生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结 合；将DNA-鹿糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当 溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合 物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够 高效水解鹿糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-鹿糖 酶的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比 例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。
[0072] 2. 2缓冲液中AFBl的检测
[0073] 结果如图2所示，随着AFBl浓度的增加，血糖仪的信号值也在逐步增加。当AFBl 的浓度在2. 5 X KT8M~4. OX 10 6M范围时，血糖仪的信号值有一个良好的线性关系，线性 回归方程为：y = 6. 08x+l. 8213, R2= 0. 9958,其中X表示AFBl的浓度，y表示血糖仪示数 的变化值，R是回归系数。最低检测限是5. 9ng/ml。
[0074] 欧洲食品安全局规定了黄曲霉毒素的最大限量值，AFBl在食品中限量范围是0~ 12. O μ g/kg。中国现行的GB2761-2011 "食品中黄曲霉毒素的限量标准"和其他标准规定 在婴幼儿谷类辅助食品中黄曲霉毒素 Bl的限量标准是0. 5 μ g/kg，在玉米，花生及其制品 中（花生油除外）黄曲霉毒素 Bl的限量是20 μ g/kg，在大米和食用油中限量是10 μ g/kg， 在其他谷物、豆类、发酵食品中限量是5 μ g/kg。因此，本发明方法的检出限除婴幼儿辅助食 品以外基本能满足检测要求。
[0075] 当黄曲霉毒素 Bl的浓度为25 μM时进行3次平行重复实验，相对标准偏差在 1.5%。结果表明，该方法具有良好的重现性。
[0076] 此外，合成的适配体生物传感器被保存在4°C冰箱里7天，每天取出一等份用于检 测实验，检测到血糖仪信号值与刚合成时的检测值没有显著差异。
[0077] 2. 3选择性分析
[0078] 为了研究该传感器的选择性，选择了六种霉菌毒素（AFMpAFGpAFGrAFB2WTA and ZEA)进行选择性实验，空白对照组（Control)不含有任何霉菌毒素，AFBl和其他霉菌毒素 的浓度被设定在lppm。结果如图3所示，空白对照组有一个较低的信号值（0. 7mM)为本底 值，除AFBl以外的六种单一的霉菌毒素的血糖仪检测值与空白对照组的血糖仪检测值没 有明显差异，混合组I(MIXl)的血糖仪信号值略高于空白对照组信号值，但是差异不显著。 AFBl和混合组2 (MIX2)的血糖仪信号值明显高于空白对照组，混合组2 (MIX2)的血糖仪信 号值略低于AFBl组，可能由于混合毒素中某些毒素影响了 AFBl与AFBl适配体的结合，导 致释放的DNA-蔗糖酶的量减少，从而水解蔗糖为葡萄糖的量相应地减少，进而产生偏低的 血糖仪信号值。结果表明，AFBl适配体传感器除了 AFBl之外不会与其他六种霉菌毒素特 异性结合。然而，其他的霉菌毒素的存在可能会干扰AFBl和适配体之间的结合反应，导致 包含有AFBl的混合组2检测浓度偏低。结果表明，本发明适配体传感器在AFBl的检测中 具有良好的特异性，不识别其他的霉菌毒素。
[0079] 实施例2适配体生物传感器的合成
[0080] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0081] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0082] 取 300 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)与 0· 5mg sulfo-SMCC混合，祸旋震荡 5min， 放置恒温混匀仪上，室温反应lh。
[0083] I. I. 2DNA分子的活化
[0084] 取 80 μ 1 100 μ M 互补 DNA (thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），1 μ 1 0.1 M buffer Β，1 μ I 30mM TCEP (超纯水）加入到I. 5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混 匀仪上，室温反应0. 5h。
[0085] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0086] 将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分别加入到超滤管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，离心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪 上反应24h。
[0087] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0088] I. 2. 1磁球和AFBl适配体的链接
[0089] 取0. 5ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球（MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除 上清液，用 buffer B 洗涤 2 次；取 40 μ 1 0· ImM AFBl 适配体（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCT CTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3')(超纯水）加入到磁球溶液中，轻微涡旋 混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应〇. 5h，用buffer B洗涤3次。
[0090] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗涤
[0091] 将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)离心， 用buffer A洗涤8次。
[0092] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0093] 将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒 温混匀仪上，室温反应0. 5h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。
[0094] 实施例3适配体生物传感器的合成
[0095] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0096] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0097] 取 500 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)与 2mg sulfo-SMCC 混合，祸旋震荡 5min， 放置恒温混匀仪上，室温反应3h。
[0098] 1 · 1 · 2DNA分子的活化
[0099] 取 120 μ 1 100 μΜ 互补 DNA(thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），3 μ 1 0.1 M buffer Β，3 μ I 30mM TCEP(超纯水）加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混 匀仪上，室温反应2h。
[0100] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0101] 将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分别加入到超滤管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，离心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到I. 5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪 上反应72h。
[0102] I. 2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0103] 1. 2. 1磁球和AFBl适配体的链接
[0104] 取2ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球（MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗涤 2 次；取 80 μ 1 0· ImM AFBl 适配体（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCT GTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3^ )(超纯水）加入到磁球溶液中，轻微涡旋混 匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h，用buffer B洗涤3次。
[0105] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗涤
[0106] 将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)离心， 用buffer A洗涤8次。
[0107] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0108] 将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置 恒温混匀仪上，室温反应2h，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。
[0109] 实验例1适配体生物传感器反应条件的优化
[0110] 1、实验方法
[0111] 1. 1反应温度的优化
[0112] 对应用实施例1开发的适配体生物传感器检测AFBl的实验过程中整个实验温度 进行优化。
[0113] 因为固定DNA-蔗糖酶到磁球上是通过DNA分子杂交完成的，它们之间的亲和力跟 温度有关，从而直接影响AFBl的检测。此外，蔗糖酶的活性与温度也有很大关系。本实验 选择了两个最常用实验温度4°C和25°C，AFBl的浓度为12. 5 μΜ，孵育时间为30min，反应 时间为〇、lh、2h、3h、4h、5h。蔗糖酶水解蔗糖成葡萄糖，然后通过血糖仪定量检测。
[0114] 1.2孵育时间的优化
[0115] 生物传感器与目标分子的孵育时间是非常重要的，直接关系到释放的DNA-蔗糖 酶的量。因此，在AFBl存在的情况下，对DNA-蔗糖酶释放的动力学进行了研究。将含有 AFBl的样品溶液与AFBl的适配体传感器进行混合，在不同浓度下（6. 25、12. 5、25、50、100、 200、400 μΜ的AFBl)，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶在不同的时间里（15、30min)被磁性分 离，然后与蔗糖溶液混合相同的时间（30min)，水解蔗糖成葡萄糖，通过血糖仪定量检测。
[0116] 2、实验结果
[0117] 2. 1反应温度的优化
[0118] 结果如图4所示，当与蔗糖溶液在25°C孵育时，血糖仪的信号值快速增加，基本成 一个稳定的线性关系；当与蔗糖溶液在4°C孵育时，血糖仪的信号值在一个较低的水平，表 明酶的活性很低，被水解的蔗糖的量较少。因此，从实验结果来看蔗糖酶的活性在25°C时 实验效果更好。本发明确定整个实验温度均为25°C。
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