌在发酵食品工业上的应用。本发明提供的含有katA和sodA共整合重组质粒的鼠李糖乳杆菌能显著提高该鼠 李糖乳杆菌的耐H202毒性的能力。经过测定，转入katA重组质粒和转入katA和sodA共整 合重组质粒的鼠李糖乳杆菌在6mM H202处理lh后的存活率分别为81. 5%和100%，比含有 空白对照质粒的鼠李糖乳杆菌的存活率高出近一千倍；而转入共整合质粒PSIPCS的鼠李 糖乳杆菌在更高浓度的H202处理之后的存活率比只含有CAT的鼠李糖乳杆菌又高出100多 倍。同时，转入katA和sodA共整合重组质粒的鼠李糖乳杆菌，能在通气的培养条件下有更 多的活菌数，存活的天数也更长，大大提高了抗氧化能力。
图1所示为重组质粒pSIPCAT和pSIPCS的构建示意图。图中A 大肠杆菌-乳杆 菌穿梭质粒PSIP502 ；B 重组质粒pSIPCAT ；C 共整合重组质粒pSIPCS。图2所示为鼠李糖乳杆菌中重组质粒pSIPCS双酶切鉴定。图中A为Ncol/Xhol 双酶切鉴定katA基因。M，DL15000 ;1，PCR扩增katA基因；2，质粒pSIPCS的双酶切。B为 Xhol/Kpnl双酶切鉴定sodA基因。M，DL15000 ；1，PCR扩增sodA基因；2，质粒pSIPCS的双 酶切。图3所示为重组鼠李糖乳杆菌菌体降解过氧化氢的检测。图中1为转入对照载体 PSIPCK的鼠李糖乳杆菌菌体；2为转入重组质粒pSIPCAT的鼠李糖乳杆菌菌体；3为转入共 整合重组质粒pSIPCS的鼠李糖乳杆菌菌体。图4所示为长期通气条件下重组鼠李糖乳杆菌生长情况。图中□表示含有重组质 粒pSIPCAT的鼠李糖乳杆菌； 表示含有对照载体pSIPCK的鼠李糖乳杆菌。图5所示为低糖培养基中重组鼠李糖乳杆菌生长情况。图中A表示含有共整合重 组质粒pSIPCS的鼠李糖乳杆菌； 表示含有重组质粒pSIPCAT的鼠李糖乳杆菌。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1携带有目的基因katA的质粒载体的构建1. 1清酒乳杆菌基因组DNA提取基因组提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，方法如下(1)取培养至对数期的清酒乳杆菌菌液5ml，12000rpm离心1分钟，弃去上清，加入 200 u 1 TES重悬一次，12000rpm离心1分钟，尽量吸去上清；(2)加入180 u 1溶菌酶(20mg/ml)，37°C水浴处理1小时;(3)加入20 u 1 RNase (10mg/ml)，轻微震荡15秒，室温放置5分钟；(4)加入20iU蛋白酶K溶液，轻轻混勻；(5)加入220 u 1缓冲液GB，振荡15秒，70°C水浴处理10分钟，简短离心去除管盖 和内壁的水珠；(6)加入220 u 1无水乙醇，充分混勻15秒，简短离心；(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀转移到吸附柱CB3中，套上收集管，12000rpm离 心30秒，倒掉废液；(8)向吸附柱中加入500 u 1缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液；(9)向吸附柱中加入700 ill漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，再加入 500 u 1漂洗液PW洗涤一次；(10)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，置于室温放置数分 钟，彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50iU经 65-70°C预热的洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心 管，琼脂糖凝胶电泳检测提取结果，并保存于-20°C备用。1. 2PCR扩增过氧化氢酶基因片段katA上游引物5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’；
下游引物5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3，。上下游引物中分别引物了 Nco I和Xho I酶切位点，即序列中带横线的部分。PCR反应程序_组分加量(单位ii 1)_清酒乳杆菌基因组DNA 1上游引物(10iiM)0.5下游引物(10iiM)0.5dNTPs(10mM each)0.5Ex Taq 酶0.510 X反应缓冲液2无菌双蒸水15_PCR反应条件95°C预变性 5min，94°C变性 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，72°C终延伸 lOmin， 共30个循环。1. 3katA 连接到质粒 pSIP502
PCR产物和质粒pSIP502经Nco I和Xho I双酶切，酶切体系见下表
权利要求
一种重组载体，其特征在于，携带有细菌过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因包含自身 启动子。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳 杆菌。
4.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因克隆自 嗜热链球菌。
5.含有权利要求1 4任一项所述的重组载体的鼠李糖乳杆菌工程菌株。
6.权利要求5所述的重组鼠李糖乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下步骤1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和嗜热链球菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因 和超氧化物歧化酶基因；2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因串联构建到大肠杆菌_乳杆 菌穿梭质粒载体PSIP502上，获得重组质粒；3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；4)通过电穿孔法将重组质粒转化到鼠李糖乳杆菌中。
7.权利要求5所述的重组鼠李糖乳杆菌工程菌株在发酵食品工业中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组鼠李糖乳杆菌工程菌株及其制备方法，该鼠李糖乳杆菌工程菌株携带有串联的过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因的表达载体。该工程菌株的制备方法包括如下步骤1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和嗜热链球菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因片段；2)设计特定的限制性酶切位点，串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502上；3)通过电穿孔法将重组质粒转化到鼠李糖乳杆菌中。通过本发明制备的重组鼠李糖乳杆菌工程菌株能显著提高抗氧化能力，能应用于发酵食品工业中。
文档编号A23L1/00GK101948856SQ20101025423
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者安浩然, 罗云波, 郝彦玲 申请人:中国农业大学