吡唑并嘧啶酮激酶抑制剂的制作方法

专利名称：：吡唑并嘧啶酮激酶抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明提供新型吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，具体地，提供l-(吡啶-4-基)-吡唑并[3，4_d]嘧啶-4-酮的衍生物。该化合物为激酶抑制剂，其对细胞(包括对肿瘤细胞)展示出乎意料的抗增殖活性且在异种移植肿瘤模型中展示抗肿瘤活性。该化合物或其合适盐或前药适用于治疗患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体。
背景技术：
：激酶是执行诸如调控细胞分裂及增殖的基本细胞功能的重要细胞酶，且似乎在许多疾病状态中发挥决定性作用，诸如在以细胞不受控制地增殖及分化为特征的疾病状态。这些疾病状态涵盖多种细胞类型及疾病，诸如癌症、动脉粥样硬化、再狭窄及其他增殖性病症。生物学中最重要且基本的过程之一为细胞周期介导的细胞分裂。该过程确保受控地产生具有确定生物功能的细胞后代。其为受到高度调控的现象且响应于细胞内与来自外部源的一组复杂细胞信号而发生。肿瘤促进及抑制基因产物的复杂网状结构为此细胞信号传输过程的关键组分。肿瘤促进组分过度表达或肿瘤抑制产物随后损失将导致不受调控的细胞增殖及肿瘤产生(Pardee,Science246:603-608,1989)。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-d印endentkinase,CDK)在调控细胞周期机制中发挥关键作用。其为由以下两个组分组成的复合物催化亚单元(激酶)及调控亚单元(细胞周期蛋白)。迄今，在人类中已鉴别出13种激酶亚单元(细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1-13)以及数种调控亚单元，包括细胞周期蛋白(Cyc)A-H、K、L、N及T及CDK5、p35及其他蛋白质。各激酶亚单元可与一个或数个调控亚单元配偶体形成对，且在各情况下，该对构成活性催化部分。细胞周期的每次转换由特定细胞周期蛋白依赖性激酶复合物调控G1/S由CDK2/CycE、CDK4/CycD及CDK6/CycD调控；S/G2由CDK2/CycA及CDKl/CycA调控；G2/M由CDKl/CycB调控(关于综述，参见Sh即iro，T.Clin.Oncol.24:170及其后页，2006)。这些激酶复合物的协同活性引导个体细胞完成复制过程且确保各后代的生命力(Sherr，￡^1173:1059-1065,1993;Draetta，TrendsBiochem.Sci.15:378-382，1990)。虽然破坏小鼠生殖系中编码所有3种D型细胞周期蛋白、两种E型细胞周期蛋白、细胞周期蛋白D依赖性CDK4及CDK6或细胞周期蛋白E依赖性CDK2的基因的实验展示，这些基因无一对细胞周期进程而言为绝对必要的(综述于Sherr及Roberts,Genes&Develo咖ent18:2699-2711，2004中)，但越来越多的证据展示肿瘤发展与细胞周期蛋白依赖性激酶相关机能障碍之间的联系。细胞周期蛋白调控蛋白的过度表达及随后激酶活性过度与数种类型的癌症相关联(SherrC.T.,Science274:1672-1677，1996;Jiang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:9026-9030，1993;Wang，Nature343:555-557，1990)。实际上，人类肿瘤发展通常与CDK蛋白质本身或其调控物的改变相关(Cordon-CardoC.,Am.T.Pathol.147:545_560，1995;KarpJ.E.及BroderS.,Nat.Med.1:309-320,1995;HallM.等人，Adv.CancerRes.68:67-108,1996)。已发现细胞周期蛋白依赖性激酶的内源性高特异性蛋白质抑制剂对细胞增殖具有重大影响(KambA.，Curr.T肌4Microbiol.Immunol.227:139-148，1998;Kamb等人，Science264:436-440，1994;Beach，Nature336:701-704，1993)。这些抑制剂包括pl6INK4(CDK4/CycDl的抑制剂)、p21CIPl(通用CDK抑制剂)及p27KIPl(特异性CDK2/CycE抑制剂)。与CDK2/CycA结合的p27的晶体结构公开这些蛋白质如何藉由与细胞周期蛋白依赖性激酶复合物多重相互作用而有效抑制激酶活性(Pavletich,Nature382:325-331,1996)。这些蛋白质抑制剂藉由与其相应细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的特定相互作用而帮助调控细胞周期。缺乏这些抑制剂的细胞倾向于不受调控地生长及形成肿瘤。除了细胞周期进程核心过程中主要涉及的CDK(CDK1、2、4及6)之夕卜，其他CDK也负责调控细胞周期进程过程中的基因表达过程。具体地，已知CDK7及CDK9使RNA聚合酶1I的C-末端域磷酸化且因此驱动抗细胞凋亡蛋白质、D型细胞周期蛋白及促血管生成因子(如低氧诱导的VEGF)的表达。因此，这些所谓的调控CDK也是治疗介入的具有吸引力的靶(参见Sh即iro，T.Clin.Oncol.24:1770及其后页，2006)。归因于药理学CDK抑制与细胞周期调控之间的明确关系，前不久已鉴别出CDK抑制剂在肿瘤学中的潜在用途，且已鉴别许多归属于不同结构种类的小分子抑制剂(例如星形包菌素类(staurosporins)、黄酮类(例如夫拉平度(flavopiridol)(参见Shapiro，■T.Clin.Oncol.24:170及其后页，2006))、嘌呤类(例如purvalanol、roscovitine(参见Bach等人，.T.Biol.Chem.280:31208及其后页，1995))、妣啶并[2，3_d]嘧啶酮类、羟喷哚类、paullones、茚并妣唑类(indenopyrazole)、苯胺基喹唑啉类、氨基噻唑类或二芳基脲类，且现在第一批分子正经受临床评估(关于综述，参见Sausville，TrendsMo1.Med.8:S32-S37，2002;Huwe等人，AngewChemIntEdEngl.42:2122-38,2003;Fischer，CellCycle3:742-6,2004;Fischer及Gianella-Borradori，Ex。ertO。inInvestigDrugs14:457-77,2005)。基于目前对CDK1、2、4及6的生物化学作用的了解，可预期经这些酶的抑制剂处理的细胞会生长停滞。CDK4/CycD和/或CDK6/CycD的直接抑制将使细胞在Gl中停滞(Baughn等人，CancerRes.66:7661-7，2006)。此外，藉由抑制CDK活化激酶CDK7和/或CDK9来下调相应细胞周期蛋白配偶体，进而间接抑制CDK1及CDK4也将使细胞在Gl中停滞(Whittaker等人，CancerRes.2004，64，262-72;Mateyak等人，MolCellBiol.1999，19,4672-83)。原则上，CDK2活性的抑制应使得细胞在Gl中停滞，然而，在结肠癌细胞中已遗传性展示该阻断可由CDK4活性规避(Tetsu&McCormick，CancerCell3:233-45，2003)。CDKl/CycB的抑制将藉由抑制分裂后期促进复合物的组分磷酸化来阻断从有丝分裂退出(Golan等人，JBiolChem.277:15552-7，2002;Listovsky等人，ExpCellRes.255:184-91，2000)，且其还可藉由抑制生存素(Survivin)的磷酸化使得细胞凋亡(0'Connor等人，ProcNatlAcadSciUSA.97:13103-7，2000)。根据以上考虑因素，将预期具有有效且平衡的CDK抑制活性、尤其对抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7及CDK9的活性的分子为开发癌症或其他增殖性疾病的疗法中的细胞抑制/细胞毒性药物的有前途的候选物(DePinto等人，Mol.CancerTher.5:2644-58，2006;Joshi等人，Mol.CancerTher.6:918-25，2007)。然而，虽然例如如体外生物化学激酶抑制检测所测定的CDK抑制活性为研究中耙物及先导鉴别极重要的参数，但成功开发供治疗应用的药物最终将视许多其他因素而定，诸如体外ADMET概况(包括溶解度及渗透性)、细胞生物学研究(包括疾病相关细胞系的细胞抑制)、药代动力学(包括生物利用度)及药效学研究(最重要地包括疾病相关动物模型中的活性)及毒理学概况。已知某些以特定方式被取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶具有药理学上有效的性质。尤其已知吡唑并[3，4_d]嘧啶-4-酮的某些衍生物具有抗增殖活性(参见Rossi等人，Commit.AidedMol.Des.19:111-22,2005;Markwalder等人，T.Med.Chem.47:5894-911，2004)。PCT公开WO00/021926广泛公开一类吡唑并[3，4_d]嘧啶-4-酮，包括表示某些l-苯基-及l-吡啶基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的通用结构。然而，未公开特定l-吡啶基取代化合物或描述其合成，且未展示数据来指示这些化合物在例如CDK酶促检测中是否将展现抑制性质。因此，不存在选择供产生药学上有效的化合物的吡啶取代基的具体教导，且实际上没有证明1-吡啶基形式将与实际上合成的化合物一样有效或将在所公开的用途中完全有效。尤其不存在如下所公开的特定化合物l-(3，5-二氯吡啶-4-基)-6-(3-羟基-4-N-吡咯烷甲基-苯基)甲基-3-异丙基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(化合物I)的教导。PCT公开W003/033499具体公开某些l-苯基-3-异丙基-6-芳基甲基-妣唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，展示其抑制细胞周期蛋白依赖性激酶且在肿瘤模型中具有某些活性(还参见WO2004/092139;WO2005/063765;还参见Caligiuri等人，ChemBiol.12:1103-15,2005)。然而，应注意，这些申请未具体公开、一般性主张或提出任何相应1-吡啶基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的功用。W02004/092139及W02005/063765两者均公开l-(2，6-二氯苯基)-6-(3-羟基-4-吡咯烷甲基-苯基)甲基-3-异丙基-吡唑并[3，4-d]嘧啶_4-酮(P)(P)展示其在体外生物化学激酶抑制检测中具有抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7及CDK9的平衡的CDK抑制活性。然而，该化合物在溶解度、渗透性方面且尤其在裸小鼠的异种移植肿瘤模型中并不具有令人满意的性质，以致无法合理预期用于癌症治疗的临床前或临床的进一步开发。因此，虽然已取得进步，但继续搜寻在体外生物化学激酶抑制检测中具有抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7及CDK9的平衡CDK抑制活性的低分子量激酶抑制剂化合物，其在异种移植肿瘤模型中展示有效活性且其适用于治疗癌症。另外，这些化合物可适用于治疗多种疾病，包括癌症、肿瘤及其他增殖性病症或疾病，包括再狭窄、血管生成、糖尿病性视网膜6病、银屑病、手术粘连、黄斑退化及动脉粥样硬化。因此，对提供具有激酶抑制剂活性或抗诸如肿瘤细胞等细胞的抗增殖活性的组合物、医药和/或药物存在强烈需要。这些组合物、医药和/或药物可能不仅具有这些活性，而且与其他激酶抑制剂或抗增殖剂相比，可能产生可容许、可接受或减少的副作用。此外，响应于这些组合物、医药和/或药物的治疗的肿瘤类型或其他疾病的范围可能为广泛的。这些组合物、医药和/或药物的活性成分可适用于以单一药剂和/或以与其他治疗剂、放射疗法、手术/外科程序、热疗法或所提及的适应症中已知的任何其他治疗结合的组合疗法治疗所提及的适应症。发明概述本发明人已发明新型吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，具体是l-(妣啶-4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的衍生物，其具有有效且平衡的CDK抑制活性，尤其抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7及CDK9的活性；抗肿瘤细胞的抗增殖活性；良好的药代动力学及药效学性质，包括高溶解度、渗透性及经口生物利用度，且在裸小鼠的异种移植肿瘤模型中(包括在使用A2780肿瘤细胞的模型中)令人惊讶地展现有效的抗增殖活性。基于针对所建立的癌细胞系的测试及体内异种移植癌症模型，该化合物展示作为与CDK失控或细胞增殖相关的疾病(诸如癌症或其他增殖性病症或疾病)的有效疗法的前景。基于下文详述的比较测试，本发明的化合物适于治疗患有一种或多种癌症形式的个体或适于治疗患有多种其他增殖性病症及疾病中的一种或多种的个体。本发明的多个方面涉及主题化合物l-(3，5-二氯吡啶-4-基)-6-(3-羟基-4-吡咯烷基甲基-苯基)甲基-3-异丙基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，其具有由下文所展示的式(I)表示的结构或具有其任何互变异构形式的结构。该主题化合物可任选地以包括药学上可接受的盐的盐形式形成或使用。该主题化合物适合用作对细胞(包括对肿瘤细胞)展示抗增殖活性且在异种移植肿瘤模型中展示抗肿瘤活性的CDK抑制剂，和/或适用于治疗患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体。在一方面，本发明涉及药物组合物，其包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体及一定量(诸如治疗有效量)的例如改善癌症或其他增殖性病症或疾病的效应的该主题化合物。本发明的另一方面涉及包装医药产品，其包括包含诸如上述主题化合物的药物组合物，及指示所述药物组合物可用于施用于患有癌症或另一增殖性病症或疾病的患者的说明书。在另一方面，本发明涉及包括向个体、细胞、组织、器官或生物体施用或使之接触一定量(包括治疗有效量)的本文中所公开的主题化合物或药物组合物的方法。这些方法包括但不限于杀死细胞(包括肿瘤细胞)或抑制细胞(包括肿瘤细胞)的增殖或生长；治疗患有与本文中所公开的一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性相关的病症的个体；治疗患有癌症的个体；或治疗患有另一增殖性病症或疾病的个体。在另一方面，本发明涉及主题化合物用于制备治疗患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体的药物的用途。本发明的另一方面涉及合成l-(3，5-二氯吡啶-4-基)-6-(3-羟基-4-吡咯烷基甲基-苯基)甲基-3-异丙基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的方法。因此，本发明提供主题化合物，其为(i)式(I)的化合物，(I)(ii)(i)的化合物的互变异构体。本发明进一步提供主题化合物的任何盐形式，包括任何药学上可接受的盐；或主题化合物的任何溶剂合物，包括任何水合物。本发明进一步提供主题化合物的前药形式。根据下文的详述及权利要求书，本发明的其他特征及优势将变得明显。附图简述图1:每日两次经口施用化合物I或化合物P(及对照媒介物及环磷酰胺(Cytoxan))对(a)A2780卵巢异种移植肿瘤生长及(b)小鼠体重的效应。绘制各时间点时各组小鼠的平均值。图2:接种A2780细胞及施用化合物P、化合物1、媒介物或环磷酰胺的各组小鼠的根据对数线性绘制数据的线性回归的拟合值。图3:每日经口施用化合物I或化合物P(及对照媒介物及R547)对(a)A2780卵巢异种移植肿瘤生长及(b)小鼠体重的效应。绘制各时间点时各组小鼠的平均值。图4:每日经口施用化合物I或化合物P(及对照媒介物及R547)对(a)H460肺异种移植肿瘤生长及(b)小鼠体重的效应。绘制各时间点时各组小鼠的平均值。图5:每日经口施用化合物I或化合物P(及对照媒介物及R547)对(a)HCT116结肠异种移植肿瘤生长及(b)小鼠体重的效应。绘制各时间点时各组小鼠的平均值。图6:化合物I对HCT116细胞中CDK9依赖性RNAPII磷酸化的抑制。还展示总RNAPII及微管蛋白作为对照。如实施例D中所述加工细胞及溶解产物。发明详述术语"互变异构体"为本领域公认的，且描述由伴有单键与相邻双键转换的氢原子或质子的形式迁移(formalmigration)所产生的给定化合物的异构体。如本文中所使用，术语互变异构体包括本发明式(I)化合物的任何可能的互变异构形式。进一步应了解化合物的不同互变异构形式可共存于溶液或固态中，例如共存于平衡状态中，且一种互变异构形式可随时间转化为不同的互变异构形式。因此，应了解提及式(I)化合物是指(i)具有由式(I)表示的结构的化合物，(ii)(i)的化合物的任何互变异构体，或(iii)(i)的化合物及其任何互变异构体的任何混合物。8术语"异构体"是指一组虽然具有相同分子式但性质或原子键合顺序或原子空间排列不同的化合物中之一。本发明意欲包括本发明化合物上所存在的原子的所有同位素。同位素为具有相同原子序数但具有不同质量数的原子。作为氢的同位素的通用实例，包括(但不限于)力、^(氖)及力(氚)。碳的同位素包括"C及"C。如本文中所使用，术语"活性成分"是指药物组合物中所包含的且本身为活性剂或使得形成活性剂的药剂，非限制性实例诸如为前药的活性成分或使得形成为活性剂的代谢物的活性成分。术语"活性剂"是指产生或基本上有助于使用该药剂例如在通过施用包含活性成分的药物组合物而治疗个体的方法(诸如治疗方法)的期望活性(诸如治疗活性)的药剂。活性剂可单独或与一种或多种其他活性剂组合发挥其活性。活性剂可能是已知的或可能不是已知的，例如活性成分是否直接起作用抑或间接起作用，诸如经由活性成分的代谢物介导的作用间接起作用可能不是已知的。不意欲受特定理论限制，相信本发明的化合物同样为活性剂。如本文中所使用，术语"药剂"是指直接或间接在使用术语"药剂"的情况下所述的情形中发挥或期望发挥某种活性的任何物质。如本文中所用，术语"代谢物"是指由代谢或由代谢过程所产生的任何物质。如本文中所使用，代谢是指涉及与分子或化合物接触的细胞、组织、系统或个体(包括人类)中所存在的该分子或该化合物的转化的各种物理/化学/生物化学/药理学反应(各为"代谢过程")。如本文中所用，术语"ICs。"是指可测量的活性、表型或反应(例如，诸如肿瘤细胞的细胞生长或增殖)被抑制50%时的浓度。ICs。值可例如藉由目测或藉由使用适当曲线拟合或统计软件由适当剂量-响应曲线来估算。更准确而言，ICs。值可使用非线性回归分析来确定。如本文中所用，"个体"是指多细胞生物体，例如动物，诸如哺乳动物，包括灵长类动物。除诸如人类的灵长类动物外，多种其他哺乳动物还可包括在术语个体中。举例而言，可使用其他哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或其他牛类、羊类、马类、犬类、猫科类或啮齿动物类。如本文中所使用，"增殖性病症"或"增殖性疾病"包括以个体细胞的增殖超出或高于正常水平，即，高于相同类型的正常非患病细胞中可见的细胞增殖水平为特征的病症或疾病。增殖性病症或疾病可由细胞生长、分化或增殖过程的变化(包括异常调控的细胞生长、增殖、分化或细胞迁移)引起或受其影响。增殖性病症或疾病包括成瘤病症或疾病。细胞生长或增殖病症的实例包括但不限于肿瘤、癌症、自体免疫疾病、病毒性疾病、真菌病、神经退化性病症及心血管疾病。肿瘤或癌症中所包括、包含或获得的细胞通常将理解为增殖细胞，通常为高增殖细胞，且在其他情形下，肿瘤细胞可能发育不良或可能已发生增殖。如本文中所使用，"细胞生长、分化或增殖过程"为细胞数目、尺寸或含量增加的过程；细胞显现一组不同于其他细胞的特殊特征的过程；或细胞移动更靠近或更远离特定部位或剌激的过程，包括氨基酸运输和降解及其他细胞代谢过程。如本文中所用，"成瘤病症或疾病"包括以异常调控的细胞生长、增殖、分化、粘附9或迁移为特征的病症或疾病，其可导致肿瘤的产生或产生肿瘤的倾向。如本文中所使用，"肿瘤"包括组织的良性或恶性块，例如如由细胞的异常增殖所形成。如本文中所使用，术语"抗癌剂"是指具有体内或体外杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、抑制(即，阻止、阻滞、延缓、减缓或延迟)转移或以其他方式展现抗癌活性的能力的活性剂。术语"抗增殖剂"是指具有抑制体内或体外生长细胞的增殖或减少增殖或高增殖细胞的细胞分裂速率的能力的活性剂。已知许多药剂为抗癌剂和/或抗增殖剂，且这些已知药剂包括但不限于六甲蜜胺、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、塞替派、克拉屈滨、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、硫鸟嘌呤、喷司他汀、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吡钼、LA-12、异丙铂、四铂、洛钼、JM216、JM335、沙铂、氟达拉滨、氨鲁米特、氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德(leuprolide)、醋酸甲地孕酮、醋酸环丙孕酮、他莫昔芬、阿那曲唑、比卡鲁胺、地塞米松、己烯雌酚、泼尼松、博莱霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、米托蒽醌、洛索蒽醌、丝裂霉素c、普卡霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、托泊替康、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、GS-211、JM118、依托泊苷、替尼泊苷、长春碱、长春新碱、长春瑞宾、丙卡巴肼、天冬酰胺酶、培门冬酶(pegaspargase)、奥曲肽、雌莫司汀及羟基脲。所述术语还包括但不限于非小分子治疗剂，诸如抗体，例如1D09C3及其他如W001/87337及W001/97338中所述的抗HLA-DR抗体、如美国专利5，736，137、5，776，456、5，843，437中所述的美罗华(Rituxan)、4D5、Mab225、C225、达克珠单抗(Ze卿ax)、Antegren、CDP870、CMB-401、MDX-33、MDX-220、MDX-477、CEA-CIDE、AHM、Vitaxin、3622W94、Therex、5G1.1、IDEC-131、HU-901、麦罗塔(Mylotarg)、Zamyl(SMARTM195)、MDX_210、H咖icade、LymphoCIDE、ABX-EGF、17-1A、曲妥单抗(Herceptin,rhuMAb)、依帕珠单抗、西妥昔单抗(ErbitiD^)、巾白妥珠单抗(Omnitarg,2C4)、R3、CDP860、贝伐单抗(Avastin⑧)、托西莫单抗(Bexxa,)、替伊莫单抗(Ibrit咖omabtiuxetan)(Zevalin)、M195、1D10、HulD10(RemitOgen，阿泊珠单抗(apoliz咖ab))、Danton/DN1924、诸如HD4或HD8的"HD"抗体、CAMPATH-1及CAMPATH-1H或其其他变体、片段、共轭物、衍生物及修饰，或具有改良或优化性质的其他等效组合物及蛋白质或肽，例如描述于TrendsinBiotechnology21(12):556-562，2003中的蛋白质或肽。短语"药学上可接受的"为本领域公认的，且应理解是指化合物、物质、组合物、剂型等的性质，该性质使得该化合物、物质、组合物、剂型等在合理医学判断范围内因提供医学上可接受的效益/风险比而适于向个体施用或用于个体的药物治疗。该合理医学判断应排除例如藉由使该化合物、物质、组合物、剂型等与人类或动物的组织接触而存在过度毒性、剌激、过敏反应或与所提供的效益不相符的其他问题或并发症。因此，"药学上可接受的"用于指化合物、物质、组合物、剂型等，这些化合物、物质、组合物、剂型等在其所使用的功用情形(例如，癌症或其他增殖性病症的治疗)下，不在生物学上、化学上或以任何其他方式与身体化学及生理学不相容，而且其不会不可接受地降低这些化合物、物质、组合物、剂型等的性质或效能。如本文中所使用，术语"药学上可接受的盐"为本领域公认的，且应理解是指母体化合物的衍生物，其中该母体化合物藉由制成其酸式盐或碱式盐加以修饰且其中该盐为药10学上可接受的。药学上可接受的盐通常将维持活性成分的期望生物活性与其不期望或毒性效应之间的平衡，或甚至对该平衡加以改善。酸式盐包括由矿物酸或有机酸与母体化合物中的碱性残基(诸如胺)反应形成的盐。合适酸式盐的非限制性实例包括由无机酸衍生的盐，这些无机酸诸如例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸、重碳酸(bicarbonicacid)、碳酸；及与有机酸形成的酸式盐，这些有机酸诸如例如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、酒石酸、丁二酸、苹果酸、顺丁烯二酸、丁酮二酸、丙二酸、抗坏血酸、柠檬酸、谷氨酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸(palmoic3(^(1)、藻酸、苯乙酸、聚谷氨酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、羟乙基磺酸、萘磺酸、萘二磺酸、a-酮戊二酸、P_甘油磷酸及聚半乳糖醛酸。在本发明各方面的特定实施方案中，主题化合物的盐形式为盐酸盐。在这些方面的替代实施方案中，主题化合物的盐形式为顺丁烯二酸盐，包括包含l:l比例的主题化合物及顺丁烯二酸的此类盐的特定实施方案。碱式盐包括由碱金属或碱土金属碱与母体化合物上的酸性残基(诸如羧酸、酚性残基及其类似物)反应形成的盐。合适的碱金属或碱土金属碱包括氢氧化锂、氢氧化钾及氢氧化钠或氢氧化钙及氢氧化镁。其他合适的碱包括由诸如锌、铋、钡或铝等金属衍生的碱，且进一步包括氨及有机胺，诸如N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺或乙二胺。此外，合适的盐包括由酸与碱的组合衍生的盐，诸如例如鞣酸锌盐。药学上可接受的盐可由常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。这些盐通常可藉由使化合物的游离酸或碱形式与化学计量量或稍过量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；如乙醚、EtOAc、乙醇、异丙醇或乙腈的非水性介质通常优选。合适盐的清单可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(雷氏制药禾斗学)，第18版，MackPublishingCompany,Easton，PA，1990，第1445页，其公开内容以引用的方式并入本文中。本文中还涵盖在例如所关注的化合物的合成和/或纯化中获得应用的非药学上可接受的酸及碱。因此，在本发明的范畴内还涵盖式(I)化合物的所有"盐"。如本文中所使用，术语"前药"是指施用包括前药的药物组合物后在一个或多个步骤内转化为活性剂的活性成分。一般而言，前药为药物本身的衍生物，其在施用于个体或获自个体的细胞后经受转化或代谢为生理学活性物质，即，活性剂。该转化可为自发的，诸如生理环境中的水解，或可为酶催化的。前药包括可经氧化、还原、胺化、去胺化、羟基化、去羟基化、水解、酯化、烷基化、脱烷基化、酰化、去酰化、磷酸化和/或去磷酸化以最终产生活性剂的化合物。前药还可为任何共价键合的载体，当该载体作为活性成分施用于个体时，其体内释放活性剂。前药可增强医药品的许多期望质量(例如，溶解度、生物利用度、制造、运输、药效学等)。前药例如可藉由经口施用而为生物可用的，即使当母体药物不可如此时。可藉由以使得修饰为可逆(例如在施用前药的过程中或体内)以产生母体化合物的方式来修饰母体化合物中所存在的官能团，从而制备前药。自通常专门论述前药的大量科学文献中引用以下实例Gangwar等人，"Prodrug,molecularstructureandpercutaneousdelivery(前药、分子结构禾口经皮递送)，，，Des.Biopharm.Prop.ProdrugsAnalogs,[Symp.]MeetingDatel976，409-21，(1977);Nathwani及Wood,"Penicillins:acurrentreviewoftheirclinicalpharmacologyandther即euticuse(青霉素类其临床药理学和治疗应用的最新综述)，，，Drugs45(6):866-94，1993sSinhababu及Thakker，"Prodrugsofanticanceragents(抗癌剂的前药)"，Adv.DrugDeliveryRev.19(2):241-273，1996;Stella等人，"Prodrugs.Dotheyhaveadvantagesinclinicalpractice7(前药在临床实践中有益处吗？)",Drugs29(5):455-73，1985;Tan等人"Developmentandoptimizationofanti_HIVnucleosideanalogsandprodrugs:Areviewoftheircellularpharmacology,structure-activityrelationshipsandpharmacokinetics(抗HIV核苷类似物和前药的开发和优化其细胞药理学、结构_活性关系和药代动力学综述)"，Adv.DrugDeliveryRev.39(1_3):117-151，1999-DesignofProdrugs(Bundg肌rdH.编)，ElsevierSciencePublishersB.V.(BiomedicalDivision)1985，第1章DesignofProdrugs:Bioreversiblederivativesforvariousfunctionalgroupsandchemicalentities(前药设计各种官能团和化学实体的生物可逆衍生物)(HansB皿dgaard);B皿dgaard等人，Int.J.ofPharmaceutics(Elsevier)22:45-56，1984;Bundgaard等人，Int.T.ofPharmaceutics(Elsevier)29:19-28，1986;Bundgaard等人，T.Med.Chem.32:2503-2507，1989:Chem.Abstracts93:137935y(Bundgaard等人):Chem.Abstracts95:138493f(Bundgaard等人):Chem.Abstracts95:138592n(Bundgaard等人);Chem.AbstractsllO:57664。(Alminger等人);Chem.Abstracts115:64029s(B皿r等人):Chem.Abstracts115:189582y(Hansen等人):Chem.Abstracts117:14347q(Bundgaard等人):Chem.Abstracts117:55790x(Jensen等人)；及Chem.Abstracts123:17593b(Thomsen等人)。术语"施用(administered)"、"施用(administration)"或"施用(administering)"化合物为本领域公认的，且应理解为是指藉由以使得该化合物具有发挥其活性(诸如有益于患有疾病或病症或需要治疗的个体的治疗活性)的机会的方式使个体(包括人类)与该化合物接触或以其他方式使该个体暴露于该化合物，从而向个体提供化合物。术语"体外"是指在身体外部的人工条件下的生物实体、生物过程或生物反应。举例而言，体外生长的细胞应理解为身体外部环境中、例如试管、培养盘或微量滴定板中生长的细胞。术语"治疗有效量"为本领域公认的，且应理解为是指将引发正由施用所述量的执业医师所寻求的细胞、组织、系统或个体(包括人类)的生物学、生理学、药理学、治疗或医学反应的主题化合物的量。在医学情形下，这些期望的结果可包括例如减轻病症或疾病的效应/症状，该病症或疾病诸如增殖性病症或疾病，例如癌症或肿瘤；或杀死增殖细胞或抑制增殖细胞的生长，该增殖细胞诸如肿瘤细胞。治疗有效量可由标准程序，包括本文中以下"剂量"部分中所述的程序确定。术语"治疗"为本领域公认的，且应包括细胞或个体的病状(诸如任何病症或疾病)的任何一种或多种形式的治疗介入，包括该病状的症状或相关病症的治疗介入；且进一步包括在可检测或可获得的病状、病症或疾病表现形式的大致部分已经受先前治疗介入(例如手术)后给予的辅助疗法。应理解，有益治疗可阻止疾病或其症状发作，可减轻疾病或其一种或多种症状或表现形式，可延迟或抑制疾病或其一种或多种症状或表现形式的发展或扩散，可引起疾病或其一种或多种症状或表现形式的消退，或可治愈疾病或消除疾病的一种或多种症状或表现形式。"治疗"与"治愈"不为同义词。术语"进一步治疗"、"进一步施用(furtheradminister)"或者"进一步施用(furtheradministered)"是指可一起、相继、交替或间歇施用不同活性成分、治疗剂或化合物。该进一步施用可为时间上或空间上分开的，例如在不同时间，在不同日期或经由不同施用模式或途径。在某些实施方案中，分离本发明的化合物、其盐形式(包括药学上可接受的盐)或其溶剂合物形式(包括水合物)。在某些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐是经纯化的，例如以具有选自至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%及在某些实施方案中至少99%的纯度。如本文中所使用，纯度可指绝对纯度或相对纯度。绝对纯度是指相对于包括所关注的化合物的组合物的总量，该化合物的量。相对纯度是指相对于组合物中所包括的一种或多种其他物质的量，该组合物中所关注的化合物的量，该一种或多种其他物质例如一种或多种杂质，诸如副产物、降解产物(例如代谢物、氧化或水解产物等)和/或降解以形成本发明的化合物的化合物(例如，前体或前药)。该(这些)其他物质可例如存在于所关注的该化合物的合成化学路线的产物中。因此，绝对纯度是指相对于包括所关注的化合物的组合物的所有其他组分，该化合物的量，而相对纯度主要用于描述关于紧密相关的物质的纯度，且因此不受添加诸如赋形剂、稳定剂或用于结合施用的其他药物等无关化合物的影响。纯度可以基于一种化合物相对于其他化合物的重量比、体积比或摩尔比来评定。纯度可由多种分析技术测量，包括元素丰度、紫外可见光光谱测定法、HPLC、GC-MS、NMR、质谱及薄层色谱法。测定根据本发明的化合物的纯度的优选方法是藉由HPLC、GC-MS或NMR。在某些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐是合成产生的。术语"合成产生的"是指使用本领域技术人员熟知的旨在获得化合物的合成技术产生该化合物。在某些实施方案中，本发明的化合物、其盐形式(包括药学上可接受的盐)或其溶剂合物形式(包括水合物)呈非晶态形式。在某些实施方案中，本发明的化合物、其盐形式(包括药学上可接受的盐)或其溶剂合物形式(包括水合物)呈结晶形式。本发明的另一方面涉及主题化合物或其盐形式的前药。这些前药包括其中本发明的化合物的苯基取代基上的羟基或吡咯烷基、吡啶取代基或吡唑并嘧啶酮环系统的任何氮原子与当该前药施用于细胞、组织或个体(包括人类)时裂解以分别形成游离羟基或氮原子的任何基团键合的化合物。这些前药的实例包括但不限于本发明的化合物的酚性羟基的乙酸盐、甲酸盐及苯甲酸盐衍生物或本发明的化合物的N-酰氧基烷基吡啶鎗衍生物(Davidsen等人，JMedChem.1994;37:4423-9)。制剂、剂量及应用本发明进一步提供药物组合物，其包含选自主题化合物、主题化合物的盐形式(诸如药学上可接受的盐)及其前药的活性成分以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，包括包含治疗有效量的该活性成分的药物组合物。制剂本发明的组合物可经配制及施用以治疗细胞或个体，诸如人类，包括需要治疗的个体，诸如患有如癌症的病症的个体。该配制及施用可藉由使得活性剂与活性剂的作用部位，诸如该个体体内的细胞，例如存在于该个体体内的肿瘤或癌症中所包括的细胞接触的任何适当方式实现。其可藉由任何可用于与药物结合使用的常规方式，作为单独治疗活性成分或以治疗活性成分的组合来施用。其可单独施用，但通常与基于所选施用途径及标准医药实践所选择的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体一起施用。根据本发明所使用的药物组合物可以常规方式使用一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体来配制。本发明的药物组合物可经配制以用于多种施用途径，包括全身性及局部或局限地施用。技术及制剂通常可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(雷氏制药科学)，MeadePublishingCo.，Easton，PA中。如下文所详细描述，本发明的药物组合物可特别经配制以用于以固体或液体形式施用，包括适合以下情形的配制(1)经口施用，例如灌药(drench)(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、胶囊、大丸剂、粉齐U、颗粒齐U、施用于舌的糊剂；(2)肠胃外施用，例如以例如无菌溶液或悬浮液形式皮下、肌肉内或静脉内注射；(3)局部施用，例如以施用于皮肤的乳膏、软膏剂或喷雾剂形式；或(4)阴道内或直肠内，例如以阴道栓剂(pessary)、乳膏或泡沫剂形式。在某些实施方案中，药物制剂可为非热原性的，即，大体上不使患者的体温升高。在某些实施方案中，本发明的药物组合物经配制以用于经口施用。在某些其他实施方案中，本发明的药物组合物经配制以用于静脉内施用。湿润剂、乳化剂及润滑剂(诸如十二烷基硫酸钠及硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂及香料、防腐剂及抗氧化剂也可存在于组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠及其类似物；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚及其类似物；及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其类似物。本发明的制剂包括适于经口、经鼻、局部(包括口腔及舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以单位剂型方便地提供，且可藉由制药学领域中熟知的任何方法来制备。可与载体物质组合以制得单一剂型的活性成分的量将视所治疗的个体以及特定施用模式而变化。可与载体物质组合以制得单一剂型的活性成分的量通常将为产生治疗效应的活性成分的量。通常以100%计，该量将在按重量计约1%至约99%活性成分的范围内，在某些实施方案中，为按重量计约5%至约70%，且在特定的这些实施方案中，为按重量计约10%至约30%。制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的化合物或该化合物的前药与载体及任选地一种或多种辅助成分结合的步骤。这些制剂通常藉由使本发明的化合物或该化合物的前药与液体载体或细碎的固体载体或两者均一且充分地结合，且随后必要时使产物成形来制备。对于全身性施用，优选为注射，包括肌肉内、静脉内、腹膜内及皮下(分别为i.m.、i.v.、i.p.及s.c.)。如本文所用的短语"全身性施用"、"全身地施用"、"外周施用"和"外周地施用"是指除向中枢神经系统直接施用以外地施用化合物、药物或其他物质以使其进入患者的循环系统且因此经受代谢及其他类似过程。对于注射，本发明的药物组合物可配制于液体溶液，优选生理相容性缓冲液(诸如汉克氏溶液或林格氏溶液)中。另外，这些药物组合物可配制为固体形式且在使用之前即刻再溶解或悬浮。还包括冻干形式。本发明的药物组合物可经配制以适于经口施用且可呈胶囊、扁囊剂、药囊、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，诸如蔗糖及阿拉伯胶或黄耆胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或呈于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式，或呈水包油或油包水的液体乳液形式，或呈酏剂或糖浆形式，或呈软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶及甘油，或蔗糖及阿拉伯胶)和/或漱口剂形式及其类似形式，各含有预定量的本发明化合物或该化合物的前药作为活性成分。本发明的化合物或该化合物的前药还可以大丸剂、舐剂或糊剂形式施用。在配制用于经口(p.o.)施用的固体剂型形式的本发明的药物组合物(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂及其类似物)中，本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药作为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下各物质中的任一种或其组合混合(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐及碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)湿润剂，诸如例如十六醇及甘油单硬脂酸酯；(8)吸附剂，诸如高岭土及膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；及(10)着色剂。在胶囊、片剂及丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖(lactose或milksugar)、高分子量聚乙二醇及其类似物的赋形剂的软填充及硬填充明胶胶囊中，还可使用类似类型的固体组合物作为填充剂。明胶胶囊可含有本发明的化合物或该化合物的前药作为活性成分及诸如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸及其类似物的粉末状载体。可使用类似载体以制备压制片剂。片剂与胶囊可制造为持续释放产品形式以提供数小时的时期内药物的连续释放。压制片剂可包糖衣或包膜以掩盖任何令人不快的味道且保护片剂免受大气损害，或包有肠溶衣以在胃肠道中选择性崩解。在软填充及硬填充明胶胶囊中还使用类似类型的固体组合物作为填充剂；就此而论，优选物质还包括乳糖以及高分子量聚乙二醇。该制剂的特定实例为含于软明胶胶囊中的油(例如橄榄油、Miglyo1或C即mul)中的溶液或悬浮液。可酌情添加抗氧化剂以防止长期降解。可藉由任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备片剂。压制片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑齐U、惰性稀释齐U、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可藉由在合适机器中模制经惰性液体稀释剂湿润的粉末状组合物的混合物来制备。本发明的药物组合物的片剂及诸如糖锭剂、胶囊、丸剂及颗粒剂的其他固体剂型可任选经刻痕或用诸如肠溶包衣及医药配制技术中熟知的其他包衣的包衣及壳层来制备。其还可为提供活性成分的减缓或控制释放的制剂，其中使用例如提供期望的释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。其可由例如经由细菌滞15留过滤器过滤或藉由以无菌固体组合物的形式掺入杀菌剂来杀菌，所述组合物可在使用之前即刻溶解于无菌水中或某些其他无菌可注射介质中。这些组合物还可任选含有遮光剂，且可为任选以延迟方式仅释放活性成分或在某些实施方案中将活性成分释放于胃肠道某一部分中的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质及蜡。活性成分还可为微囊化形式，如果适当，与一种或多种上述赋形剂一起微囊化。本发明的药物组合物的用于经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆及酏剂。除活性成分外，液体剂型可含有本领域中通常使用的惰性稀释剂(诸如水或其他溶剂)、增溶剂及乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、l，3-丁二醇、油类(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，用于经口施用的药物组合物还可包括助剂，诸如湿润剂、乳化剂及悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香料及防腐剂。除本发明的药物组合物外，悬浮液可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂及黄蓍胶及其混合物。对于口腔施用，药物组合物可呈以常规方式配制的片剂或锭剂形式。对于经吸入施用，本发明的药物组合物可使用合适推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体)以气溶胶喷雾形式由加压包装或喷雾器方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可藉由提供递送计量的量的阀门来确定。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊及药筒可经配制以含有治疗剂与合适粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。药物组合物可经配制以用于藉由注射(例如藉由快速注射或连续输注)的肠胃外施用。用于注射的制剂可以具有所添加的防腐剂的单位剂型呈现，例如于安瓿中或于多剂量容器中。这些药物组合物可采用诸如于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。可选地，活性成分可呈使用之前用合适媒介物(例如无菌无热原的水)构建的粉末形式。如本文中所使用，短语"肠胃外施用"和"肠胃外地施用"是指除肠内及局部施用以外的施用模式，通常藉由注射实现且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内及胸骨内(intrasternal)注射及输注。适于肠胃外施用的本发明的药物组合物包含本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液或在使用前可即刻复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂变得与预定接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明的药物组合物中的合适的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及类似物)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。适当流动性可例如藉由利用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下藉由维持所需的粒径及藉由利用表面活性剂来维持。这些药物组合物还可含有助剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。可藉由包括各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其类似物)确保防止微生物作用。还希望在药物组合物中包括等渗剂，诸如糖、氯化钠及其类似物。另外，可注射药物形式的延长吸收可藉由包括延迟吸收剂(诸如单硬脂酸铝和/或明胶)来达成。除先前所述的制剂外，药物组合物还可经配制为贮库制剂。这些长效制剂可藉由植入(例如皮下或肌内)或藉由肌内注射施用。因此，例如，药物组合物可与合适的聚合或疏水性物质(例如如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制、或以微溶性衍生物(例如微溶性盐)的形式配制。全身性施用还可为藉由经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常在本领域中为已知，且包括例如对于经粘膜施用，胆汁盐及夫西地酸衍生物。另外，可使用去垢剂来促进渗透。经粘膜施用可经由鼻用喷雾剂或使用栓剂。对于局部施用，将本发明的药物组合物配制为如本领域中通常所知的软膏剂、油膏齐U、凝胶剂或乳膏。在一些情况下，为延长本发明化合物的治疗效应，希望延缓本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药自皮下或肌内注射的吸收。这可藉由利用水溶性差的结晶或非晶态物质的液体悬浮液达到。本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药的吸收速率则视其溶解速率而定，而溶解速率又可视晶体尺寸及结晶形式而定。或者，肠胃外施用的抑制剂形式的延迟吸收藉由将本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药溶解或悬浮于油性媒介物中来达到。本发明的药物组合物可经配制为栓剂经直肠或阴道施用，其可藉由将本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药与一种或多种在室温下为固体但在体温下为液体且因此在直肠或阴道腔中融化且释放活性成分的合适无剌激性赋形剂或载体(包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备。适于阴道施用的本发明的药物组合物的制剂还包括含有诸如本领域中已知的适当载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。用于局部或经皮施用本发明的化合物或该化合物的前药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、溶液、贴片及吸入剂。可在无菌条件下将这些化合物与药学上可接受的载体及与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或其他助剂一起混合。除本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药外，软膏剂、糊剂、乳膏及凝胶剂还可含有赋形剂，诸如，动物及植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、黄耆胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石及氧化锌或其混合物。除本发明的化合物或该化合物的前药外，粉剂还可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。经皮贴片具有提供本发明的化合物至身体的受控递送的附加优点。这些剂型可藉由将本发明的抑制剂溶解或分散于适当介质中来制备。还可使用吸收促进剂来增加药物透过皮肤的流量。该流量率可藉由提供速率控制膜或将本发明的化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。眼用制剂、眼用软膏剂、粉剂、溶液及其类似物也预期用于本发明中。如果需要，药物组合物可存在于可含有一个或多个含活性成分的单位剂型的包装或分配器装置中。包装可例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书。在其他实施方案中，包装或分配器可进一步包装于外纸箱中。本发明的药物组合物还可配制为持续和/或定时释放制剂。这些持续和/或定时释放制剂可由本领域普通技术人员熟知的持续释放部件或递送装置制备，诸如以下美国专利中所述的部件或装置第3，845，770号、第3，916，899号、第3，536，809号、第3，598，123号、第4，008，719号、第4，710，384号、第5，674，533号、第5，059，595号、第5，591，767号、第5，120，548号、第5，073，543号、第5，639，476号、第5，354，556号及第5，733，566号，其公开内容各自以引用的方式并入本文中。本发明的药物组合物可用于使用例如提供期望的释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球或其类似物或其组合以提供一种或多种活性成分的减缓或持续释放。可容易地选择本领域普通技术人员已知的合适的持续释放制剂(包括本文中所述的制剂)以与本发明的药物组合物一起使用。因此，本发明涵盖适于经口施用的单位剂型，诸如但不限于适合持续释放的片剂、胶囊、软胶囊、囊片、粉剂及其类似物。可注射贮库形式可藉由形成本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药于诸如聚交酯-聚乙交酯等可生物降解的聚合物中的微囊化基质来制备。视药物与聚合物的比例及所用的特定聚合物的性质而定，可控制药物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。贮库可注射制剂还可藉由将本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药包裹于与体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。齐[J量待施用的应为足以或由健康护理专业人员(诸如医师、兽医、药剂师或护士)合理预期导致改善例如癌症或肿瘤的症状的治疗有效量化合物的剂量当然将视已知因素而变化，这些因素诸如特定活性成分的药效学特征及其施用模式及途径；接受者的年龄、性别、健康状况及体重；症状的性质及程度；并行治疗的类型、治疗频率及期望的效果。还可使用包含比单独施用时治疗有效量低的本发明化合物或其盐或前药的剂量，诸如当主题化合物与另一诸如抗癌剂的治疗活性剂组合使用时，只要该组合治疗上有效。本发明的药物组合物的毒性及治疗效能可由标准医药程序在细胞培养物或实验动物中来测定，例如测定LD5。(使测试群体的50%致死的剂量)及ED5。(对群体的50%治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比为治疗指数且其可以比率LD5。/ED5。表示。展现有利治疗指数的药物组合物适用于许多情况。在某些情况中，甚至可使用似乎展现削弱或毒性副作用的药物组合物，包括谨慎设计使这些药物组合物的活性剂靶向于感染组织部位以最小化对未感染细胞的潜在损害且从而使副作用减小或局部化的递送系统的情况。由细胞培养检测及动物研究所获的数据可用于配制适用于人类的剂量范围。在某些实施方案中，剂量处于很少或无毒性的包括ED5。的循环浓度范围内。剂量可视所使用的剂型及所使用的施用途径而在该范围内变化。对于本发明的方法中所使用的本发明的化合物、其任何药学上可接受的盐或该化合物的任何前药，治疗有效剂量最初可由细胞培养检测估计。剂量可在动物模型中加以配制以获得包括如细胞培养中所确定的IC5。(S卩，达到症状的最大半数抑制或生化活性抑制的测试活性成分的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更准确判定人类的适用剂量。可例如由高效液相色谱来测量血浆中的水平。应理解，活性成分的适当给药视本领域技术人员(例如，医师)已知的若干因素而定。活性成分的剂量将例如视正处理的个体或样品的特性、尺寸及状况而变化，进一步视将施用组合物的适当途径及执业医师所希望的治疗剂对介导疾病病因、症状或效果的靶的治疗靶点(诸如细胞、核酸或多肽)产生的效果而变化。示例性剂量包括每千克受治疗者或样品重量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药的毫克量或微克量，例如，每千克1微克至每千克500毫克、每千克100微克至每千克50毫克或每千克1毫克至每千克5毫克。本领域技术人员应了解还可基于体表计算剂量。70千克的人具有约1.8平方米的体表面积，且剂量可以每受治疗者或样品的体表面积的本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药的毫克量或微克量表示，例如，每平方米50微克至每平方米15克、每平方米5毫克至每平方米1.5克，或每平方米50毫克至每平方米150毫克。应用本发明进一步提供本发明的化合物、其药学上可接受的盐或该化合物的前药，其用于疗法。在某些实施方案中，所述疗法为治疗患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体。在某些实施方案中，所述治疗为治疗患有与一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性相关的病症或疾病(诸如癌症)的个体，诸如藉由抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性来治疗。因此，本发明另外提供治疗具有或患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体(诸如哺乳动物，包括人类)的方法，该方法包括向所述个体施用一定量(诸如治疗有效量)的主题化合物、其药学上可接受的盐或其前药或施用如上所述的本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述个体为人类。在某些实施方案中，所述治疗为治疗可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性而治疗的癌症。在另一方面，本发明提供治疗患有疾病的个体的方法，该个体诸如哺乳动物，包括家养哺乳动物、啮齿动物及人类，该方法包括使所述个体暴露于或接触一定量(包括治疗有效量)的主题化合物、其药学上可接受的盐或其前药的步骤。在某些实施方案中，该疾病为癌症或另一增殖性病症或疾病。在某些实施方案中，所述个体为人类。在又一实施方案中，使与所述癌症或所述另一增殖性病症或疾病相关的细胞，包括肿瘤或癌症中所包括的肿瘤细胞(例如在个体中为恶性细胞的肿瘤细胞)暴露于主题化合物、其药学上可接受的盐或其前药。在某些实施方案中，向存在所述细胞的所述个体施用所述化合物、其药学上可接受的盐或其前药。在某些实施方案中，所述治疗为治疗可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性而治疗的癌症。在另一方面，本发明提供杀死细胞或抑制细胞增殖或生长的方法，该方法包括使这些细胞与本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药接触。在一实施方案中，使这些细胞与该药剂体外接触，而在一替代实施方案中，这些细胞存在于个体中。在一特定实施方案中，这些细胞为癌细胞，例如来自肿瘤细胞系的细胞或肿瘤或癌症中所包括的细胞，包括来自可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、19CDK7和/或CDK9的活性来治疗的肿瘤的癌细胞。本发明的另一方面涉及如上所述的化合物、其药学上可接受的盐或其前药用于制备治疗或预防癌症或另一增殖性病症或疾病的药物的用途，该另一增殖性病症或疾病包括可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性来治疗的癌症。另外，本发明涉及一种药物组合物，其包含选自如上所述的化合物、其药学上可接受的盐及其前药的活性成分以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，其中该药物组合物用于施用至患有病症或疾病的个体，该病症或疾病诸如癌症或另一增殖性病症或疾病，包括可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性来治疗的癌症。在另一方面，本发明涉及包括使细胞(包括肿瘤细胞)与一定量(诸如治疗有效量)的主题化合物接触的方法。这些方法包括抑制本文中所公开的一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，这些激酶诸如选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的激酶。在该方面的特定实施方案中，所抑制的激酶为CDK9。在某些实施方案中，使细胞与主题化合物体外接触，而在一替代实施方案中，细胞包括在个体(诸如哺乳动物，包括人类)内所存在的肿瘤或癌症中。该个体可患有增殖性病症或疾病，包括癌症或可藉由抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，诸如抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和/或CDK9的活性来治疗的病症。在本部分中所提及的方法的特定实施方案中，该病症或疾病与CDK9的活性相关。在其他实施方案中，该病症或疾病与CDK1、CDK2和/或CDK4的活性相关。在某些实施方案中，所述治疗产生对细胞中选自RNAPII、Rb及Eg-5的CDK底物的磷酸化的抑制。在某些实施方案中，所述RNAPII磷酸化的抑制比所述Rb和/或Eg-5磷酸化的抑制显著一定的倍数，其选自约2倍、约5倍、约10倍、约50倍及超过100倍。在本文中所涵盖的本发明的某些治疗方法中，肿瘤可能为实体肿瘤，其为除血液、骨髓或淋巴系统以外的体组织的癌症。在其他实施方案中，肿瘤可能为血液肿瘤，诸如白血病及淋巴瘤。白血病为以恶性变化的白血细胞的增殖为特征的恶性疾病的集合术语。由淋巴组织产生的疾病称为淋巴瘤。实体肿瘤可选自肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌、骨癌、甲状腺癌、皮肤癌(包括鳞状细胞癌)、食道癌、肾癌、膀胱癌、胆囊癌、子宫颈癌、卵巢癌、肺癌(包括支气管肺癌、小细胞及非小细胞肺癌)、胃癌及头颈癌。血液肿瘤可为白血病，诸如急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性淋巴细胞性白血病、急性白血病、急性前髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病(CGL)、慢性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病、常见型急性淋巴母细胞白血病、嗜酸细胞性白血病、红白血病、淋巴结外淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、单核细胞性白血病及前淋巴细胞性白血病。血液肿瘤还可为淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(BurkittLymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤、高恶度淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'sLymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、低恶度淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)型淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、原发性血小板增多症、毛细胞淋巴瘤、髓外骨髓瘤及粒细胞性肉瘤。20血液肿瘤还可为骨髓系肿瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓增殖异常综合征及前髓细胞性白血病。肿瘤还可源于间质细胞，诸如纤维肉瘤及横纹肌肉瘤。此外，肿瘤可为中枢及外周神经系统肿瘤，诸如星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤及神经鞘瘤；且肿瘤可为其他肿瘤，诸如黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病(xenoderomapigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoctanthoma)、甲状腺滤泡性癌及卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)。对其他抗癌或抗增殖剂治疗有抗性或难以由该治疗治愈的肿瘤还可受益于本发明的方法及药物组合物的治疗。本文中所公开的化合物还可适用于抑制肿瘤血管生成及转移。本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药还可适用于与已知抗癌治疗(诸如放射疗法)或其他抗癌剂、抗增殖剂、细胞抑制剂或细胞毒性剂组合(一起或相继施用)。可与本发明的化合物组合使用的其他抗癌剂及抗增殖剂包括本文中所述的药剂。在组合治疗中，本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药可进一步与本文中所公开的任何其他抗癌剂及抗增殖剂一起施用。若配制为固定剂量，则这些组合产品使用本文所述的剂量范围内的本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药及在批准剂量范围内的其他医药活性剂或治疗。药物组合的协同效应及视施用顺序而定的对活性的影响在该领域中为已知的(例如参见.T.CellSci.,108:2897，1995-CancerRes.57:3375，1997)，且使剂量及递送顺序优化将在利用本发明的化合物的本领域执业医师的能力范围内。当组合制剂不适当时，本文中所述的化合物、其药学上可接受的盐或其前药还可与其他抗癌剂或抗增殖剂相继施用。然而，在不存在不利适应症的情况下，本发明在施用顺序方面不受限制；本文中所述的化合物、其药学上可接受的盐或其前药可在施用另一抗癌剂或抗增殖剂之前、与其同时或在其之后施用。已知例如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂夫拉平度的细胞毒性活性受连同抗癌剂施用的顺序影响(CancerResearch,57，3375，1997)。本发明的其他方面在另一方面，本发明提供医药包装，其中所述包装包括本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药或包括该化合物、药学上可接受的盐或前药的任何药物组合物。在某些实施方案中，该包装包含指示所述药物组合物可用于施用至有需要的个体的说明书，该个体包括人类，诸如患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体。在某些其他实施方案中，该医药包装包括与诸如抗癌剂或抗增殖剂的另一医药成分一起配制的本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药。在此情况下，本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药及其他医药成分可一起或分别且以单独剂量配制。可与本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药一起或分别配制的其他医药成分包括但不限于其他抗癌剂及抗增殖剂，诸如上述药剂。在某些其他实施方案中，医药包装包含向有需要的个体施用该活性成分的说明书。在另一方面，本发明提供向患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体施用药物组合物的医药包装，其中所述包装至少包括本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药。在某些其他实施方案中，该医药包装包含向患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体施用该药物组合物的说明书。21如本文中所使用，术语"医药包装(pharmaceuticalpackage)"和"医药包装(pharmaceuticalpack)"是指用于储存及分配药物的单独剂量来治疗个体的任何包装系统。医药包装优选含有合乎治疗时间或有助于个体顺应方案的量的充足每日剂量单位。在某些实施方案中，该医药包装包含一个或多个包括例如本发明的化合物的活性成分的容器。该容器可为诸如瓶子、小瓶、注射器或胶囊的容器或可为诸如丸剂的单位剂型。活性成分可以药学上可接受的形式提供于容器中或可例如以冻干粉剂形式提供。在其他实施方案中，该医药包装可进一步包括制备包含用于施用的该活性成分的药物组合物的溶剂。在某些实施方案中，包含该活性成分的药物组合物可能已提供于诸如注射器的递送装置中，或包装中可包括合适递送装置。医药包装可包含丸剂、液体、凝胶剂、片剂、糖锭剂或呈任何其他合适形式的医药制剂。包装可含有任何数目的每日医药剂量单位。包装可为任何形状，且单位剂型可以任何图案排列，诸如环形、三角形、梯形、六边形或其他图案。可诸如藉由使用颜色编码、标签、印刷、压印、刻痕或图案来鉴别一个或多个剂量或亚单元，从而指示该剂量或亚单元例如来帮助医生、药剂师或患者。医药包装还可包含供待施用的个体、医生、药剂师或与向该个体施用药物组合物的行为相关的任何其他人员用的说明书。—些实施方案包括施用超过一种活性成分，包括如本文中所公开的化合物。该施用可同时或相继发生。活性成分可配制在一起以便一次施用递送所有组分。或者，活性成分可分别配制。医药包装可在单一制剂中包含本发明的化合物及其他医药成分，即，其配制在一起，或呈单独制剂的本发明的化合物及其他医药成分，即，其分别配制。各制剂可包含单独剂量的(大致相等或不等的量)本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药及其他医药成分。通常施用本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其前药及其他医药成分以使得当处于该组合中时产生作为治疗有效量的浓度。如本文中所使用，术语"说明书"是指产品标签、包装插页和/或文件或描述与药盒或包装医药品的组装、制备或使用有关的相关材料或方法的其他信息。这些材料可包括以下的任何组合背景信息、储存、制备或施用所遵循的步骤或程序、组份列表、供使用的适应症、建议剂量、关于可能的副作用的警告、施用活性成分的说明、在过度剂量或无效的状况下的说明、技术支持及任何其他相关文件。说明书可以印刷形式提供，诸如包装标签或包装插页。包装医药品或药物组合物的说明书可例如以包装插页形式插入输送纸箱或成品包装中，且该说明书的文本可能需要权威管理当局(诸如美国食品与药物管理局(FDA))批准。或者或补充地，说明书还可以电子形式储存，例如计算机可读储存介质，诸如计算机可读内存装置、集中式数据库、磁性介质，诸如硬盘、软盘及磁带；光学介质，诸如光盘、CD-ROM及全息照相装置；磁光介质，诸如软光磁盘(flopticaldisk);及经特别构造以储存且执行程序代码的硬件装置，诸如应用型专用集成电路(ASIC)、可编程逻辑装置(PLD)及ROM(只读存储器)及RAM(随机存取存储器)装置。说明书可包含可下载更详细说明书的因特网网站的网络地址或记录陈述。说明书可含有一个或多个文件或未来更新。本发明进一步涉及合成如权利要求1的化合物或任选地其盐的方法，该方法包括使具有由式(II)表示的结构的化合物与具有由式(III)表示的结构的化合物反应的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>(II)(III)其中X选自-0-烷基、-0-烯基、-0-炔基、-0-酰基及卤素；且任选地使所得化合物与酸反应以制备酸式盐。在一特定实施方案中，X为-OEt。本发明进一步涉及合成本发明的药学上可接受的盐的方法，该方法包括使本发明的化合物与酸反应的步骤。在一特定实施方案中，该酸为盐酸。在另一特定实施方案中，该酸为顺丁烯二酸。实施例如实施例A中所述地发明主题化合物，且其可如实施例B.1至B.8中所示合成。在实施例C.1至C.5中证明根据本发明的化合物在异种移植肿瘤模型中的令人惊讶的抗增殖活性。实施例D展示主题化合物对细胞内RNAPII磷酸化的有效抑制。实施例A:本发明化合物的鉴别WO03/033499、WO2004/092139及WO2005/063765公开了多种具体的1-苯基-3-异丙基-6-芳基甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，尤其包括化合物l-(2，6-二氯苯基)-6-(3-羟基-4-妣咯烷基甲基-苯基)甲基-3-异丙基-妣唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(化合物P，参见上文)。本发明人已建立CDK抑制剂研究计划以发现具有适于进一步开发的性质的新型化合物。在该计划中，合成且检查了基于如表1中所示的取代模式的修饰的吡唑并[3，4-d]嘧啶_4-酮的大量新型衍生物表l:衍生策略<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>然而，令人惊讶地，当与结构上最密切相关的现有技术化合物(化合物P)相比时，主题化合物(化合物I)展示某些关键性质的显著改良的参数，且甚至维持其他重要性质的期望参数，如下-令人惊讶地，与化合物P相比，化合物I在不同异种移植肿瘤模型，包括使用两种不同给药方案的A2780异种移植模型中展示显著更有效的活性(参见实施例C);-改良的药理学相关ADMET参数，渗透性(与化合物P的约57%相比，在PAMPA检测中在pH=7.4下化合物I的渗透性为约70%);-改良的药理学相关ADMET参数，溶解度(与化合物P的约210iiM相比，在pH7.4下化合物I为约390iiM);-在一组癌症模型细胞系中显著且改良的增殖抑制，这些细胞系尤其包括细胞系A2780、HCT-116、HT_29、H印G2、NCI/ADR-RES、0VCAR3、H460、頂R-90、T98G、A549，其中化合物I的IC5。值在介于约800nM至约10nM之间的范围内(与化合物P的介于约1.6yM至约16nM之间的范围内的IC5。值相比);-体外生物化学激酶抑制检测中抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7及CDK9以及抗CDK3及CDK5的显著且平衡的CDK抑制活性，其中化合物I的IC5。值在约lOOnM至约2nM的范围内，与化合物P的ICs。值相当(或就某些CDK而言，甚至更有效)；-对CDK具有高特异性，而对一组非CDK激酶具有低抑制活性；根据本领域技术人员熟知的标准程序进行用于确定激酶抑制剂的性质的检测。举例而言，确定对CDK的抑制活性的检测或细胞检测描述于WO00/218962、WO2005/026129及WO2005/063765中。大体上如Avdeef，A.pharmacokineticOptimizationinDrugResearch(药物研究中的药代动力学优化)Testa,B.;vandeWaterbeemd，H.;Folkers，G.;Guy，R.编辑;Wiley-VHC:Zurich，2001;第305-326页中所述进行pH7.4下的溶解度检测。大体上如Kansy等人，T.Med.Chem.41:1007-10，1998中所述进行pH7.4下的PAMPA渗透性检测。实施例B:6-(3-羟基-4-(吡咯烷基甲基)苯基甲基)-3-异丙基_1_(3，5_二氯吡啶_4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的合成(实施例B.1-B.7)实施例B.l-B.8详细展示合成l-(3，5-二氯吡啶-4-基)-6-(3-羟基-4-(吡咯烷基甲基)苯基甲基)-3-异丙基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(化合物I)及其盐的步骤。本领域技术人员应了解，还可使用其他合成途径。尤其是，其他合成途径实际上可应用于本发明的某些方面。本领域技术人员参考通用教科书，诸如March的AdvancedOrganicChemistry(高等有机化学)(MichaelB.Smith及JerryMarch,Wiley-Interscience，2000)-ThePracticeofMedicinalChemistry(医药化学实践)(CamileG.Wermuth，AcademiaPress,2003)及ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有机合成中的保护基团)(TheosoraW.Greene及PeterG.M.WutsJohnWiley&SonsInc.，1999)。实施例B.1(l-羟基-2-甲基亚丙基)甲烷-l，l-二甲腈的合成在(TC下，向NaH(60X于油中的分散液，24g，600毫摩尔)于THF(375mL)中的悬浮液逐滴添加丙二腈(19.8g，300毫摩尔)于THF(150mL)中的溶液。随后将反应升温至室温且搅拌1小时。随后将悬浮液冷却至Ot:且逐滴用异丁酰氯(31.4mL，299.7毫摩尔)于THF(125mL)中的溶液处理。控制添加以使内部温度不上升高于l(TC。添加完成后，将反应升温至室温且搅拌24小时。随后用H20(50mL)使反应中止且在减压下浓縮。随后将残余物在EtOAc(500mL)与5XHC1水溶液(300mL)之间分配。用EtOAc(250mL)萃取水层，且将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，干燥，过滤且在减压下浓縮。将残余物在乙腈(300mL)与己烷(lOOmL)之间分配。将乙腈层用己烷(lOOmL)洗涤且蒸发以得到期望的产物(38g，产率93%)。实施例B.2(l-氯-2-甲基亚丙基)甲烷-l，l-二甲腈的合成向(1-羟基-2-甲基亚丙基)甲烷-l，l-二甲腈(38g，279毫摩尔)于CH2C12(600mL)中的溶液中添加五氯化磷(63g，302毫摩尔)。在室温下搅拌反应16小时。随后将反应物倾至冰(500g)上且在CH2Cl2(750mL)与H20(500mL)之间分配。再次用CH2C12(500mL)萃取水层，且将合并的有机层用饱和NaHC03水溶液(750mL)及盐水(750mL)洗涤。随后将有机层干燥(MgSO》，过滤且在减压下浓縮以得到期望的氯化物(35.6g，产率81%)。实施例B.35-氨基-1-(3，5-二氯吡啶基)-3-异丙基-1H-吡唑_4_甲腈的合成将(l-氯-2-甲基亚丙基)甲烷-l，l-二甲腈(35.6g，230毫摩尔)于THF(875mL)中的溶液用3，5-二氯吡啶基肼(40.9g，230毫摩尔)、接着用三乙胺(23g，230毫摩尔)处理。随后将该反应加热至回流历时18小时。随后将反应冷却至室温且在EtOAc(lL)与1MNaOH水溶液(500mL)之间分配。用EtOAc(2X500mL)萃取水层，且将合并的有机层用10%柠檬酸(500mL)、饱和NaHC03水溶液(750mL)洗涤。将有机层干燥(MgS04)，过滤且在减压下浓縮以得到期望的产物(56g，产率82X)。实施例B.45-氨基-1-(3，5-二氯吡啶基)-3-异丙基-1H-吡唑_4_甲酸酰胺的合成将5-氨基-1-(3，5-二氯吡啶基)-3-异丙基-111-吡唑-4-甲腈(56g，189毫摩尔)溶解于浓H2S04(160mL)中且在室温下搅拌16小时。随后在0。C下将反应物倾至3MNaOH水溶液(2L)上。随后将所得固体过滤且用H20(1L)洗涤。随后在真空下干燥产物以得到期望的酰胺(49g，产率82X)。实施例B.53-羟基苯基乙酸乙酯的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>向3-羟基苯基乙酸(25.9g，170毫摩尔)于EtOH(340mL)中的悬浮液中添加浓H2S04(2mL，36毫摩尔)。将反应混合物在回流下加热4小时，随后冷却至室温。在真空下移除挥发物且将残余物悬浮于EtOAc(300mL)中。将有机层用饱和NaHC03水溶液(1X150mL)、盐水(1X150mL)洗涤，干燥(无水MgSO》且在减压下浓縮以得到呈无色油状物的酯(29.3g，产率96%)。实施例B.63-羟基-4-(吡咯烷基甲基)苯基乙酸乙酯的合成向酯(4.5g，25毫摩尔)及吡咯烷(3.56g，50毫摩尔)于i-PrOH(50mL)中的溶液中添加甲醛(37wt.X，2.47g，28毫摩尔)水溶液。在回流下将反应混合物加热过夜。冷却至室温后，在真空下移除挥发物。利用硅胶快速色谱用含有0.25%NH4OH的CH2C12/MeOH(3-5%)洗脱来纯化粗残余物以得到呈无色油状物的节胺(5.5g，产率84%)。实施例B.76-(3-羟基-4-(吡咯烷基甲基)苯基甲基)-3-异丙基-1-(3，5-二氯吡啶_4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(盐酸盐)的合成向酯(16.0g，60.0毫摩尔)及吡唑(6.28g，20.0毫摩尔)的混合物中添加120mL叔丁醇钾(120.0毫摩尔)于叔丁醇中的1M溶液。将所得混合物在8(TC下搅拌2小时且由HPLC监测。将反应混合物冷却至室温且在减压下移除叔丁醇。向酯(17.66g，66.2毫摩尔)及吡唑(6.93g，22.05毫摩尔)的混合物中添加132.4mL叔丁醇钾(132.4毫摩尔)于叔丁醇中的1M溶液。将所得混合物在8(TC下搅拌2小时且由HPLC监测。将反应混合物冷却至室温，且在减压下移除叔丁醇。将两种反应物合并且用500mL乙酸乙酯稀释。用饱和氯化铵水溶液洗涤有机层。将有机层经硫酸钠干燥，过滤且在减压下浓縮以得到粗产物。经由快速柱色谱用1.0-2.5%MeOH/CHCl3/NH3H20(0.1%)(梯度增加0.1%)洗脱来纯化粗物质以得到洁净产物。添加lOOmL于乙醚中的lMHC1溶液。移除溶剂且经真空干燥以得到8.7g产物(呈盐酸盐形式)(产率38%)。实施例B.86-(3-羟基-4-(妣咯烷基甲基)苯基甲基)-3-异丙基_1_(3，5_二氯妣啶_4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(顺丁烯二酸盐)的合成在7(TC下将6-(3-羟基-4-(吡咯烷基甲基)苯基甲基)_3_异丙基_1_(3，5_二氯吡啶-4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(呈游离碱形式，参见实施例B.7)溶解于异丙醇中，且添加顺丁烯二酸(1.05当量)于异丙醇中的溶液。将反应混合物在7(TC下搅拌20分钟，随后冷却至室温过夜且过滤。向H20中添加所得固体，将浆料在室温下搅拌24小时且过滤。熔点=209°C(差示扫描量热法)；溶解度2.5iig/ml。实施例C:异种移植肿瘤模型中化合物的活性主题化合物(化合物I)在人类癌症的多种体内模型中展示令人惊讶地显著的抗28肿瘤活性且与现有技术化合物(化合物P)相比，令人惊讶地优越。在一系列如下文所述执行的受控鼠类异种移植实验中在经口施用化合物后展示该令人惊讶的活性。方法异种移棺肿瘤樽型使来自CRL的100只无胸腺皿/皿雌性小鼠(6-8周大)驯化4天。在补充有15mg/L胰岛素、10%FCS及1%Pen/Str印的RPMI1640培养基(Gibco)中培养各相应肿瘤类型的细胞(酌情为人类A2780卵巢肿瘤细胞(ATCC)、HCT116结肠癌细胞(ATCC)及H460NSCLC(ATCC))。这些实验使用具有约90%汇合的第3代细胞。简言之，在第0天，在轻度麻醉下藉由皮下注射于靠近乳腺的脂肪垫区域中使小鼠接种呈细胞悬浮液(50X106个细胞/毫升)形式的O.lml(总共5X106个细胞)相应细胞类型。当所有小鼠的平均肿瘤重量达到100mg以上(第10天)时，选择80只平均肿瘤尺寸为130mg的动物，且随机分成8组。对于经口治疗，使用20G管饲针。各化合物的制剂如结果中所述。施用体积为每20克体重O.2ml，其中例外为环磷酰胺(Cytoxan/cyclophosphamide)组(阳性对照)，其以每20克体重0.lml来腹膜内给药。—周三次监测且记录肿瘤生长及体重。藉由用数字卡尺测定肿瘤的长度及宽度来测量肿瘤。使用下式估算肿瘤重量肿瘤重量(mg)=(w2Xl)XO.52，其中w=宽度且1=肿瘤的长度(以mm计)。如下计算肿瘤生长抑制(TGI)%:TGI%=100(1-T/C)，其中T为给定天的化合物处理组的平均肿瘤尺寸且C为同一天媒介物对照组的平均肿瘤尺寸。实验治疗可使得肿瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。当研究过程中三次连续测量的肿瘤尺寸为起始(第l天)尺寸的50X或更小但大于0.0mg时，定义为PR。当三次连续测量不存在可测量的肿瘤块时，出现CR。当维持CR直至实验完成时定义为治愈。当肿瘤达到1000咖3终点体积时，处死小鼠。将治疗功效测定为细胞杀伤对数(LCK)。LCK为测定开始治疗后可能杀伤的肿瘤细胞百分率的计算值且可用作功效的定量量度:LCK=(T-C)/(3.32)(Td)，其中T=小鼠处理组达到1000mg肿瘤尺寸所需的估算时间，C=对照组肿瘤大小达到1000mg的估算时间，Td=指数生长期间对照组肿瘤的估算肿瘤倍增时间且3.32=群体增加l-logl。单位所需的倍增次数。每个LCK单位表示1-loglO单位的细胞杀伤(例如1LCK=90X杀伤，2LCK=99%杀伤等)。毒性死亡定义为由化合物治疗而非晚期疾病状态引起的死亡。若动物在最后化合物治疗后2周内且肿瘤尺寸未达到1000mg即死亡，则视死亡为毒性的。虽然记录此后的非肿瘤相关死亡，但不视为毒性死亡。Mii^使用自举程序确定LCK的估算值及95X置信区间。简言之，藉由用含有n个可评估动物的适当小鼠组的设定i=1，...，n替换，估算各时间点这些所选动物的平均肿瘤尺寸及这些平均值随时间的半对数曲线图的线性回归分析而自B=1000次实现的随机选择的n只单独动物获得T及Td的经验分布。死亡小鼠及肿瘤尺寸不可测量的小鼠视为缺失数据且当计算平均值时忽略。测定iooo次实现的经验分布的平均值及标准偏差，由此测定LCK估算值及该估算值的95%置信区间。对某些逐对比较的处理组(或处理相对于对照)使用非参数置换检验以对两个组k与l之间所观察到的任何差异的显著性进行更精确的检验。简言之，将值|Tk-l\|与若在两个组之间随机交换动物多次时所获得的值iTk(b)-T,)1的分布比较。Tk为小鼠组k的肿29瘤尺寸达到lOOOmg的估算时间。若|Tk=T」比(iTk叫-T」w|;b=1.B)的第90百分位数大时，则在10%置信水平下可排除Tk=1\的无效假设。结果实施例C.1卵巢癌模型(A2780细胞系)_每日经口施用两次根据下表概述的方案设计比较试验，其中方括号中指示游离碱的当化合物P(呈盐酸盐形式)配制于30%PEG300/70X水中且将化合物I(呈盐酸盐形式)配制于20%PEG300/80%D5W(5%右旋糖水)中且每天两次经口强饲施用历时10天(bidX10)，而环磷酰胺对照，其经10天的时间每两天于生理盐水中腹膜内施用(q2dX5):组治疗N齐糧(mg/kg，po)时程A媒介物10----bidXIO(30%PEG300/70X水)B磷酰胺10100，ipq2dX5C化合物P1015[14]bidXIOD化合物P1030[28]bidXIOE合物P1050[47]bidXIOF化合物I1015[14]bidXIOG化合物I1032[30]bidXIOH化合物I1048[45]bidXIO该实验中A2780细胞的体内倍增时间据估算为2.1天。代表性数据展示于图1中，且概述结果制成下表最大BW毒性最大LCK±CI(95%)组治疗PRCR治愈损失％(d)死亡率TGI%(d)(Td:2.Id)B磷酰胺5.9(10)055098(13)3.56±0.43CP-15mg0(6)034(10)0.20±0.16DP-30mg0.1(10)054(10)0.44±0.19EP-50mg4.7(15)081(13)1.06±0.48FI_15mg0(6)047(10)0.29±0.23GI_32mg4.8(15)081(13)1.72±0.89HI一48mg15.9(15)051397(13)3.38±0.81由处理组的LCK在各情况下大于经相应剂量的化合物P处理的组的LCK展示化合物I的抗肿瘤活性令人惊讶的增加。图2中展示遵循线性回归的拟合值的对数线性曲线图，其进一步证明化合物I与化合物P相比功效令人惊讶地增加。就单独小鼠而言，在最高剂量化合物I下，不仅观察到肿瘤生长的部分及完全响应，而且许多单独小鼠完全治愈。艮P，cA实验持续时间，主题化合物(不同于现有技术化合物或甚至阳性对照)能够使肿瘤尺寸减小到可检测水平以下。实际上，藉由置换检验逐对分析某些小鼠组以测试是否可排除其两个组之间的活性不存在差异的无效假设，即考虑实验中实际观察到的可变性，各组的LCK中存在显著差异(参见下文)，从而展示化合物I展示与化合物P相比活性极显著增加(其中例外为最低剂量，对于该剂量不能观察到显著差异，即使在该低剂量下，与对照组A相比，化合物I也具有显著活性)。甚至更令人惊讶的在于，虽然测试的灵敏性不能排除在该显著性水平下的无效假设，但是在最高剂量(组H)下，化合物I与阳性对照环磷酰胺(组B)同等高效，且最高剂量的化合物P(组E)具有比中等剂量的化合物I(组G)低的LCK。LCK估算值0.20对0.290.44对1.721.06对3.380.0对0.293.56对3.381.06对1.72组C-FD-GE-HA-FB-HE-G比较P-15对1-15P-30对1-32P-50对1-48媒介物对1-15环磷酰胺对1-50P-50对1-32实施例C.2卵巢癌模型(A2780细胞系)-P值0.4180.0080.0350.0030.5500.180p<0.10排除排除排除每日经口施用设计具有下表概述的方案的比较试验，其中方括号中指示游离碱的当量剂量。化合物I及化合物P如上配制且每天经口施用历时10天(qdX10)。向组B中的小鼠施用配制于20%DMA/30%PEG300/50%水中的称为R547的化合物(DePinto等人，Mol.CancerTher.5:2644-2658,2006)。治疗N剂量(mg/kg，po)时程物(20%DMA/30%PEG300/50%水)10——qdXIOqdXIOqdXIOqdX9**qdXIOqdXIOqdX7糊组A介BR547C化合物PD化合物PE化合物PF化合物IG化合物IH化合物I10100101010101010qdXl*40[37]70[65]100[93]32[30]63[59]95[89]注意*时程最初为qdXIO，但第一次给药后10只小鼠中5只死亡**第9次给药后1只小鼠死亡***第7次给药后1只小鼠死亡该实验中A2780细胞的体内倍增时间据估算为1.7天。代表性数据展示于图3中，且概述结果制成下表最大组治疗BCDEFGHR547P-40mgP-70mgP-100mgI_32mgI一63mgI一95mgBW损失X(d)7.5(9)1.3(13)4.1(13)18.6(13)3.5(13)4.3(13)16.3(13)死亡率5/10001/001/1010最大TGI%(d)68.5(11)46.2(11)61.1(11)83.9(11)52.2(11)67.3(11)86.2(11)1XK±CI(95%)(Td:1.7d)1.05±0.560.34±0.210.75±0.461.78±0.560.44±0.240.93±0.392.16±0.44与相应剂量的化合物P相比，各剂量的化合物I皆展示如由LCK所估算的抗肿瘤p<0.10活性的普遍增加。藉由置换检验逐对分析某些小鼠组(参见下文)展示，在最高剂量下化合物I展示与化合物p相比活性显著增加，同时不能使用该严格检验明显推断化合物I与化合物p相比通常观察到优越性，该严格检验在该显著性水平下对于两个较低剂量不能排除无效假设。组C-FD-GE-HLCK估算值0.34对0.440.75对0.931.78对2.16P值0.3220.4230.068排除比较P-40对1-32P-70对1-63P-100对1-95实施例C.3肺癌模型(H460细胞系)-每日经口施用研究设计展示于下表中，其中方括号中指示游离碱的当量剂量。化合物I及化合物P如上配制且每天经口施用历时10天(qdX10)。经IO天每两天向组B中的小鼠施用R547(如上配制)(q2dX5)。组治疗N齐糧(mg/kg，po)时程A媒介物(30%PEG300/70X水)10----qdXIOBR5471040q2dX5C化合物P1040[37]qdXIOD化合物P1070[65]qdXIOE化合物P10100[93]qdXIOF化合物I1032[30]qdXIOG化合物I1063[59]qdXIOH化合物I1095[89]qdXIO该实验中H460细胞的体内倍增时间据估算为2.6天。代表性数据展示于@且概述结果制成下表<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>由处理组的LCK在各情况下大于经相应剂量的化合物P处理的组的LCK展示化合物I的抗肿瘤活性令人惊讶的增加。实际上，藉由置换检验逐对分析某些小鼠组(参见下文)展示，化合物I展示与化合物P相比活性极显著增加(其中例外为最低剂量，对于该剂量，未能观察到显著差异；即使在该低剂量下，与对照组A相比，化合物I具有显著活性)。甚至更令人惊讶的在于，在最高剂量(组H)下，化合物I与阳性对照(组B)相比具有更为显著的活性，且最高剂量的化合物P(组E)仅具有与中等剂量的化合物I(组G)同等的LCK。置换检验组比较LCK估算值P值p<0.10C_FP-40对1-320.22对0.260.7-D_GP-70对1-630.26对0.480排除E_HP-100对1-950.48对0.970排除A-F媒介物对1-320.00对0.260排除B_HR547对1-950.48对0.970排除E_GP-100对1-630.54对0.480.4实施例C.4结肠癌模型(HCT116细胞系)-每日经口施用设计具有下表概述的方案的比较试验，其中方括号中指示游离碱的当量剂量。化合物P及化合物I如上配制且每天经口施用历时IO天(qdX10)。每天经口向组B中的小鼠施用R547(配制为于6XCremophorEL/40%PEG300/54X生理盐水中的悬浮液形式)历时10天。组治疗N齐糧(mg/kg，po)时程A媒介物(6%CremophorEL/40%10-——qdXIOPEG300/54X生理盐水)BR54710100qdXIOC化合物P1040[37]qdXIOD化合物P1070[65]qdXIOE化合物P10100[93]qdXIOF化合物I1031.6[29.5]qdXIOG化合物I1063.3[59.1]qdXIOH化合物I1095[89]qdXIO该实验中HCT116细胞的体内倍增时间据估算为6.8天。代表性数据展示于图5中，且概述结果制成下表组治疗最大毒性最大LCK±CI(95%)BW损失X(d)死亡率TGI%(d)(Td:6.8d)BR54714.5(12)3/1072.8(16)0.70±0.28CP-40mg36.2(20)0.23±0.11DP-70mg50.2(32)0.41±0.22EP-lOOmg17.3(16)1/1060.1(16)0.38±0.13FI_32mg32.7(32)0.21±0.08GI一63mg3.2(16)58.5(32)0.51±0.17HI一95mg10.2(16)1/1068.4(20)0.60±0.17与相应剂量的化合物P相比，各剂量(除最低剂量外)的化合物I皆展示如由LCK所估算的抗肿瘤活性的普遍增加。藉由置换检验逐对分析某些小鼠组(参见下文)展示，在最高剂量下化合物I展示与化合物P相比活性显著增加，同时不能使用该严格检验明显推断化合物I比化合物P的普遍优越性，该严格检验在该显著性水平下对于两个较低剂量不能排除无效假设。组比较LCK估算值C-FP-40对1-320.23对0.21D-GP-70对I-630.41对0.51E-HP-100对1-950.38对0.60实施例C.5其他人类癌症体内模型中主题化合物的活性主题化合物(化合物I)在人类癌症的其他模型中展示令人惊讶且出乎意料的活性。在可如上所述执行的受控鼠类异种移植实验中在静脉内或经口施用化合物后展示该令人惊讶的活性。测试肿瘤类型包括PC3(前列腺)及A2780(肺)。如上所述执行实验，其中例外为使用适当的肿瘤细胞系，且在某些实验中，研究化合物可静脉内(i.v.)且以经适当配制的形式施用。实施例D:主题化合物对细胞内RNAPII磷酸化的有效抑制本发明人惊讶地发现主题化合物在许多人类肿瘤细胞系中抗增殖活性的新型作用机制。不同于本领域中关于l-苯基-吡唑并[3，4_d]嘧啶-4-酮所知的情况(参见WO00/021926;WO03/033499;WO2004/092139;W02005/063765;WO2004/092139;WO2005/063765;Caligiuri等人，cheniBiol.12:1103-15,2005;Rossi等人，c，ut.AidedMoLDes.19:111-22,2005;Markwalder等人，J.Med.Chem.47:5894-911，2004)，主题化合物I如下证明细胞活性的先前未知的机制化合物工在整个一组哺乳动物肿瘤细胞模型中展示抑制RNAPII细胞磷酸化(由CDK9活性驱动)的明显且一贯有效的能力，而相反Eg-5及Rb的置换检验p值p<0.100.721-0.381-0排除细胞磷酸化(分别由CDK1及CDK4/6活性驱动)两者均不太强烈且可变性更大地受到抑制。实际上，CDK9依赖性RNAPII磷酸化的细胞抑制与化合物I对抗增殖活性的抑制而非与CDK1或CDK4/6依赖性底物磷酸化的细胞抑制更加相关。方法用化合物I及R547处理后，在癌细胞中研究下列底物的CDK依赖性磷酸化(DePinto等人，MolCancerTher.5:2644-2658;2006):(i)苏氨酸927上的CDK1-依赖性Eg-5磷酸化(Blangy等人，1995，Cell,83(7):1159-1169);(ii)丝氨酸780上的Rb的CDK4/6特异性磷酸化(Zarkowska及Mittnacht，JBiolChem.272(19):12738-127461997;Connell-Crowley等人，MolBiolCell.8(2):287-3011997;Kitagawa等人，1996，EMB0J.15(24):7060-7069;Schmitz等人，2006，AmJPathol.169(3):1074-1079;Baughn，2006，CancerRes.66:7661-7667);(iii)丝氨酸2上的RNA聚合酶II(RNAPII)的CDK9特异性磷酸化(Kim等人，1997，JCellBiol.136(1):19-28)。该组检测代表细胞周期进程中所涉及的CDK(CDK1、4/6)及转录调控中所涉及的"调控CDK"(CDK9)。在这些研究过程中研究下列癌细胞系A2780(卵巢)、HCT116(结肠)、RPMI8226(骨髓瘤)、SKMel28(黑素瘤)、Colo205(结肠直肠)、MDA-MB-435(黑素瘤)、MDA-MB-453(乳癌)、MDA-MB-468(乳腺癌)、A549(肺)、Raji(伯基特淋巴瘤)。自公开储存库获得细胞系。在各浓度的化合物I或R547下处理细胞1小时(Eg-5及Rb磷酸化)或3小时(RNA聚合酶II磷酸化)，底物磷酸化程度由免疫印记分析测量且ICs。值如下文所述在定量信号后确定。图6展示如使用所述的方法所检测的用化合物I处理时HCT116细胞中RNAPII磷酸化的剂量依赖性水平的实例。丝氨酸2(Ser2)上的RNA聚合酶II(RNAPII)的CDK9特异性磷酸化用适当浓度的测试化合物或作为对照的匿SO处理异步细胞(asynchronouscell)。3小时孵育(37°C/5%C02)后，用CLB-1溶解缓冲液(Z印tosense，Switzerland)使细胞溶解，藉由离心(lOmin，13000rpm，RT)净化溶解产物且使其经受SDS-PAGE。将总蛋白质印记于PVDF膜上且使用抗S2-磷酸化RNAPII(H5;Covance)或作为表达对照的总RNAPII(N-20;SantaCruz)的抗体来分析。在Odyssey系统(Licor)上使用抗小鼠或兔Fc尾的第二Alexa680或IR800偶合抗体(MolecularProbes)进行显现。定量特定条带且估算RNAPII磷酸化抑制的1(:5。值。苏氨酸927上的Eg-5的CDK1依赖性磷酸化(Thr927phos):藉由在G2/M期用25ng/mL诺考达唑(nocodazole)(最佳最终浓度)使细胞停滞隔夜，接着用作为对照的匿S0或适当浓度的测试化合物处理1小时来研究Thr927phos。收集分离以及粘附的细胞且用CLB-1溶解缓冲液溶解。藉由离心净化溶解产物且使其经受SDS-PAGE。将蛋白质印记于PVDF膜上且接着由抗总Eg-5(BectonDickinson)及Eg_5Thr927phos(Biolegend)的抗体分析。如上进行显现及ICs。的估算。丝氨酸780上的Rb的CDK4/6特异性磷酸化(Ser780phos):用适当浓度的测试化合物或匿S0处理异步生长细胞1小时。使用AllPr印RNA/蛋白质试剂盒根据制造商的介绍(Qiagen，Germany)萃取蛋白质。使用Ab05抗体(OncogeneInc.)使Rb免疫沉淀过夜。由SDS-PAGE分离蛋白质，印记于PVDF膜上且用抗总(sc_102;SantaCruz)或Ser780磷酸化Rb蛋白质(CellSignalling)的抗体分析。如上进行显现及定量。结果下列表展示化合物I或R547对CDK1、CDK4/6及CDK9抑制底物磷酸化的IC5。值。与R547对RNAPII的CDK9依赖性磷酸化的有效性低得多的抑制相比，化合物I为该磷酸化的一贯有效的抑制剂。可将该区别与如上所述的生物化学检测中所估算的CDK9活性的酶促IC5。相比，对于化合物I与R547，其介于约InM与10nM之间。化合物工R547细胞系IC5。(yM)-RNAP11磷酸化IC5。(iiM)-RNAPII磷酸化A2780约O.1约lHCT116约O.1约0.3RPMI8226约O.1约0.5Sk-mel-28约Ol约0.3Colo205约O.1约0.5MDA-MB-468约Ol约0.3相反，在Eg--5的CDK1依赖性磷酸化的效能方面，与相同检测中R547的相对一致的IC50相比，化合物I展示较高程度的可变性。该一致性展示检测本身为可靠的。在生物化学检测中，R547为比化合物I更有效的CDK1抑制剂(对CDK1的IC5。分别介于约InM与10nM之间及约10nM与50nM之间)。化合物工R547细胞系ICs。(iiM)-Eg-5磷酸化IC5(3(iiM)-Eg-5磷酸化A2780约l约0.01HCT116约3约O.1RPMI8226>1约0.05Colo205约l约0.05MDA-MB-435约0.5约O.1MDA-MB-453约l约O.1A549>1约0.03Raji>1约O.1在Rb的CDK4/6依赖性磷酸化的抑制效能方面，还可见与R547相比的效能可变性。R547为比化合物I(对CDK4及CDK6的IC5。分别为约50nM及介于约10nM与50nM之间)适当更有效的CDK4及CDK6抑制剂(对CDK4及CDK6的IC5。在两种情况下均为约10nM)。化合物工R547细胞系IC5。(iiM)-Rb-5磷酸化IC50(iiM)-Rb-5磷酸化A2780约0.5约O.1HCT116约5约O.1RPMI8226约5约0.3Sk-mel-28约3约O.1Colo205约l约O.1MDA-MB-435约3约0.3当与化合物工对细胞增殖的ICs。(如上所述的方法所确定)相比时，CDK9依赖性RNAPII磷酸化的细胞抑制的相应IC5。大致类似。相比而言，CDK1或CDK4/6底物磷酸化的IC5。的可变性大得多且在许多情况下不太有效。IC50(iiM)细胞增殖CDKlEg_5CDK4/6CDK9化合物I磷酸化Rb磷酸化RNAPII磷酸化A2780约0.1约1约0.5约01HCT116约0.1约3约5约0.1Sk-mel-28约0.3n.d.约3约01Colo205约0.1约1约0.1约0.1MDA-MB-468约0.3n.d.n.d.约01不受理论限制，这些数据表明化合物I在人类癌症的哺乳动物细胞模型中的细胞毒性活性是至少藉由抑制CDK9活性来介导，且在某些情形下伴随有CDK1、CDK4或CDK6活性的抑制减少的令人惊讶的假说。实施例E:药物组合物的选择及开发为了(i)选择最适当的活性成分形式，S卩，化合物I本身、化合物I的药学上可接受的盐或化合物I的前药来进入进一步实验中且评定其供治疗诸如癌症的病症及疾病的治疗组合物使用的适用性；(ii)选择最适当的包括所鉴别的活性成分的药物组合物及(iii)选择最适当的使用该药物组合物的适应症，收集其他数据。这些数据可包括整个一组肿瘤细胞系的增殖的体外抑制及体内动物模型的肿瘤生长抑制或减小数据及存活数据。此外，这些实验还可包括阐明和/或确定主题化合物的作用机理、主题化合物的靶或靶概况及主题化合物的其他特征，诸如化合物与靶的结合亲和力或化合物在靶上的结合位点及药代动力学性质。这些实验还可包括药物-靶相互作用的分子建模及施用后所形成的代谢物的鉴别或活性剂的鉴别。可选择展示最适当结果的活性成分和/或包括该活性成分的药物组合物进入进一步实验中，这些结果包括细胞增殖的抑制、囊括各肿瘤细胞系的范围、肿瘤生长的抑制或肿瘤减小数据和/或动物存活数据和/或其他特征(包括A匿ET、药代动力学及药效学性质)的结果。这些实验可包括例如动物中的治疗概况及毒理学实验、人类中的I期临床试验及其他临床试验。氺氺氺本领域技术人员易了解，本发明可经良好调整以执行目标且获得所提及的结果及优点以及其中固有的结果及优点。本文中所述的方法及试剂为优选实施方案的代表，为示例性的且不意为限制本发明的范畴。本领域技术人员应想到其中的修改及其他用途。所有这些明显修改及替代用途涵盖在本发明的主旨内且意为包括在随附权利要求书的范畴内。所有以上所引用的参考文献及出版物均以引用的方式并入本文中。权利要求一种化合物，其为(i)式(I)的化合物或(ii)(i)的化合物的互变异构体。FPA00001009175000011.tif2.根据权利要求1所述的化合物的药学上可接受的盐。3.根据权利要求2所述的药学上可接受的盐，其为根据权利要求1所述的化合物的盐酸盐或顺丁烯二酸盐。4.根据权利要求1所述的化合物的前药或根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐的前药。5.—种药物组合物，其包括(i)活性成分，其选自根据权利要求1所述的化合物、根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐及根据权利要求4所述的前药；及(ii)药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其经配制以用于经口施用。7.根据权利要求5所述的药物组合物，其经配制以用于静脉内施用。8.根据权利要求5至7中任一项所述的药物组合物，其包含治疗有效量的所述活性成分。9.根据权利要求8所述的药物组合物，其经配制以施用于有需要的个体。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述施用是施用于患有癌症的个体。11.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述个体为人类。12.—种包装医药产品，其包括根据权利要求5至9中任一项所述的药物组合物，及指示所述药物组合物可用于施用于有需要的个体的说明书。13.根据权利要求12所述的医药包装，其中所述说明书指示所述药物组合物可用于施用于患有癌症的个体。14.根据权利要求13所述的医药包装，其中所述个体为人类。15.—种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用(a)活性成分，其选自根据权利要求1所述的化合物、根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐及根据权利要求4所述的前药；或(b)根据权利要求5至11任一项所述的药物组合物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述个体为选自由家养哺乳动物、啮齿动物及人类组成的组的哺乳动物。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述个体为人类。18.—种杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖或生长的方法，其包括使所述肿瘤细胞与根据权利要求1所述的化合物或其盐形式接触。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤细胞为个体的恶性细胞。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述个体为选自由家养哺乳动物、啮齿动物及人类组成的组的哺乳动物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述个体为人类。22.根据权利要求18所述的方法，其中使所述肿瘤细胞在体外暴露于所述化合物或其盐形式。23.—种治疗患有与一种或多种选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7及CDK9的细胞周期蛋白依赖性激酶的活性相关的病症或疾病的个体的方法，其包括向所述个体施用(a)活性成分，其选自根据权利要求1所述的化合物、根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐及根据权利要求4所述的前药；或(b)根据权利要求5至11任一项所述的药物组合物。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述病症或疾病为癌症。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述病症与CDK9的活性相关。26.根据权利要求23至25任一项所述的方法，其中所述个体为选自由家养哺乳动物、啮齿动物及人类组成的组的哺乳动物。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述个体为人类。28.选自根据权利要求1所述的化合物、根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐及根据权利要求4所述的前药的活性成分在制备用于治疗患有癌症的个体的药物中的用途。29.—种合成根据权利要求1所述的化合物或任选地其盐的方法，该方法包括如下步骤使具有由式(II)表示的结构的化合物与具有由式(III)表示的结构的化合物反应，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中X选自-0-烷基、-0-烯基、-0-炔基、-0-酰基及卤素；及任选地使所得化合物与酸反应以制备酸式盐。30.根据权利要求28所述的方法，其中X为-OEt。31.—种合成根据权利要求2或3所述的药学上可接受的盐的方法，该方法包括使根据权利要求1所述的化合物与酸反应的步骤。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述酸为盐酸或顺丁烯二酸。全文摘要本发明提供新型吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，具体地，提供1-(吡啶-4-基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮的衍生物。该化合物为激酶抑制剂，其对细胞(包括对肿瘤细胞)展示出乎意料的抗增殖活性且在异种移植肿瘤模型中展示抗肿瘤活性。该化合物或其合适盐或前药适用于治疗患有癌症或另一增殖性病症或疾病的个体。文档编号C07D487/04GK101765600SQ200880100285公开日2010年6月30日申请日期2008年5月28日优先权日2007年5月29日发明者亚瑟·F·克鲁格申请人:阿根尼克斯股份公司