感受态DH5 α之中，涂板于带有50 μ g/mL Kanamycin的LB培养基上以筛选阳性克隆。用attBl+GmPUB2 F2及attB2+GmPUB2 R2作为 上下游引物进行PCR扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的基因片段；然后将单克隆菌液 送华大基因进行测序比对，获得阳性重组克隆pDONOR - GmPUB2。
[0072] 3.重组质粒 pMDC83 - GmPUB2 构建
[0073] 提取pDONOR - GmPUB2质粒，使用LR clonase将GmPUB2交换到目的载体pMDC83 中，构建重组质粒PMDC83 -GmPUB2。LR反应体系如下：
[0075] 25°C反应4h后，所得产物用热激法转化入大肠杆菌感受态DH5 α之中，涂板于带 有50 μ g/mL Kanamycin的LB培养基上以筛选阳性克隆。用GmPUB2的上游引物Fl及GmPUB2 的下游引物Rl作为引物进行PCR扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的基因片段；且同时 提取质粒判断载体片段大小。挑选PCR产物片段大小和载体片段大小均正确的单克隆，从 载体花椰菜病毒启动子35S片段开始向3'方向测序两个反应，所得序列与GmPUB2基因序 列进行比对验证，构建成功重组质粒PMDC83 - GmPUB2。
[0076] 实施例3 :转化拟南芥及转基因功能验证
[0077] I. pMDC83 - GmPUB2载体转化农杆菌
[0078] 提取pMDC83 - GmPUB2质粒，与农杆菌EHA105混匀，用冻融法转化。在含有50mg/ L的Rif和50mg/L的Kan的LB培养基上进行阳性克隆的筛选。之后用GmPUB2的上游引 物Fl及GmPUB2的下游引物Rl作为引物进行PCR扩增检测挑选的单克隆中是否含有目的 基因片段。经验证后的克隆菌体扩繁后-80°C保存待用。
[0079] 2.拟南芥的遗传转化
[0080] (1)种子消毒：将拟南芥野生型种子泡在含有ImL去离子水的I. 5mL离心管中，放 置于4°C中2d后取出，在超净台中先用灭菌水洗两遍，吸走水。向离心管中加入75 %酒精， 放置30sec后吸走酒精。用灭菌水洗两遍，再加 10%的双氧水于离心管，静置lOmin。用灭 菌水洗两遍。加入ImL灭菌水。
[0081] (2)将消过毒的拟南芥种子播种于MS固体培养基上，光培箱中生长，条件为：16h 光照（24°C )/8h 黑暗（22°C )，湿度 70%，培养 7 - 10d。
[0082] (3)将营养土、蛭石灭菌后按1:3混合置于盆钵中，用Hoagland营养液进行浇灌。 然后将拟南芥苗移栽入盆钵之中，裹上保鲜膜保持湿度2d，放入光照培养箱中生长。
[0083] (4) 4周后拟南芥开始开花，剪去开放的花，在侵染前的一天给拟南芥浇透水。
[0084] (5)挑取含有pMDC83 -GmPUB2载体的农杆菌单克隆于IOmL含有50mg/L的Rif和 50mg/L的Kan的液体YEB培养基中，28°C，180rpm培养24h。
[0085] (6)取ImL上述菌液倒入200ml含有50mg/L的Rif和50mg/L的Kan液体YEB培 养基中，28°C，160rpm培养至0D 6。。= 2. 0。5000rpm离心15min弃上清，将农杆菌沉淀悬浮 于含有5%蔗糖和0. 05%的Silwet L - 77的渗透培养基中，使0D6。。= 0. 8。
[0086] (7)用枪头吸取上述侵染混合物于花蕾上使液滴挂在花蕾上，保湿暗培养10h。2d 内生长坏境保持高湿度。一周后恢复正常生长环境。
[0087] (8)按照上述方法根据花期重复侵染数次。收取TO代种子。
[0088] 3.转基因拟南芥的筛选和纯合
[0089] 将野生型拟南芥种子和转基因拟南芥种子经过消毒后播种于含有40mg/L潮霉素 (Hyg)的MS固体培养基上。在长日照光培箱中生长10d。野生型拟南芥的根生长受到抑制， 叶片逐渐发黄，植株死亡。而转基因拟南芥阳性植株具有潮霉素抗性，能够在具有潮霉素的 MS培养基上正常生长。选取正常生长的阳性植株，移栽至盆钵中放置于长日照光培箱中种 植。至植株结荚，收获种子Tl代。将Tl代种子在含有潮霉素的MS培养基上进行筛选，获 得阳性植株，然后单株种植，单株收获T2代，每个转基因系中收取的T2代单株种植单株收 获获得T3代。在含有潮霉素的MS培养基上播种每个T2代植株对应的T3代种子，若出现 阳性植株和野生型植株分离则说明对应T2单株为杂合的转基因植株；若出现全板都是阳 性植株的，则获得T3代纯合阳性植株。移栽T3代拟南芥于盆钵中。
[0090] 4.转基因拟南芥的分子生物学检测
[0091] (1)转基因拟南芥的PCR检测
[0092] 移栽野生型拟南芥和转基因 T3代拟南芥于盆钵中，待拟南芥植株生长4周时，提 取转基因 T3代拟南芥叶片的DNA和RNA，将RNA反转为cDNA，用用GmPUB2的上游引物Fl 及GmPUB2的下游引物Rl对DNA和cDNA进行扩增检测，检测确定转基因阳性株系（图1)。
[0093] (2)转基因拟南芥的qRT - PCR检测
[0094] 选择不同株系的转基因拟南芥T3植株，全株提取总RNA，反转为cDNA作为模板，使 用GmPUB2特异的引物进行荧光定量鉴定（图2)。
[0095] qGmPUB2 - F3 :5' - GTGTGACTTGTGAAAGGTTTGTGGA - 3'（SEQ ID NO. 7)
[0096] qGmPUB2 - R3 :5' - ACTCAACTCAGACACCCTCAAAAGC - 3'（SEQ ID NO. 8)
[0097] 5.转基因拟南芥抽薹开花时间的调查
[0098] 将野生型拟南芥和转GmPUB2基因拟南芥的种子4°C处理和灭菌消毒后，播种于MS 培养基上，光培箱中生长，条件为：16h光照（24°C )/8h黑暗（22°C )，培养7d后，移苗于含 有营养土、輕石1:3混合的盆钵中，用Hoagland营养液进行饶灌。长光照下统计每天的抽 薹率和开花率。结果显示转基因拟南芥出现了晚抽薹的现象（图3)，大多数转基因拟南芥 株系比野生型拟南芥普遍晚抽薹，也导致了开花被推迟的现象（图4)。
[0099] 实施例4 :转GmPUB2基因拟南芥的沉默及功能验证
[0100] 1.沉默载体的构建
[0101] 大豆叶片总RNA的提取方法参照TIANGEN RNA simple Total RNA试剂盒的操作 指南进行，cDNA的合成按照TaKaRa RNA PCR? KIT(AMV)Ver. 3.0操作指南进行。按照引物 扩增GmPUB2的目的片段。
[0102] Si - GmPUB2 - F4 :5' - CCGGAATTCGGGTTGTTGATTGAGAAGAA - 3'（SEQ ID NO. 9)
[0103] Si - GmPUB2 - R4 :5' - CGCGGATCCCGCATCAACCAAACCCAATT - 3'（SEQ ID NO. 10)
[0104] 反应体系为：
[0106] 反应条件为 95°C 5min ;95°C 30sec，53°C 30sec，72Γ lmin，36 个循环；72°C 5min。 琼脂糖凝胶电泳检测、回收、TA克隆。通过菌落PCR验证阳性克隆，并将阳性克隆送至华 大基因进行测序。测序正确的质粒用EcoRI和BamHI双酶切，并用T4连接酶与酶切后的 pTRV:RNA2载体4°C连接16h，将连接产物转化至大肠杆菌，挑取阳性克隆，提取质粒。并转 入农杆菌GV3101，-80°C保存备用。将由pTRV :RNA1和pTRV :RNA2构成的病毒命名为TRV， 由 pTRV :RNA1 和 pTRV :RNA2 :GmPUB2 构成的病毒命名为 TRV :GmPUB2。
[0107] 2.叶片注射及表型观察
[0108] 将含有TRVl和TRV2及含有目标基因的TRV :GmPUB2重组质粒的农杆菌菌株，分别 接入含有5ml LB及相应抗生素的LB培养基中，于28°C、200r/min培养过夜。吸取一定体 积的上述菌液分别加入到含有50ml YEB的三角瓶中，并向YEB溶液中加入5 μ 1乙酰丁香 酮，50 μ 1 抗生素，500 μ I MES (lmmol/L)，28°C、200r/min 培养过夜，至 OD6。。约为 0· 4 - 2. 0 之间，收集菌体。将菌体重悬于MM溶液中，调整农杆菌悬浮液的浓度为0D6。。= 2.0。将 含有TRVl和TRV2的农杆菌悬浮液等体积混合，在室温下放置Ih即可用于叶片注射。此后 每隔3d观察不同处理拟南芥的表型，结果表明沉默后的拟南芥比对照提早抽薹和开花（图 5) 〇
[0109] 3. QRT - PCR 检测 GmPUB2 的表达
[0110] 提取TRV :GmPUB2沉默后的拟南芥的根、茎、叶、花的RNA，合成cDNA，以At - Actin 为内参，相应家系未沉默的拟南芥根、茎、叶、花的cDNA为对照，按照如下引物检测GmPUB2 的表达量。结果表明TRV介导的VIGS体系在拟南芥根、茎、叶、花中均可成功地沉默目的基 因（图6)，进一步验证了表型结果的可靠性。
【主权项】
1.cDNA序列如SEQIDNO. 1所示的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中 的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，cDNA序列如SEQIDNO. 1所示的大豆E3 泛素连接酶基因GmPUB2在培育晚开花植物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将GmPUB2基因通过植物表达载体转入 目的植物内获得晚开花植物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，cDNA序列如SEQIDNO. 1所示的大豆E3 泛素连接酶基因GmPUB2在培育早开花植物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是将GmPUB2基因通过基因沉默载体转入 目的植物内获得早开花植物。6. 含有权利要求1中所述的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的表达载体在培育晚开花 植物中的应用。 7. GmPUB2基因的沉默载体在培育早开花植物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用。调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中的应用。将GmPUB2基因通过植物表达载体转入目的植物内获得晚开花植物。将GmPUB2基因通过基因沉默载体转入目的植物内获得早开花植物。将目标基因GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显晚于野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体，对过表达目标基因GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早于对照植株。
【IPC分类】C12N9/00, A01H5/00, C12N15/82, C12N15/52
【公开号】CN105400800
【申请号】CN201510881296
【发明人】智海剑, 王大刚, 王丽群, 何卓伟, 杨永庆, 杨云华, 林静
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月4日