专利名称：一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。
背景技术：
李痘病毒(Plum pox virus, PPV)是马铃薯Y病毒属成员，病毒粒子呈弯曲杆状， 大小为700nmXllnm，是我国的检疫性有害生物。自然条件下，PPV寄主范围广，可侵染46 种木本植物和150种草本植物，李、桃、杏和樱桃等多种核果类果树均可受害。李痘病毒分 布范围极广，在美国、加拿大、日本、埃及、印度、叙利亚、土耳其、智禾I』、及欧洲许多国家均有 报道。李痘病毒可经蚜虫以非持久性方式传播，扩散速度快，在短时间内即可能给国内整个 核果类产业的发展带来灾难性后果。加强该病毒的检疫监测，对于防止PPV传入具有极为 重要的意义。目前，检测PPV的常用方法主要是ELISA、普通RT-PCR、多重PCR等方法，但这些方 法有的存在假阳性问题，有的难以确定起始模板的拷贝数。本领域迫切需要特异性更强、灵 敏度更高、方便准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。本发明提供的辅助鉴定李痘病毒的试剂盒，包括特异引物对；所述特异引物对为 序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。所述试剂盒还可包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所 示。所述特异探针可为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端连接有荧 光报告基团FAM，3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。特异引物对如下上游引物(F):5，-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3，(序列表的序列 1)；下游引物(R):5，-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3，(序列表的序列 2)。特异探针(TaqMan探针)(核苷酸序列为序列表的序列3)如下5，-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3，。所述试剂盒还可以包括其它PCR常规试剂、RNA提取试剂和反转录常规试剂等。所述试剂盒可用于辅助鉴定李痘病毒。本发明还保护一种辅助鉴定李痘病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的cDNA 为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测病毒为 候选的李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非李痘病毒；所述 特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。所述待 测病毒可为李痘病毒(PPV)、马铃薯X病毒(PVX)或马铃薯Y病毒(PVY)本发明还保护一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤以 待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测样本中含有李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测样本中不含有李痘 病毒；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。本发明还提供另一种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤 以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对和特异探针进行实时荧光PCR，根据扩增曲线判 断待测样本中是否含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列 3所示，5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记有荧光淬灭基团Eclipse。实时荧光 定量PCR技术具有定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适用于病毒的检测。如果 扩增曲线均处于阈值以下，待测样本不含有李痘病毒；如果部分扩增曲线处于阈值以上，待 测样本含有李痘病毒。本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异引物对，为序列表的序列1所示DNA 和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。本发明还保护一种辅助检测李痘病毒的特异探针，所述特异探针的核苷酸序列如 序列表的序列3所示。所述探针具体可为TaqMan探针。采用本发明提供的试剂盒，用引物对与特异性TaqMan探针进行实时荧光PCR检 测，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大 小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。与现有技术比较，本发明的优点如下1)检测结果准确性高。在开发与检验特异引物对与特异探针的过程中，检测准确 率达95%以上。2)检测灵敏度高。至少能检测到160个拷贝的病毒RNA。3)可以定量检测。在定性检测李痘病毒的基础上，可以得到样本中病毒的准确含量。4)检测方法安全。不需要进行电泳检测，避免了溴化乙啶以及一些染料对环境的 污染与人体的损害。5)检测结果易于判读。用引物对与特异性TaqMan探针进行实时荧光PCR检测，根 据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒；根据产生荧光信号值的大小，即 可判断样品中李痘病毒含量的高低。6)检测仪器简便。仅需实时荧光PCR仪，无需电泳仪。适合在口岸检验检疫局进 行推广。本发明公开了一种含有特异引物对和特异探针的试剂盒，可以快速、准确、稳定、 定量鉴定出李痘病毒。根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产 生荧光信号值的大小(扩增曲线)，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。本发明的试剂 盒具有特异性强、准确性高、检测过程操作简便(仅需一台实时荧光PCR仪即可进行检测， 无需进行电泳操作)、检测所需时间短(从李痘病毒的提取到检测结果出现仅需3个小时) 等优点，适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。
图1为PPV荧光定量的灵敏度；1-6依次为1.6X107，1.6X106，1.6X105，1.6X104,1.6X IO3,1.6X IO20图2为PPV荧光定量的特异性；A =PPV ；B :PVY, PVX和空白对照的叠加。图3为PPV荧光定量的重复性；1-5依次为1.6X107，1.6X106，1.6X105，
1. 6X IO4,1.6X IO3O
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实时荧光 PCR仪为 Rotor-Gene 3000PCR扩增仪；Reverse Transcription System A3500和dNTPs购于Promega公司；实时荧光PCR所用试剂、RNA提取试剂盒购自天根公司； Taq酶、连接酶、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5a和DNA Marker DL2000购自TaKaRa ；引物与 探针由大连宝生物技术公司合成。李痘病毒(PPV)购自ATCC，产品目录号为PVAS-709 ’马 铃薯X病毒(PVX)购自ATCC，产品目录号为PV-197 ；马铃薯Y病毒(PVY)购自ATCC，产品 目录号为PV-50 ；ATCC即美国标准菌种收藏所(http://WWW. atcc. org/)。实施例1、试剂盒的制备试剂盒由特异引物对和特异探针组成。特异引物对如下上游引物(F):5，-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3，(序列表的序列 1)；下游引物(R):5，-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3，(序列表的序列 2)。该特异引物对针对序列表的序列4或序列5所示李痘病毒CP基因自5’末端第 677-815 位核苷酸(139bp)。特异探针(TaqMan探针)(核苷酸序列为序列表的序列3)如下5，-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3，。用实施例1的试剂盒进行实施例2、实施例3和实施例4的测定。实施例2、试剂盒的灵敏度测定一、标准曲线的制作1、以PPV的总RNA为模板，用PPV-F和PPV-R组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。PPV-F :5，-CCACCTCCAGTCATACAG-3，；PPV-R 5’ -AGATACCGAGACCACTACAC-3’。PPV-F和PPV-R的靶标序列为序列表的序列4所示的李痘病毒CP基因全序列DNA。2、将步骤1的PCR扩增产物进行电泳，切胶回收，得到纯化后DNA。3、将纯化的DNA连接到pMD18_T载体上，得到连接产物。4、将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选重组子，提取质粒进行PCR鉴 定和测序，结果表明得到了含有序列4所示DNA的重组质粒以及含有重组质粒的重组菌。5、用分光光度计测定重组菌菌液的0D260nm值，并换算质粒浓度(拷贝数/ μ L)，-20°c保存作为质粒标准品备用。
6、将质粒标准品进行10倍梯度稀释，各个稀释液分别作为模板，用实施例1制 备的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光PCR反应体系2. 5Xreal Master Mix 10μ 1, 20 XProbe Enhancer solution 1. 25 μ 1，lOmmol/L 上、下游引物各 0. 5 μ L，20mmol/L 特 异探针 0. 25 μ L，模板 2 μ L，力口 ddH20 至总体积为 25 μ L。PCR 程序-MV 15min ；55°C 20s， 68°C 30s，循环 40 次。7、根据各个稀释度的稀释液的扩增曲线制作标准曲线，标准曲线的函数为y ="3. 643X+37. 576 ；y为-Iogltl基因拷贝数，χ为Ct值，Ct值即每个反应管内的荧光信号 到达设定的阈值时所经历的循环数。二、试剂盒的灵敏度测定1、病毒RNA的提取称取0. Ig发病本生烟叶片，采用植物病毒核酸Trizol提取试剂盒提取病毒RNA， 得到病毒RNA液。用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer定量分析仪测定其浓度。2、cDNA 的合成将病毒RNA进行10倍梯度稀释，分别合成cDNA，每个梯度重复3次。cDNA的合成体系(20. OyL)如下DEPC-H2O7. 8μ L
IOXbuffer2. 0μ L
MgCl2 (25mmol/L)4. 0μ L
dNTP(10mmol/L)LOyL
随机六聚体引物2. 0μ L
RNasin(44U/μ L)0. 5μ L
病毒RNA2. 0μ L
AMV Reverse Transcriptase (22U/μ L)0. 7μ L合成体系混勻后42°C水浴lh，95°C灭活5min，冰上放置待用。3、灵敏度测定将步骤2的cDNA液作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光 PCR反应体系和PCR程序同步骤一的6。结果如图1所示。结果表明，实施例1的试剂盒稳定性强，灵敏度高，至少可以检 测到160个病毒拷贝。实施例3、试剂盒的特异性测定一、病毒RNA的提取分别提取三种病毒(PPV，PVX, PVY)的总RNA 采用RNA提取试剂盒(植物病 毒核酸Trizol提取试剂盒)提取病毒总RNA，得到病毒RNA液；用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer定量分析仪测定其浓度，最终浓度均统一为lOOOng/ul。二、cDNA 的合成分别合成各个病毒的cDNA，cDNA的合成体系同实施例2的步骤二的2。三、实时荧光PCR扩增将步骤二的cDNA液作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光 PCR反应体系和PCR程序同实施例1的步骤一的6。
结果见图2。PPV出现典型的扩增曲线，Ct值读数为17. 25，判为阳性。PVX和PVY 的扩增曲线均在所设定的阈值线之下，判为阴性。可见，采用本发明的试剂盒进行检测具有 很强的检测特异性。实施例4、试剂盒的重复性测定一、病毒RNA的提取分别将实施例2的步骤二得到的10倍梯度稀释的各浓度的cDNA液(分别含有 1.6X107个拷贝数、1.6X106个拷贝数、1.6X105个拷贝数、1.6X104个拷贝数、1.6X103个 拷贝数；每个浓度3次重复)作为模板，用实施例1的试剂盒进行实时荧光PCR。实时荧光 PCR反应体系和PCR程序同实施例1的步骤一的6。结果见图3。结果显示，表明该方法各梯度的变异系数均小于0. 6% ；具有较好的 组内重复性。
权利要求
一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒，包括特异引物对；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探 针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述特异探针为TaqMan探针，其5’末端 连接有荧光报告基团FAM，其3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。
4.权利要求1至3中任一所述的试剂盒在辅助鉴定李痘病毒中的应用。
5.一种辅助鉴定李痘病毒的方法，包括如下步骤以待测病毒的cDNA为模板，用特异 引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的李痘病 毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测病毒为候选的非李痘病毒；所述特异引物对为 序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述待测病毒为李痘病毒、马铃薯X病毒或 马铃薯Y病毒。
7.—种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤以待测样本的cDNA为模板，用特异引物对进行PCR，检测PCR产物；如果得到139bp的 PCR产物，则待测样本中含有李痘病毒；如果没有得到139bp的PCR产物，则待测样本中不 含有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组 成的引物对。
8.—种检测待测样本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步骤以待测样本的cDNA 为模板，用特异引物对和特异探针进行实时荧光PCR，根据扩增曲线判断待测样本中是否含 有李痘病毒；所述特异引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成 的引物对；所述特异探针为TaqMan探针，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端连接 有荧光报告基团FAM，3’末端连接有荧光淬灭基团Eclipse。
9.一种辅助检测李痘病毒的特异引物对，为序列表的序列1和序列表的序列2所示核 苷酸序列组成的引物对。
10.一种辅助检测李痘病毒的特异探针，所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列 3所示。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定李痘病毒的试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括特异引物对和/或特异探针；特异引物对为序列1和序列2所示DNA组成的引物对；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明提供的试剂盒，可以快速、准确、稳定、定量检测出李痘病毒，根据是否产生荧光信号，可以判断样品中是否含有李痘病毒，根据产生荧光信号值的大小，即可判断样品中李痘病毒含量的高低。本发明的试剂盒具有特异性强、准确性高、检测过程操作简便、检测所需时间短等优点，适合农业部门的各检疫检查站、各口岸检验检疫局、植物病毒研究机构等应用。
文档编号C12N15/11GK101928786SQ20101025417
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者张永江, 李明福, 李桂芬, 王进忠, 高雅红 申请人:中国检验检疫科学研究院