靶向性沉默ID1的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及分子生物学与生物医药
技术领域：
，主要涉及一种靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法。【
背景技术：
】[0002]RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是一种在进化上保守的基因防御机制，即一种序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。近年来，RNAi技术作为一种新基因疗法，已被广泛应用于疾病的基因治疗研究领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎等。相比其它治疗手段，RNAi技术对致病基因的靶向性更强，毒副作用更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。[0003]细胞分化抑制因子（inhibitorofDNAbindingordifferentiation)，简称ID蛋白，属于螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix)转录因子家族成员之一，该家族是调控细胞增殖和分化的重要因子。IDl是ID蛋白的一个重要亚型，具有ID类蛋白的典型功能。IDl不仅参与正常细胞的生长发育，也与肿瘤的发生、发展、侵袭、肿瘤血管生成有密切关系。近期研究发现，IDl在宫颈癌细胞等恶性肿瘤中表达明显上调，其上调程度与肿瘤恶性程度相关。宫颈癌（cervicalcancer)是指源发于子宫颈及宫颈周围组织的恶性肿瘤，肿瘤组织可直接或通过淋巴转移，常见病理类型有鳞状细胞癌，腺癌等。在我国，每年约有13.15万新发病例，其发病率有明显增高和年轻化趋势，且腺癌比例增加。IDl的高表达与肿瘤侵袭相关性已得到证实，IDl可能成为提示肿瘤预后的有效因子。[0004]因此，以宫颈癌细胞Hela为例，研究通过RNA干扰技术沉默IDl基因，将shIDl作为基因治疗手段，研究shIDl在宫颈癌等肿瘤疾病的基因治疗领域的应用，具有很大的意义。但是，目前现有技术中尚未有此类研究。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，旨在通过抑制IDl基因的表达，抑制宫颈癌细胞等恶性肿瘤的增殖。[0006]本发明的技术方案如下：[0007]-种靶向性沉默IDl的shRNA序列，其中，包含针对人IDl基因（GeneID:3397)设计的siRNA，其对应的靶位点序列为：5'-CCTACTAGTCACCAGAGACTT-3'。[0008]-种用于制备如上所述的shRNA序列的引物，其中，引物序列如下：[0009]上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3，；[0010]下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3,。[0011]-种ShRNA慢病毒载体，其中，所述ShRNA慢病毒载体用于表达如上所述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒载体包含沉默目的基因IDl的靶位点序列5'-CCTACTAGTCACCAGAGACTT-3'。[0012]所述的shRNA慢病毒载体，其中，所述shRNA慢病毒载体中包含采用以下引物退火合成得到的IDl序列；引物序列如下：[0013]上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3，；[0014]下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3,。[0015]-种如上所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，包括以下步骤：[0016]采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列shIDl-Pl:5'-ACCGCCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3'；下游引物序列shIDl-P2:5'-AAAACCTACTAGTCACCAGAGACTTCTCGAGAAGTCTCTGGTGACTAGTAGG-3'；[0017]将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上；[0018]转入大肠杆菌感受态细胞stable3,涂LB-Amp平板培养过夜，随机挑取一个单克隆进行测序验证，构建得到用于表达靶向性沉默IDl的shRNA序列的shRNA慢病毒载体。[0019]所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，将合成的shRNA序列连接到shRNA慢病毒载体上的过程包括以下步骤：[0020]以pCDFl-MCS2-EFl-copGFP载体为模板，PCR扩增得到EFl-copGFP片段，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，然后插入到同样经过MluI和AfeI双酶切的慢病毒载体pLVX-Puro上，得到载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro;[0021]用ClaI和XhoI双酶切载体骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去磷酸后进行电泳回收；设计引物扩增启动子U6,将扩增后的启动子U6与酶切回收后的pLVX-EFl-copGFP-Puro载体连接；[0022]PCR扩增大肠杆菌ccdB致死基因，用XhoI和MluI双酶切后，与经过XhoI和MluI双酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体连接，得到用于表达IDl的shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro;[0023]用BsmBI单酶切shRNA慢病毒载体pLVX-U6-ccdB-EFl-copGFP-PGK-Puro,得到pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro载体骨架；将退火合成的shIDl片段与PLVX-U6-EFI-copGFP-PGK-Pur〇载体骨架通过相应的酶切位点连接。[0024]进一步地，用于扩增EFl-copGFP的寡核苷酸引物为EFl-copGFP-F:5'-CGACGCGTCGAAGGATCTGCGATCGCTCCG-3'；EFl-copGFP-R:5'-AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG-3'。[0025]进一步地，所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其中，用于扩增U6启动子的寡核苷酸引物为U6-Clal-F:5'-CCATCGATGGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'，U6-XhoI-R:5'-CCGCTCGAGCGGTCGTCCTTTCCACAA-3'。[0026]一种如上所述的靶向性沉默IDl的shRNA序列的应用，其中，所述shRNA序列用于制备抑制IDl基因表达的生物制剂。[0027]所述的靶向性沉默IDl的shRNA序列的应用，其中，所述shRNA序列用于制备治疗宫颈癌等恶性肿瘤的药物。[0028]有益效果：本发明针对IDl设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒沉默载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著沉默IDl的表达。鉴于IDl作为一种潜在的肿瘤疾病治疗靶点，因此本发明提供的shIDl及其相关生物试剂，可用于研究和制备治疗宫颈癌等恶性肿瘤的相关药物。本发明证实抑制IDl基因表达可抑制宫颈癌细胞(Hela)的异常增殖和迀移，证明IDl是一种潜在的治疗肿瘤疾病的新型靶点，有利于进一步研究宫颈癌等肿瘤疾病的药物及应用。【附图说明】[0029]图1为本发明实施例3中shIDl对Hela中IDl基因的沉默效果图。[0030]图2A~2B为本发明实施例4的结果图，显示shIDl能显著抑制Hela的细胞增殖。其中，图2A是荧光显微镜下观察Hela细胞增殖的结果图，图2B为根据荧光显微镜观察结果，对细胞计数后分析增殖的检测结果图。[0031]图3为本发明实施例5的结果图，显示shIDl能显著抑制Hela的细胞迀移。图中显示了在细胞划痕实验后，对细胞进行饥饿培养0h，24h和48h后的显微镜下观察的结果图。【具体实施方式】[0032]本发明提供一种靶向性沉默IDl的shRNA序列、引物、应用、shRNA慢病毒载体及构建方法，及其作为肿瘤增殖抑制剂的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0033]本发明公开了一种靶向性沉默IDl的shRNA序列，及其相应shRNA双链的引物、shRNA慢病毒载体及其构建方法。所述shIDl慢病毒表达载体经过慢当前第1页1 2 3