莲藕淀粉合成相关酶基因hxk功能分子标记引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及莲藕淀粉合成相关酶基因 H)(K(己糖激酶， HXKase)功能分子标记引物及应用。
【背景技术】
[0002] 莲藕是多年生水生草本植物，是具有许多单子叶植物特征的最古老的双子叶植物 之一，中国是原产地之一，在中国南方普遍种植。莲产品包括鲜藕、藕粉、藕带和莲籽，是公 认的滋补食品，含丰富的淀粉、蛋白质、多种维生素和矿物质，是特色蔬菜和副食佳品，具有 很高的营养保健功能，深受消费者喜爱。随着中国加入WT0,莲藕加工产品盐渍藕、水煮藕及 藕粉等远销日本、韩国及欧、美等国家和地区，莲藕已成为中国重要的出口创汇特色蔬菜之 〇
[0003] 不同的莲藕产品对莲藕品质的要求不一样，藕莲按淀粉含量和种类可以分为粉藕 和脆藕两类不同质地的品种，粉藕品种的藕身硬度、纤维素含量、淀粉含量等都比脆藕品种 高，但水分含量比脆藕品种低；鲜粉藕品种中，直链淀粉含量、支链淀粉含量及支直比均比 脆藕高，口感粉糯。粉藕品种适合于煨汤，脆藕品种适合于炒藕片。影响莲藕加工和蒸煮品 质的主要因素是以淀粉为主的碳水化合物和淀粉中直链淀粉、支链淀粉含量。
[0004] 目前国内外对莲藕地下茎碳水化合物代谢的研究，仅见莲藕膨大过程中和田间越 冬过程中淀粉等主要碳水化合物的含量变化，及成熟期地下茎淀粉粒形态和淀粉糊化特性 的报道；而对于地下茎中淀粉的积累与淀粉合成相关酶活性的关系研究较少。所以开发一 种依据基因型选择不同淀粉含量的莲藕品系的技术，可以有效的鉴别粉藕和脆藕，具有重 要的育种利用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种莲藕淀粉合成酶相关基因 H)(K功能分子标记引物， 其为：HXKFl :TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKRl :GCACGAACTCTTGGCAATC。该引物可用于鉴别莲 藕中的支、直链淀粉含量。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种莲藕淀粉合成酶相关基因 H)(K功能分子标 记引物的应用，该应用包括鉴定不同直链淀粉含量的莲藕品系，莲藕的早期育种筛选。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
[0008] 本发明发现HXK等位基因中第一个引物扩增序列存在差异，将该功能分子标记命 名为FMHXK-1。一种莲藕淀粉相关基因 HXK功能分子标记FMHXK-1，其序列如SEQ ID NO. 1 和图1所示。基于该分子标记设计的引物如下：
[0009] -种莲藕淀粉相关基因 H)(K功能分子标记引物，其为：
[0010] HXKFl ：TCTAAATCCCAATCCGTCC,
[0011] HXKRl :GCACGAACTCTTGGCAATC。
[0012] -种莲藕淀粉相关基因 HXK功能分子标记或分子标记引物的应用，包括莲藕淀粉 含量的测定，莲藕的育种筛选（如在幼苗阶段筛选）。
[0013] 所述的应用通过以下方式实现：利用引物HXKFl :TCTAAATCCCAATCCGTCC，HXKRl : GCACGAACTCTTGGCAATC对莲藕DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电 泳结果为320bp的A条带和/或308bp的a条带，根据A条带的有无来确定莲藕淀粉的含 量。将扩增的A和a两条带进行测序，部分序列的比对如图2所示。
[0014] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0015] (1)本发明所用引物少、且效率高，可以加快育种速度、降低育种成本；并具有操 作简单、成本低廉、周期短的优点，适于推广应用，为莲藕种质资源鉴定和莲藕育种选择提 供了一种快捷的方法，具有很高的应用价值。
[0016] (2)本发明所用引物直接开发于H)(K基因上，基因序列的长度差异直接对应于品 种的表型差异，具有直接指示作用，可靠性更高。
【附图说明】
[0017] 图1是莲藕淀粉相关基因 HXK功能分子标记FMHXK-I的序列及引物HXKFl和HXKRl 的设计位点图，其中黑色加粗斜体为引物序列。
[0018] 图2是引物HXKFl和HXKRl扩增条带A和a的部分序列比对图。
[0019] 图3是引物HXKFl和HXKRl对实施例1中45个莲藕品系DNA扩增的PCR产物条 带。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常 规生化试剂商店购买得到的。
[0021] 实施例1莲藕淀粉合成酶相关基因 H)(K功能分子标记引物的获得
[0022] (1)取45份成熟莲藕样品，测定莲藕（莲地下茎）的支链淀粉占干物质百分含量、 直链淀粉占干物质百分含量、总淀粉占干物质百分含量；支链淀粉占总淀粉百分含量、直链 淀粉占总淀粉百分含量。测定结果见表1。
[0023] 表1莲藕样品的淀粉含量及PCR扩增条带结果
[0024]
[0026] (2)在NCBI中找出莲藕淀粉合成酶相关基因 HXK(己糖激酶）的DNA序列，然后使 用软件DNAMN设计引物，下表2列出所设计引物中的17对引物。
[0027] 表2 17对引物的序列
[0030] (3)取步骤（1)中的45份莲样品的嫩叶干燥脱水后，采用天根生化科技（北京） 有限公司的Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取莲总DNA。具体如下：
[0031] ①取30mg干燥的叶片，打磨成粉末。
[0032] ②将粉末迅速转移到装有700 μ L 65°C预热缓冲液GPl的离心管中，迅速颠倒混 匀后，将离心管放在65°C水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
[0033] ③加入700 μ L氯仿，充分混勾，12000rpm离心5min。
[0034] ④小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μ L缓冲液 GP2,充分混匀。
[0035] ⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。
[0036] ⑥向吸附柱CB3中加入500 μ L缓冲液⑶，12000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。
[0037] ⑦向吸附柱CB3中加入600 μ L缓冲液PW，12000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。
[0038] ⑧重复操作步骤⑦。
[0039] ⑨将吸附柱CB3放入收集管中，12000rmp离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置 于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。
[0040] ⑩将吸附柱CB3转入一个干净的