一种定量检测黄曲霉毒素b1的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及定量检测黄曲霉毒素 Bl的方法，尤其涉及一种适配体生物传感器结 合血糖仪定量检测黄曲霉毒素 Bl的方法，属于黄曲霉毒素 Bl的定量检测领域。
【背景技术】
[0002] 霉菌毒素（mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中产生的有毒代 谢产物，它们可通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害 机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭 曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏马菌素等。黄曲霉毒素 Bl(AFBl)被世界卫生组织（WHO)国际癌症研究机构认定为一级致癌物，开发高灵敏的黄曲 霉毒素检测方法是国际关注的重点。
[0003] 适配体与抗体的性质相似，但适配体特异性更强，对目标靶分子具有更高的亲和 力，更容易获得，在体外可以大量快速的合成，制备方法也更为简单，可以针对不同种类的 目标物进行筛选。血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器，由于其体积小，成本低，操作简 单，能够得到准确的定量结果，已经得到广泛应用。然而，血糖仪只能检测葡萄糖这一种物 质，并且检测范围是0. 6~33mmol/l (10~600mg/dl)。
[0004] 目前，黄曲霉毒素 Bl的很多检测方法存在所需试剂多，操作繁琐，检测周期长，重 现性差，设备昂贵，前处理复杂等缺点，不利于进行现场检测。因此，开发一种便携式适配体 生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素 Bl这种非葡萄糖物质的方法，将具有广泛的 应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测黄曲霉毒素 Bl的方法，该方法 应用适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素 B1，具有操作简便，检出限低，特异 性好，重复再现性好等优点。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明首先公开了黄曲霉毒素 Bl的适配体，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 所述适配体的互补DNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID Nd 9 或 SEQ ID Nd 10 所示。
[0009] 本发明进一步公开了一种定量检测黄曲霉毒素 BI的方法，包括以下步骤：（1)制 备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的黄曲霉毒素 Bl，得到样品提取液，加入到所述 适配体生物传感器中，混匀，孵育；（3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；（4)用血 糖仪进行定量检测。
[0010] 其中，步骤（1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备：（a)活化蔗糖酶；(b) 活化所述互补DNA ; (c)将步骤（a)活化后的蔗糖酶与步骤（b)活化后的互补DNA分别洗 涤，然后混匀，反应合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接所述黄曲霉 毒素 Bl的适配体；（e)将步骤（c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤（d)处理 的磁球上，即得。
[0011] 步骤（b)所述互补DNA的3'端进行巯基修饰；步骤（d)所述黄曲霉毒素 Bl适配 体的3'端进行生物素修饰。
[0012] 步骤（a)所述活化鹿糖酶是将鹿糖酶与sulf〇-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)反应；其中，所述反应的体系包括： 300-500 μ I 20mg/ml蔗糖酶，0. 5-2mg sulfo-SMCC ;所述反应的条件为：先涡旋震荡5min， 然后在恒温混匀仪上室温反应l-3h ;
[0013] 优选的，所述反应的体系包括：400 μ I 20mg/ml鹿糖酶，Img sulfo-SMCC ;所述反 应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应2h。
[0014] 步骤（b)所述活化互补DNA是将所述互补DNA与TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)反应；其中，所述反应的体系包括：80_120μ1 100μΜ互补 DNA，1-3 μ 1 0.1 M缓冲液Β，1-3 μ I 30mM TCEP ;所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反 应 0· 5-2h ;
[0015] 优选的，所述反应的体系包括：100 μ 1 100 μM所述互补DNA，2 μ 1 0.1 M缓冲液B， 2 μ I 30mM TCEP ;所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应Ih ;所述缓冲液B包括：0.1 M 氯化钠，0.1 M磷酸钠，质量比为0.05 %的吐温-20, pH = 7. 3。
[0016] 步骤（c)所述洗涤包括：将步骤（a)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管 Amicon-100K，25°C、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；将步骤（b)反应后的溶液离心， 取上清液，加入到超滤管Amicon-3K中，25°C、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；其中， 所述缓冲液A包括：0.1 M氯化钠，0.1 M磷酸钠 ，pH = 7. 3 ;步骤（c)所述反应合成DNA-蔗 糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-72h，优选为48h。
[0017] 步骤（d)所述链接的体系包括：0. 5_2ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球， 40-80 μ 1 0.1 mM所述黄曲霉毒素 Bl的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应 0. 5-2h ；
[0018] 优选的，步骤（d)所述链接的体系包括：1ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球， 60 μ 1 0.1 mM所述黄曲霉毒素 Bl的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应 lh〇
[0019] 步骤（e)所述洗涤是将步骤（c)合成的DNA-鹿糖酶聚合物用超滤管Amicon-IOOK 于25°C、12000rcf离心10min，用缓冲液A (所述缓冲液A包括：0.1 M氯化钠，0.1 M磷酸钠， pH = 7. 3)洗涤；步骤（e)所述固定是将洗涤后的DNA-鹿糖酶聚合物与步骤（d)处理的 磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应0. 5-2h，优选为lh。
[0020] 本发明定量检测黄曲霉毒素 BI的方法中，步骤（2)将样品提取液加入适配体生物 传感器中，使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml ;所述孵育的条件为：25°C孵育30min ; 步骤（3)所述反应的条件为：25°C反应30min ;所述分离上清液是将反应后的溶液用磁分离 器分离，然后吸取上清液；步骤（4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与黄曲霉毒素 Bl标 准品的浓度作回归方程，将待测样品的血糖仪读数带入回归方程，计算待测样品中黄曲霉 毒素 Bl的浓度；其中，所述待测样品包括食品。
[0021] 本发明针对黄曲霉毒素 BI分别合成了 5条适配体序列及不同适配体序列相对应 的互补DNA序列（适配体序列SEQ ID NO. 1，其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 6; 适配体序列SEQ ID NO. 2,其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 7;依此类推。）；其 中，SEQ ID NO. 5所示适配体序列与SEQ ID NO. 4所示序列的差异在于：SEQ ID NO. 5所示 序列后多加12个A碱基。
[0022] 本发明分别用不同的适配体序列及其互补DNA序列合成适配体生物传感器，比较 不同适配体序列的血糖仪信号值。结果表明，当AFBl的浓度为25 μΜ，SEQ ID NO. 1-4所 示适配体序列所产生的血糖仪信号值分别为37mg/dl、35mg/dl、43mg/dl、53mg/dl ;SEQ ID NO. 5所示适配体序列加了 12个A碱基以后血糖仪的信号值为115mg/dl。可能是由于添加 12个A碱基以后，适配体序列的3'端与磁球结合，增大了适配体与磁球之间的空间位置，适 配体能更好的与AFBl分子结合，释放下来更多的蔗糖酶分子，血糖仪的信号值明显增加。 因此，本发明黄曲霉毒素 Bl适配体的核苷酸序列优选为SEQ ID NO. 5所示，其互补DNA的 核苷酸序列为SEQ ID NO. 10所示。
[0023] 本发明适配体生物传感器结合血糖仪定量检测食品中黄曲霉毒素 Bl的原理包 括，链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结合；将 DNA-蔗糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当溶液中 含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁 球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水 解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合 物的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比 例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。
[0024] 本发明适配体生物传感器4°C条件下能有效保存7天。
[0025] 本发明对适配体生物传感器检测AFBl的过程中整个实验温度、生物传感器与目 标分子的孵育时间进行了优化。结果表明，蔗糖酶的活性在25°C时实验效果更好；目标物 和DNA-蔗糖酶固定的磁球孵育时间30分钟，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶被释放的更完 全。因此，本发明适配体生物传感器检测AFBl的过程中实验温度均为25°C，孵育时间为 30min〇
[0026] 本发明运用适配体生物传感器结合血糖仪检测缓冲液中不同浓度的AFB1，结果表 明随着AFBl浓度的增加，血糖仪的信号值也在逐步增加。当AFBl的浓度在2. 5X KT8M~ 4. OX 10 6M范围时，血糖仪的信号值有一个良好的线性关系。AFBl的最低检测限是5. 9ng/ ml。欧洲食品安全局规定了 AFBl在食品中限量范围是0~12.0yg/kg。中国现行的 GB2761-2011 "食品中黄曲霉毒素的限量标准"和其他标准规定在婴幼儿谷类辅助食品中黄 曲霉毒素 Bl的限量标准是0. 5 μ g/kg，在玉米，花生及其制品中（花生油除外）黄曲霉毒素 Bl的限量是20 μ g/kg，在大米和食用油中限量是10 μ g/kg，在其他谷物、豆类、发酵食品中 限量是5 μ g/kg。因此，本发明方法的检出限除婴幼儿辅助食品以外基本能满足检测要求。
[0027] 重复实验结果表明，本发明适配体