专利名称：重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物分子生物学领域，具体涉及提高抗氧化胁迫及胆盐胁迫的能力 的重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法。
背景技术：
干酪乳杆菌广泛应用于食品工业，是乳制品发酵的常用菌种，也是最早公认的益 生菌之一。干酪乳杆菌属于兼性厌氧菌，生长过程中的氧气可能对其造成危害。氧化胁迫 主要来自于各种活性氧品种(Reactive oxygen spicies，ROS)，包括超氧阴离子(02_)、过氧 化氢(H202)、羟基自由基( 0H)等，R0S能够破坏蛋白质、核酸、细胞膜等生物大分子，导致 细胞衰亡。过氧化氢酶(Catalase，CAT)能够清除H202阻止 0H的积累，保护细胞不受氧胁 迫的危害。然而，在乳杆菌属中只有少数菌种含有过氧化氢酶基因，主要是植物乳杆菌和清 酒乳杆菌。干酪乳杆菌染色体上不含CAT基因，抗氧化胁迫能力较弱，作为常用乳酸菌，在 食品加工过程中会受到各种氧化条件的危害，造成菌体死亡及产品品质下降。当干酪乳杆菌随食物摄入人体后，肠道内的胆盐胁迫可能会导致菌株的存活率下 降，从而限制乳酸菌益生作用的发挥。胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)能够将结 合态胆盐水解为游离的胆酸和氨基酸，低pH值下游离的胆酸溶解度下降发生沉淀，从而解 除胆盐对菌株的危害。BSH广泛存在于肠道微生物中，其它生境中的微生物，尤其是来源于 乳制品的干酪乳杆菌中鲜有发现。近年来，通过导入外源基因的方法提高受体菌株抗胁迫能力的技术飞速发展。人 们将来自于清酒乳杆菌及植物乳杆菌中的CAT基因和BSH基因转入到各种乳酸菌受体中， 分别提高了这些乳酸菌的抗氧化水平和耐胆盐水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组载体，携带有细菌过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基 因，能够表达出过氧化氢酶和胆盐水解酶。所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳杆菌；所述胆盐水解酶基因克隆自植物乳杆 菌。所述胆盐水解酶基因还包括其自身启动子。所述PCR扩增过氧化氢酶基因的引物为5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3 ’禾P 5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3，；所述PCR扩增胆盐水解酶基因的引物为 5，-CGGAATTCTATATCGGTTATAAGGG-3，和 5’ -GGGGTACCTTAGTTAACTGCATAGT-3，。本发明的另一个目的是提供一种重组干酪乳杆菌工程菌株，该菌株携带有能表达 过氧化氢化酶和胆盐水解酶的重组载体。本发明的另一个目的是提供一种重组干酪乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下 步骤
1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶 基因和胆盐水解酶基因片段；2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因串联构建到大肠杆菌_乳杆 菌穿梭质粒载体pSIP502(Sorvig et al. ,2003)上，获得重组质粒3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；4)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌。所述的干酪乳杆菌是通过常规的方法从新疆酸马奶中分离得到。本发明的另一个目的是提供所述的重组干酪乳杆菌工程菌株在发酵食品工业上 的应用。本发明提供的含有katA和bshl的重组载体的干酪乳杆菌工程菌株，大大提高了 抗氧化和耐胆盐的能力。经测定，转入携带有katA和bshl载体pSIPCB和不带上述两个 基因的空白载体pSIPCK的干酪乳杆菌在0. 1%⑶CA处理3h后，存活率分别为11. 38%和 0. 79%，含有对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌生长明显受抑制，活菌数降低2个对数值；转 入pSIPCB的干酪乳杆菌在0. 5%⑶CA胁迫下仍可生长，而转入对照载体pSIPCK的菌株在 0. 4%⑶CA胁迫下全面死亡。说明转入pSIPCB的干酪乳杆菌耐受⑶CA的能力明显提高。同时经过测定，转入pSIPCB和对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌在6mM H202处理lh 后的存活率分别为63. 75%和1. 53%，说明其耐H202能力得到显著提高。
图1所示重组质粒pSIPCB的构建示意图。A 大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒pSIPCK ； B 含有katA基因的重组质粒pSIPCAT ；C 双基因重组质粒pSIPCB。图2所示为干酪乳杆菌中重组质粒pSIPCB双酶切鉴定。图中A为Nco I/Xho I 双酶切鉴定katA基因。M，DL15000 ;1，PCR扩增katA基因；2，质粒pSIPCS的双酶切。B为 EcoR I/Kpn I双酶切鉴定bshl基因。M，DL15000 ;1，质粒pSIPCB的双酶切；2，PCR扩增 bshl基因。图3所示为检测重组干酪乳杆菌降解过氧化氢的能力。A 受体菌干酪乳杆菌；B 转入对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌；C 转入katA和bshl双基因重组质粒pSIPCB的干酪 乳杆菌。图4所示为检测重组干酪乳杆菌水解甘脱氧胆盐(⑶CA)的能力。A 受体菌干酪乳 杆菌；B 转入对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌；C 转入katA和bshl双基因重组质粒pSIPCB 的干酪乳杆菌。图5所示为不同浓度⑶CA胁迫条件下重组干酪乳杆菌生长情况。■含有对照质 粒pSIPCK的干酪乳杆菌；□转入katA和bshl双基因重组质粒pSIPCB的干酪乳杆菌。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1携带有目的基因katA的质粒载体的构建
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1. 1清酒乳杆菌基因组DNA提取基因组提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)， 方法如下(1)取培养至对数期的清酒乳杆菌菌液5ml，12000rpm离心1分钟，弃去上清，加入 200 u 1 TES重悬一次，12000rpm离心1分钟，尽量吸去上清；(2)加入180 u 1溶菌酶(20mg/ml)，37°C水浴处理1小时;(3)加入20 u 1 RNase (10mg/ml)，轻微震荡15秒，室温放置5分钟；(4)加入20 ill蛋白酶K溶液，轻轻混勻；(5)加入220 u 1缓冲液GB，振荡15秒，70°C水浴处理10分钟，简短离心去除管盖 和内壁的水珠；(6)加入220 u 1无水乙醇，充分混勻15秒，简短离心；(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀转移到吸附柱CB3中，套上收集管，12000rpm离 心30秒，倒掉废液；(8)向吸附柱中加入500 u 1缓冲液⑶，12000rpm离心30秒，倒掉废液；(9)向吸附柱中加入700 ill漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，再加入 500 u 1漂洗液PW洗涤一次；(10)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，置于室温放置数分 钟，彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 ill经 65-70°C预热的洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心 管，琼脂糖凝胶电泳检测提取结果，并保存于-20°C备用。1. 2PCR扩增过氧化氢酶基因片段katA上游引物5，-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’；下游引物5，-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3，。上下游引物中分别引物了 Nco I和Xho I酶切位点，即序列中带横线的部分。PCR反应程序_组分加量(单位ii 1)_清酒乳杆菌基因组DNA 1上游引物(10iiM)0.5下游引物(10iiM)0.5dNTPs(10mM each)0.5Ex Taq0. 510 X反应缓冲液2无菌双蒸水1权利要求
一种重组载体，其特征在于，携带有细菌过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述胆盐水解酶基因包含自身启动子。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳 杆菌。
4.根据权利要求1或所述的重组载体，其特征在于，所述胆盐水解酶基因克隆自植物 乳杆菌。
5.含有权利要求1 4任一项所述的重组载体的干酪乳杆菌工程菌株。
6.权利要求5所述的重组干酪乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下步骤1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因 和胆盐水解酶基因；2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因串联构建到大肠杆菌_乳杆菌穿 梭质粒载体PSIP502上；3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；4)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌中。
7.权利要求5所述的重组干酪乳杆菌工程菌株在发酵食品工业中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法，该干酪杆菌工程菌株携带有串联的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因的表达载体。该工程菌株的制备方法包括如下步骤1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因片段；2)设计特定的限制性酶切位点，串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502上；3)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌中。通过本发明制备的重组干酪乳杆菌工程菌株能显著提高抗氧化能力和耐胆盐能力，能应用于发酵食品工业中。
文档编号C12N15/63GK101948857SQ20101025424
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者王国宏, 罗云波, 郝彦玲, 陈尚武 申请人:中国农业大学