专利名称：一个簇毛麦泛素连接酶基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明公开了一个簇毛麦(Haynaldia villosa)中克隆到的Ην-PUB基因，该基因 编码的蛋白质具有U-box结构域及PUB基因的结构特点，属于基因工程领域。在小麦感白 粉病品种扬麦158中过量表达该基因可以提高扬麦158对白粉病菌的抗性。
背景技术：
小麦白粉病是由小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)侵染引起的，是 我国小麦生产中仅次于锈病的主要真菌病害之一，培育和推广抗病新品种是防治白粉病最 经济、有效、且利于环境保护的途径。克隆抗白粉病基因或抗病途径中相关基因，有利于深 入研究小麦抗病机制，并为开发和利用更为安全有效的病害防治新方法开辟新思路和新途径。簇毛麦(Haynaldiavillosa，又名 Dasypyrum villosum,2n= 14，VV)属于小麦族 簇毛麦属，是小麦的一个野生近缘种，高抗小麦白粉病，位于簇毛麦6V染色体短臂上的抗 白粉病基因Pm21是一个广谱、高效抗性基因(参考文献Chen P D，Qi LL, Zhou B, Zhang S Ζ, Liu D J.Development and molecular cytogenetic analysisof wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifyingresistance to powdery mildew. TAG，1995，(91) : 1125-1128.)。研究Pm21基因发挥抗病作用过程中所涉及的转录因子和重 要的防卫反应基因，对于了解广谱抗性的分子机理，运用基因工程手段提高小麦对白粉病 的抗性具有重要意义。
发明内容
技术问题本发明的目的在于公开一个来自簇毛麦的Hv-PUB基因及其所编码的蛋白质，该 基因可作为目的基因导入普通小麦，提高小麦的白粉病抗性，进行小麦品种的抗病性改良。 另外，通过分析Hv-PUB作用的分子机制，可为探索更安全有效的病害防治新方法开辟新思 路。技术方案本发明泛素连接酶基因，来自簇毛麦，命名为Hv-PUB基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0. 1。该Hv-PUB基因全长有长1691个碱基，其中5，-UTR区有105个碱基，3，-UTR有 221个碱基，开放阅读框(ORF)长1365bp (如图9)，编码454个氨基酸，在U-Box结构域具 有Cys、Met、Pro和Gly四个保守的氨基酸残基。该簇毛麦泛素连接酶基因所编码的蛋白质，命名为Hv-PUB蛋白质，其氨基酸序列 为 SEQ ID N0. 2。有益效果1、本发明公开了一个簇毛麦(Haynaldia villosa)中克隆到的泛素连接酶基因 Hv-PUB，为簇毛麦中首次报道。可作为目的基因导入普通小麦，提高小麦的白粉病抗性，以
3进行小麦品种改良。2、利用本发明Hv-PUB基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种 启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子。为了简化 转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡 糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。 转化方法使用小麦转化技术成熟的基因枪法。
四
图 1. Hv-PUB 基因的 RT-PCR0min、5min、15min、30min、lh、2h、4h、24h、48h 表示白粉病菌诱导了 0min、5min、 15min、30min、lh、2h、4h、24h、48h 的样品图2.以Contig25420-F和Contig25420-R为引物，中国春、簇毛麦和小麦-簇毛 麦易位系6VS/6AL及小麦-簇毛麦的一套添加系DNA为模板进行的PCR图3.在小麦感白粉病品种扬麦158中过量表达该基因可以提高扬麦158对白粉 病菌的抗性，结果表明在扬麦158过量表达PUB基因的植物细胞能够很好的抑制白粉菌吸 器的形成。A图为扬麦158中未转入Hv-PUB接种白粉菌孢子发育图，B图为扬麦158中过 量表达Hv-PUB后接种白粉菌孢子发育4.普通小麦染色体示5.簇毛麦染色体示6.小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL的示7.小麦-簇毛麦添加系DA6V的示图 五具体实施例方式1、利用大麦基因芯片筛选簇毛麦的抗病相关基因抗病族毛麦(公知公用材料，Chen P D, Qi L L, Zhou B, et al. Developmentand molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6ALtranslocation lines specifying resistance to powdery mildew.Theor ApplGenet,1995,91 1125-1128.)的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，至三叶期把混合白粉菌孢子 (取自南京地区自然条件下田间小麦白粉菌的混合孢子)抖落在苗上进行诱导。抗病簇 毛麦于白粉菌接种后24、48、72小时取样，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试 剂提取)等量混合形成实验组；非诱导叶片与诱导样品同时取样，分别提取RNA等量混合 形成对照组。实验组和对照组的RNA样品用Superscript II反转录成eDNA(试剂盒购 自Gibco/BRL，Gaithersburg，MD, USA)，并进一步在体外转录成cRNA。实验组和对照组 的 cRNA 样品同时与大麦表达谱芯片 Barley 1 GeneChip (http//www, affymetrix. com/ products/arrays/specific/barley. affx)进行杂交，芯片杂交实验“上海国家生物芯片 工程中心”完成，实验步骤参照Affymetrix公司说明书“Expressed Analysis Technical Manual” (http://www, affymetrix. com/support/technical/manual/expression manual, affx)。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选上调表达基因，得到编号为 Contig25420的抗病相关基因，是一个泛素连接酶基因。由于该基因在诱导样品中比在非诱 导样品中的表达量高，实验组杂交信号与对照组杂交信号比值为221，所以初步判断该基因与白粉病抗性具有密切相关性。2. Hv-PUB基因受白粉菌诱导表达模式为了验证基因芯片数据的真实性，根据Contig25420序列设计一 对 弓I 物(Contig25420-F -ccggtgatcgtgaaggcagat-3', Contig25420-R 5，-tccaggttccaaaaatgctc-3，)进行半定量 RT-PCR 分析。以非诱导、诱导 5min、15min、 30min、lh、2h、4h、24h、48h的抗白粉病簇毛麦叶片的cDNA为模板、以Contig25420_F 和Contig25420-R为引物进行半定量RT-PCR分析，以管家基因Tubulin作为内参 (扩增 Tubulin 基因的弓丨物为 tubulinF :agaacactgttgtaaggctcaac 禾口 tubulin R gagctttactgcctcgaacatgg)。PCR 程序为 94°C预变性 3min ；94°C变性 30s，55°C复性 lmin， 72°C延伸2min，23个循环；72°C IOmin ；4°C保存。PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，在簇毛麦 样品中检测到一条扩增条带，经克隆测序后该片段长468个碱基，与Contig25420同源性达 86%，把簇毛麦中该基因片段定名为Hv-PUB。半定量RT-PCR结果表明=Hv-PUB的表达在白粉菌诱导30分钟至1小时期间达到 最高值，然后缓慢下降后维持在较低水平，表明该基因在簇毛麦中受白粉菌诱导后快速表 达(图1)。RT-PCR显示的表达量结果与基因芯片显示的表达量结果是一致的。3. Hv-PUB在簇毛麦染色体上的定位以Contig25420-F和Contig25420_R为引物，以中国春(公知公用品种)、 6VS/6AL 易位系(公知公用，Chen P D,Qi L L,Zhou B, et al. Development andmolecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6ALtranslocation lines specifying resistance to powdery mildew. Theor ApplGenet,1995,91 :1125_1128.)、 族毛麦(公知公用，Chen P D, Qi L L, Zhou B, et al. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldiavillosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. Theor Appl Genet,1995,91 :1125_1128.)、 小麦-簇毛麦一套添加系DA1V-DA7V(公知公用，见Sears，E. R. 1953. Addition of the genome of Haynaldia villosato Triticum aestivum. Am. J. Bot. 40 168-174)的 DNA 为 模板进行PCR，从簇毛麦扩增出一条特异带，而在一套添加系中只在DA6V中检测到这条簇 毛麦的特异带(图2)，说明该PCR产物来自簇毛麦的6V染色体上。在6VS/6AL易位系中也 扩增出簇毛麦中的特异扩增条带(图2)。由于6VS/6AL易位系中的6AS染色体被簇毛麦 的6VS染色体代换，而在从易位系中可以扩增出特异条带，所以这条PCR产物来自6VS染色 体。综上所述，Hv-PUB基因位于簇毛麦6VS染色体臂上。(注上述材料的染色体示意图见 图 4、5、6、7)4.运用筛选文库的方法克隆Hv-PUB基因全长以 Contig25420-F 和 Contig25420_R 为引物，从簇毛麦 cDNA 文库(公 知 公 用，Yaping Chen, Huazhong Wang, Xiue Wang, Aizhong Cao, Peidu Chen. Cloning andexpression of peroxisomal ascorbate peroxidase gene from wheat. MolecularBiology Reports, 33 :207_213)中筛选到包含 Hv-PUB 基因全长 cDNA 片段的克 隆。测序结果表明，Hv-PUB基因全长有长1691个碱基，其中5，-UTR区有105个碱基，3，-UTR 有221个碱基，开放阅读框(ORF)长1365bp (如图9)，编码454个氨基酸，在U-Box结构域 具有Cys、Met、Pr0和Gly四个保守的氨基酸残基。用Hv-PUB基因的核苷酸序列和蛋白序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现Hv-PUB与水稻、拟南芥、烟草、欧芹病原菌 诱导后快速表达的PUB基因具有较高的相似性，故将该基因命名为Hv-PUB。5.在扬麦158中过量表达Hv-PUB基因将Hv-PUB 基因插入 ρΒΙ220·6(公知公用材料，Ya-Ping Chen et al PlastidialGlutathione Reductase from Haynaldia vi1Iosa is an Enhancer of PowderyMiIdew Resistance in Wheat(Triticum aestiyum).Plant and Cell Physiology, 2007,48 (12) :1702_1712)多克隆位点，构建瞬间表达载体。利用基因枪转化 法将Hv-PUB转化扬麦158叶片，6h后把混合白粉菌孢子(取自南京地区自然条件下田间小 麦白粉菌的混合孢子)抖落在叶片上进行，24小时后于显微镜下观察，结果表明对照转化 PBI220. 6空质粒(图3A)叶片细胞表面的孢子都能够正常萌发，长出初生芽管和附着孢芽 管，附着孢芽管末端形成附着孢紧紧贴附于表皮细胞表面并向表皮细胞壁的方向形成侵入 钉进而形成吸器(图3A箭头所示)；转化pBI220. 6-Hv-PUB的叶片细胞表面的孢子也能长 出初生芽管和附着孢芽管并形成侵入钉，但在侵入钉周围的有细微的隆起(与植物细胞壁 加厚有关，图4B箭头所示)，白粉菌不能正常的形成吸器(如图3B)。由此可见，在小麦感 白粉病品种扬麦158中过量表达该基因可以提高扬麦158对白粉病菌的抗性。序列表<110>南京农业大学<120> 一个簇毛麦泛素连接酶基因及其编码的蛋白质<130> 说明书<160>4<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1691<212>DNA<213> 簇毛麦(Haynaldia villosa)<220><221> 基因 Hv-PUB<222>(1). . (1691)<223><400>1ccacgcgtcc gcgtcagccg ccattccatc tcgtcgtcga tcggctccgg 60cacgccagct cgaccgccgc tttcttctac gtgccgcgac agtccatggt 120ccccgcttcc gcgttcgcgc gttcggcggc gcggcgcgtg gcgcgccggc 180ctcgccgtca ggcgggcgtg gcagcagcct gcgctggtcg ccgccgccga 240tccgtgccga cccacttcct gtgcccgata tcgctcgaca tgatgcggga
cacagatcat cacgccgctg cgagataccg gttggagcct ccccgtgacg300gcgccgacgg ggatcacgta cgaccgggag agcgtggagg gatggctgga gcgcggccac 360gccacgtgcc ccgtgaccgg ccggccgctg cggctggagg agctcgtccc taaccatgcc 420acgaggaggg tgatccagga gtggtgcgtc gccaaccggg gactcggggt agagcgcgtg 480ccgacgccac gcgtcccgat ctccgccttc gacgcgtccg agctcctggc ggccgtgtcc 540gctgccgcga ggcgcgggga tgggccaagg tgccgggagc tggtcgcgag ggccagggcg 600ctcgggaagg agagcgagcg caaccgccgg tgcttcgtgt ccgccagcgc cgcccgcacg 660ctctcctcgg tcttctgcca tcttgccggt cagcgggtgg tgccagcgac ggccctagag 720gagatcctgg cggcgttggt cgtgttctta cctcttgacg aggagtcgag gcgccacatt 780gcctccccgg cgtcgctgga atccgtcgtc tctatcctct cccacagcga gcccctcgcg 840cgggtcagcg ccgtcgtcgt tctccgcgag atcgcctcct catccgacag gcagtgcctc 900gaggcgatgt caaagaccac cggcatatac gcggcgctcg tcaagctcct ggagaaaccc 960gtctcgccgc aggccaccaa ggcggcgctg gtaaccgcgt actacctcgt catgcacacc 1020gagctcgccg cgtcccccct cgtcgacctc ggcgcggtgc ggctcctcct cgagctgctg 1080gtggacgccg acaagggcac gacggagaag gcgctggccg tgctggacag tctgctcctc 1140acatgcaagg gccgcgacga ggcgtacgcg caggcgctgg ccgtgccggt gatcgtgaag 1200cagatgcagc acgtgtccga catggcgacg gagttcgccg tgtcggcgct gtggcggctg 1260tgcaagaact tcgcggcgga cggcggcggg tgcacggccg aggcgctgca ggtcggcgcg 1320ttccagaagc tgctcctgct gctgcaggtg ggctgcgagg gcgtcaccaa ggagcgtgca 1380agcgagctgc tcaggattct caatggatcc agggacggcg ccgagtgcat cgactcgctg 1440
gatttcaaggcgctcaagagacccttctgagtgtgcatattggaacttggttacgatgtg1500
gatagaaccatgcagacacaattaggtttagattctctctttctttggaagaactaccgt1560
gctcatgggggagtatttttggaacctggaatatacggttccactcaaaattagcaaaga1620
atgacatctacaagttgtga￡1￡1￡1￡1￡1￡Ι ￡Ι ￡1tggaaagaaccatccatgca .acaggtaaaa1680
aaaaaaaaaaa1691
<210>2
<211>454
<212>PRT
<213> 簇毛麦(Haynaldia villosa)
<220>
<22 DHv-PUB 氨基酸序列
<222>(1)..(454)
<223>
<400>2
MetValThrProLeuProArgPheArgValArg AlaPheGly GlyAla
151015
AlaArgGlyAlaProAlaGlulieProLeuAla ValArgArg AlaTrp
202530
GlnGlnProAlaLeuValAlaAlaAlaGluLeu GluProSer ValPro
354045
ThrHisPheLeuCysProlieSerLeuAspMet MetArgAsp ProVal
505560
ThrAlaProThrGlylieThrTyrAspArgGlu SerValGlu GlyTrp
65707580
LeuGluArgGlyHisAlaThrCysProValThr GlyArgPro LeuArg
859095
LeuGluGluLeuValProAsnHisAlaThrArg ArgVallie GlnGlu
100105110
TrpCysValAlaAsnArgGlyLeuGlyValGlu ArgValPro ThrPro
115120125
ArgValProlieSerAlaPheAspAlaSerGlu LeuLeuAla AlaVal
130135140
SerAlaAlaAlaArgArgGlyAspGlyProArg CysArgGlu LeuVal
145150155160
8
AlaArgAlaArgAlaLeuGlyLysGluSerGluArgAsnArgArgCys
165170175
PheValSerAlaSerAlaAlaArgThrLeuSerSerValPheCysHis
180185190
LeuAlaGlyGlnArgValValProAlaThrAlaLeuGluGlulieLeu
195200205
AlaAlaLeuValValPheLeuProLeuAspGluGluSerArgArgHis
210215220
IleAlaSerProAlaSerLeuGluSerValValSerlieLeuSerHis
225230235240
SerGluProLeuAlaArgValSerAlaValValValLeuArgGlulie
245250255
AlaSerSerSerAspArgGlnCysLeuGluAlaMetSerLysThrThr
260265270
GlyIleTyrAlaAlaLeuValLysLeuLeuGluLysProValSerPro
275280285
GlnAlaThrLysAlaAlaLeuValThrAlaTyrTyrLeuValMetHis
290295300
ThrGluLeuAlaAlaSerProLeuValAspLeuGlyAlaValArgLeu
305310315320
LeuLeuGluLeuLeuValAspAlaAspLysGlyThrThrGluLysAla
325330335
LeuAlaValLeuAspSerLeuLeuLeuThrCysLysGlyArgAspGlu
340345350
AlaTyrAlaGlnAlaLeuAlaValProVallieValLysGlnMetGln
355360365
HisValSerAspMetAlaThrGluPheAlaValSerAlaLeuTrpArg
370375380
LeuCysLysAsnPheAlaAlaAspGlyGlyGlyCysThrAlaGluAla
385390395400
LeuGlnValGlyAlaPheGlnLysLeuLeuLeuLeuLeuGlnValGly
405410415
CysGluGlyValThrLysGluArgAlaSerGluLeuLeuArglieLeu
420425430
AsnGlySerArgAspGlyAlaGluCyslieAspSerLeuAspPheLys
435440445
AlaLeuLysArgProPhe
450
<210>3
<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>Contig25420-F<222>(1). . (21)<223><400>3ccggtgatcg tgaaggcaga t21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>Contig25420-R<222>(1). . (20)<223><400>4tccaggttcc aaaaatgctc20
权利要求
一个泛素连接酶基因，来自簇毛麦(Haynaldia villosa)，命名为Hv PUB基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的泛素连接酶基因，其特征在于，该Hv-PUB基因全长有长1691 个碱基，其中5，-UTR区有105个碱基，3，-UTR有221个碱基，开放阅读框0RF长1365bp， 编码454个氨基酸，在U-Box结构域具有Cys、Met、Pr0和Gly四个保守的氨基酸残基。
3.权利要求1或2所述泛素连接酶基因在小麦的白粉病抗性基因工程中的应用。
4.权利要求1或2所述泛素连接酶基因Hv-PUB编码的蛋白质，命名为Hv-PUB蛋白质， 其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本发明公开了一个来自簇毛麦(Haynaldia villosa)的泛素连接酶基因Hv-PUB及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。簇毛麦泛素连接酶基因(Hv-PUB)的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因为簇毛麦中首次报道，受小麦白粉病菌诱导快速激活表达，在小麦感白粉病品种扬麦158中过量表达该基因可以提高扬麦158对白粉病菌的抗性。Hv-PUB是簇毛麦抗病途径中的一个关键元件，可作为目的基因导入感白粉病小麦品种，提高白粉病抗性；同时探明其作用的分子机制，有助于了解白粉病的广谱抗性机制。
文档编号C12N9/00GK101928714SQ20091018450
公开日2010年12月29日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者刘园, 曹爱忠, 王慰, 王海燕, 王秀娥, 陈佩度 申请人:南京农业大学