生物传感器检测黄曲霉毒素 Bl具有良好的重 现性。特异性分析结果表明，AFBl适配体传感器除了 AFBl之外不会与其他六种霉菌毒素 (AFMp AFGp AFG2、AFB2、OTA和ZEA)特异性结合，说明本发明适配体传感器在AFBl的检测 中具有良好的特异性。
[0028] 本发明适配体生物传感器检测婴幼儿配方米粉中黄曲霉毒素 B1，结果表明，AFBl 的回收率在84. 7%~118. 7%，表明本发明适配体传感器可用于快速定量检测食品中的 AFBl0
[0029] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0030] 本发明开发了一种适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素 Bl的方 法。本发明适配体生物传感器通过其适配体特异性的识别黄曲霉毒素 B1，释放生物传感器 上结合的蔗糖酶分子到溶液中，蔗糖酶能够高效的水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进 行定量检测。该方法具有操作简便，检出限低，特异性好，重复再现性好等优点，为食品中黄 曲霉毒素 Bl的定量检测提供了一种新方法，具有良好的应用前景。
[0031] 本发明所涉及到的术语宙义
[0032] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0033] 术语"多核苷酸"或"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷 酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生 的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包 括PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并 密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以 上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简 并密码子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))〇
[0034] 术语"适配体"意指一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列（RNA或DNA)，与相 应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力，大小一般约6-40kDa。
【附图说明】
[0035] 图1为基于适配体特异性识别目标分子的便携式生物传感器结合血糖仪检测 AFBl的原理图；
[0036] 图2为血糖仪检测缓冲液中AFBl以及血糖仪信号值与AFBl浓度的线性关系；
[0037] 图3为血糖仪检测不同类型的霉菌毒素；其中，对照组：没有霉菌毒素；MIXl组： AFMp AFGp AFG2、AFB2、OTA 和 ZEA ;MIX2 组：AFMp AFGn AFG2、AFB1、AFB2、OTA 和 ZEA ;
[0038] 图4为血糖仪检测不同温度下缓冲液中蔗糖酶的活性；
[0039] 图5为血糖仪检测不同孵育时间下缓冲液中的AFBl。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0041] 1、材料与仪器
[0042] Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)、Invertase (鹿糖酶）、 Tween-20 (吐温-20)、Sucrose (鹿糖），来自 Sigma 公司；Amicon-3K、Amicon_100K，来自 Millipore 公司；sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxyl ate (sulfo-SMCC)，来自Thermofisher公司；链霉亲和素修饰的磁球（直径1 μπι)、磁分离 器，来自Bangs Laboratories, Inc.公司；黄曲霉毒素 BI (AFBl)标准品，来自国家标准物质 中心；血糖仪及试纸条，来自罗氏ACCU-CHEK Avia;超纯水，来自Millipore Advantage AlO 纯水系统；恒温混勾仪，来自爱本德Thermomixer comfort型号；基因漩祸混勾器，来自IKA 品牌；落地高速冷冻离心机，来自HITACHI CR22G111型号；移液枪；微型离心机；水浴氮吹 仪；AFBl适配体和互补DNA，生工生物工程（上海）有限公司合成，（AFBl适配体和互补DNA 的修饰：对AFBl适配体3'端进行生物素修饰，互补DNA的3'端进行巯基修饰，采用高效 液相色谱法进行纯化）。
[0043] 缓冲液A :0.1 M氯化钠，0.1 M磷酸钠 ，pH = 7. 3 ;
[0044] 缓冲液B :0· IM氯化钠，0· IM磷酸钠 ，pH = 7. 3,0· 05% (质量比）吐温-20。
[0045] 2M蔗糖溶液用缓冲液A进行溶解，保存在4°C。
[0046] 实施例1适配体生物传感器的合成以及结合血糖仪检测黄曲霉毒素 Bl
[0047] 1、实验方法
[0048] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0049] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0050] 取 400 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)与 Img sulfo-SMCC 混合，祸旋震荡 5min， 放置恒温混匀仪上，室温反应2h。
[0051] I. I. 2DNA分子的活化
[0052] 取 100 μ 1 100 μΜ 互补 DNA(thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），2 μ 1 0.1 M buffer Β，2 μ I 30mM TCEP(超纯水）加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混 匀仪上，室温反应Ih (其中，①互补DNA的处理：将合成的固体DNA (4°C，12000rcf，5min)离 心，按要求加入345 μ 1超纯水，轻微涡旋混匀，得到345 μ I 100 μ M的DNA溶液；②TCEP的 配制：TCEP分子量286. 65,称量8. 59mg，溶于Iml的超纯水，得到Iml 30mM TCEP溶液）。
[0053] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0054] 将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分别加入到超滤管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，离心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪 上反应48h。
[0055] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0056] I. 2. 1磁球和AFBl适配体的链接
[0057] 取Iml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球（MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗涤 2 次；取 60 μ I (λ ImM AFBl 适配体（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCT GTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3^ )(超纯水）加入到磁球溶液中，轻微涡旋混 匀，放置恒温混匀仪上，室温反应lh，用buffer B洗涤3次。
[0058] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗涤
[0059] 将 48h 反应后的 DNA-蔗糖酶用超过滤器 Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)离 心，用buffer A洗涤8次。
[0060] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0061 ] 将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀， 放置恒温混匀仪上，室温反应lh，用buffer B洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖 酶聚合物（Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。将合成的 Invertase-DNA-apt-MBs均勾分散在Iml buffer B中，每份取60 μ 1用于下一步的检测。
[0062] 1. 3适配体生物传感器结合血糖仪检测缓冲液中的AFBl
[0063] 取 20μ1 不同浓度（0、0· 25、2、6· 25、12· 5、25、50、100、200、400 μΜ)的 AFBl (buffer Β)溶液加入到一份Invertase-DNA-apt-MBs溶液中（用磁分离器去除 buffer)，轻微祸旋混勾，充分反应30min((MBs的浓度约3mg/ml);将上述反应后的MBs溶 液，用磁分离器分离，吸取10 μ 1上清液，加入到5 μ 12M Sucrose (buffer B)离心管中，涡 旋混匀，室温（25°C )反应30min ;取5 μ 1反应后溶液用血糖仪检测。
[0064] 1. 4特异性分析
[0065] 为了评价所开发的适配体生物传感器的选择性，实验选择了一个对照组和6种霉 菌毒素（AFMpAFBrAFGpAFG 2WTA and ΖΕΑ)以及MIXl组和ΜΙΧ2组进行了检测，其中，MIXl 组：AFMn AFGn AFG2、AFB2、OTA 和 ZEA ;MIX2 组：AFMp AFG0 AFG2、AFB1、AFB2、OTA 和 ZEA ;所 有实验的霉菌毒素浓度为lppm。检测步骤与上述缓冲液中AFBl的检测步骤相同。
[0066] 1. 5数据分析
[0067] 实验数据采用Excel进行标准化处理，图表采用Adobe Illustrator CS5和 0rigin8. 0进行作图分析。
[0068] 2、实验结果
[0069] 2. 1适配体生物传感器检测原理
[0070] 便携式生物传感器检测AFBl的原理如图1所示。
[0071] 链霉亲和素包被的磁球与