栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种栽培花生SSR分子标记引物 组及其在品种鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 花生（Arachis hypogaea L.)又名落花生，栽培花生是包含来自于不同野生种A 和B两个基因组的异源四倍体作物，是我国重要的经济作物和油料作物之一。
[0003] 近年来，我国花生新品种数量急剧增加，每年参加国家、各省市区试的品种数百 个，每年审（认）定的品种达到二十个以上。同时高频率的使用少数骨干亲本使品种的遗 传基础趋于狭窄，从而加大了利用外观表型性状区别不同花生品种的难度。随着分子生物 学技术的不断发展，DNA分子标记技术为栽培花生品种鉴定提供了新的途径。AFLP、RFLP、 RAPD、SSR、SCoT等分子标记均被应用于花生品种鉴定，而SSR分子标记较其他标记具有共 显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点，可高效准确的应用于栽培花生品种鉴定。
[0004] 目前常用的栽培花生品种鉴定方法主要有：1、表型性状鉴定法：该方法通过不同 品种间表型性状差异对不同品种进行鉴定，虽然比较直观、快捷，但对表型性状相近的品种 则无法鉴定；2、DNA分子标记法：该方法利用各类DNA分子标记在基因水平上对不同品种进 行鉴定，其中SSR分子标记因其具有共显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点而应用 最为普遍，但目前已公布的花生SSR分子标记数达到了 15518,但只有13. 5% -14. 5%的分 子标记在栽培花生中具有多态性，盲目的使用SSR分子标记对栽培花生品种进行鉴定不仅 费时费力，也难以得到准确的鉴定结果。
[0005] 本发明是基于SSR分子标记鉴定法建立的，利用均匀分布在栽培花生染色体组、 多态性好、PCR扩增稳定的20对SSR引物组成的一套引物对不同栽培花生品种进行鉴定的 技术体系。该技术体系能够快速、准确的对不同栽培花生品种进行鉴定。
【发明内容】
[0006] 利用SSR分子标记法直接对花生遗传物质DNA进行分析，相对于表型性状更加准 确。但之前报道的一些SSR分子标记鉴定方法由于使用的引物在花生染色体组上分布不均 匀以及数量较少，难以区分一些遗传背景比较相近的花生品种。本发明利用筛选到的均匀 分布在花生染色体组上的20对SSR分子标记引物组对不同栽培花生品种进行鉴定，能够对 鉴定品种进行准确区分。
[0007] 本发明的目的在于提供一套栽培花生SSR分子标记引物组，以及在于利用上述 SSR分子标记引物组鉴别栽培花生品种的方法。
[0008] 为实现上述目的，具体方案如下：
[0009] 本发明的栽培花生SSR分子标记引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo. 1-40 所示引物。
[0010] 利用上述SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，包括如下步骤：
[0011] (1)提取待鉴定栽培花生样品基因组DNA ;
[0012] (2)采用如序列表SEQ ID No. 1-40所示引物进行SSR-PCR扩增；
[0013] (3)将步骤（2)的扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测；
[0014] (4)根据特异性图谱进行栽培花生品种的鉴定。
[0015] 所述步骤⑵中的SSR-PCR扩增体系为10 μ L，其中DNA模板10ng，正、反向引物 各 0.4ymol/L，dNTPs O.25mmol/L，1XPCR 缓冲液（包含 MgCl21.5mmol/L)，Taq 酶 0· 1 单 位。
[0016] 所述步骤（2)中的SSR-PCR扩增程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，57°C退 火30s，72°C延伸30s，共33个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0017] 所述步骤（4)的鉴定方法为：如果两品种间差异位点数多2则判定两品种为不同 品种。
[0018] 本方法利用一套由20对均匀分布在花生基因组不同连锁群上的SSR分子标记引 物对鉴定品种的遗传信息进行分析，与现在广泛使用的表型鉴定方法和之前报道的分子鉴 定方法相比更加准确。而且本方法仅采用普通引物进行扩增并用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行检测，相比基于荧光标记引物的毛细管电泳检测方法，本方法更加经济。
【具体实施方式】
[0019] 为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说 明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 实施例1 :
[0021] 1.鉴定材料DNA提取
[0022] 参照Charters的CTAB法，具体操作步骤如下：
[0023] 1)选取待检测花生幼嫩、无病虫害叶片4-6片，用蒸馏水清洗干净，纱布吸干，放 置-80 °C冷冻保存。
[0024] 2)将冷冻的叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，在保持叶片冷冻的条件下快 速将叶片研磨成粉末，将粉末转入2ml离心管中。
[0025] 3)迅速向上述转入叶片粉末的离心管中加入65°C预热的CTAB提取液700 μ L， 65°C水浴lh，每15min摇勾一次。
[0026] 4)加入酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)700 μ L，上下颠倒混匀，4°C条件下12000转离 心lOmin，吸取上清液转入I. 5ml离心管中。
[0027] 5)加入预冷的异丙醇500 yL，混匀后4°C静置30min，4°C条件下12000转离心 lOmin，去掉上清液。
[0028] 6)加入预冷的70%乙醇洗涤两遍，短暂离心后去除上清液，室温干燥至没有乙醇 气味；
[0029] 7)加入200 μ L灭菌去离子水或TE溶液，用1 %琼脂糖电泳检测DNA分子量大小， 利用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，并稀释到IOng/ μ L，4°C保存待用。
[0030] 2.鉴定材料DNA的SSR-PCR扩增
[0031 ] 利用本方法给出的20对引物对待鉴定材料DNA进行PCR扩增，反应体系及程序如 下：
[0032] 1)反应体系：10 μ L体系包括鉴定材料DNA模板10ng，正、反向引物各0.4 μ mol/ L，dNTP 0· 25mmol/L，I XPCR 缓冲液（包含 MgCl2L 5mmol/L)，Taq 酶 0· 1 单位。
[0033] 2)反应程序：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 33 个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0034] 3.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测
[0035] 以使用JY-CX2A型测序电泳槽为例，操作步骤如下：
[0036] 1)清洗玻璃板：用自来水将玻璃板清洗干净后用去离子水冲洗后晾干，再用无水 乙醇擦洗两遍后吸水纸擦干。在长玻璃板上涂上〇. 5mL亲和硅烷工作液，带凹槽短玻璃板 上涂上0. 5mL剥离硅烷工作液，室温静置20min晾干并防止两块玻璃板相互污染。
[0037] 2)组装玻璃板：待玻璃板完全干燥后在长玻璃板涂抹亲和硅烷两侧各放置一条 0. 4mm厚垫片，将短玻璃板涂抹剥尚硅烷一面与长玻璃板相对扣在长剥尚板上，两玻璃板以 垫片隔开。
[0038] 3)制胶：在50mL 6. 0%的丙烯酰胺胶溶液中加入新配制的10%过硫酸铵溶液 500 μ L，TEMED 50 μ L，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0. 4_厚鲨鱼齿梳子平 齐端向内轻轻插入胶液0. 3-0. 4cm，灌胶过程中应防止出现气泡。胶板静置Ih使胶液完全 聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子。
[0039] 4)预电泳：将胶板安装在电泳槽上，向上槽中加入预热至60°C的0. 5 X TBE缓冲 液，使其超过凝胶顶部约2cm，向下槽加入0. 5XTBE缓冲液，使其超过胶板地步约2cm，在 70W恒功率下，预电泳20mi