量检测试剂盒说明，测定上清液中蛋 白的相对分子量并对蛋白进行粗略定量分析。
[0054] Tricine-SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳
[0055] (1)试剂配制：
[0056] 30% T，3. 3% C母液：称取29. Og聚丙烯酰胺和1.0 g双丙烯酰胺，重蒸水溶解并 定容至100mL，贮存于棕色瓶中，4°C保存；
[0057] 10%过硫酸铵：称取LOg过硫酸铵，用超纯水溶解并定容至10mL，4°C保存1-2 周；
[0058] I. 5M Tris Buffer，pH8· 8 分离胶用（室温保存）：18· Hg Tris 加浓 HCL 调至 pH8. 8,IOOmL ;
[0059] 0· 5M Tris Buffer，ρΗ6· 8,积层胶用（室温）：6. 06g Tris 加浓 HCL 调至 ρΗ6· 8， IOOmL ；
[0060] 10%过硫酸铵：称取LOg过硫酸铵，用超纯水溶解并定容至10mL，4°C保存1-2 周；
[0061] 10% SDS(W/V) :10g的SDS粉末溶解在水里，定容到100mL。
[0062] 染色液：称取1.0 g考马斯亮蓝R250、68mL乙酸和500mL甲醇，超纯水定容至IL ;
[0063] 脱色液：量取37. 5mL乙酸，25mL甲醇，用超纯水定容至500mL ;
[0064] 电泳缓冲液：称取3. 028g Tris Base，14. 412g甘氨酸，I. 00g SDS，用超纯水定容 至1L。
[0065] (2)操作步骤：
[0066] ①样品处理：取30 μ L蛋白样品液（发酵上清液）加入30 μ L2X缓冲液（1 :1)， 沸水浴5min，-20°C保存，备用；
[0067] ②按顺序分别配制分离胶、积层胶：取20mL干净小烧杯1只，根据各种胶的浓度， 按表1依次加入各种试剂，轻轻混勾，避免产生气泡，最后加入10 %过硫酸铵和TEMED，再轻 轻混匀；
[0068] ③将混匀的凝胶液迅速、平稳地注入两层玻璃板中，留出其余胶所需的空间，然后 尽快在液面上小心注入一层水，以隔绝空气（注意尽量避免扰动胶液面），静置40-60min， 每层胶完全聚合后，吸净上层液，再灌入另外一种胶，其中最后一层胶灌至玻璃板顶端，然 后小心插入梳子，静置30-45min，待胶聚合；
[0069] ④将胶板放入电泳槽中，向内层加电泳缓冲液，直至没过内层玻璃板，小心缓慢地 取出梳子；
[0070] ⑤取一定体积处理好的样品加入到样品孔中，点样后向外层加入电泳缓冲液至玻 璃板高度一半以上；
[0071] ⑥电泳：稳压120V;
[0072] ⑦固定：将凝胶从玻璃板上取下，在固定液中固定30_40min ;
[0073] ⑧染色和脱色：倾出固定液，用去离子水漂洗1-2次，加入染色液染色40_60min ; 倾出染色液，用去离子水漂洗1-2次，加入脱色液脱色，期间更换脱色液3-4次。凝胶可在 脱色液中保存一定时间。结果如图3所示。
[0074] 表1Tricine-SDS-PAGE蛋白凝胶胶配方
[0076] (3)计算样品的相对迀移率（Rf)及分子量（MV):
[0077] (a)蛋白带相对迀移率的计算：根据weber公式
[0078] Rf = Sp/G^Gi/S
[0079] Rf :相对迀移率。
[0080] PS :样品迀移距离，样品染色带中心到分离胶上缘的距离。
[0081] S :指示剂迀移距离，指示剂色带中心到分离胶上缘的距离。
[0082] G1:染色前凝胶长度，染色前凝胶下缘到分离胶上缘的距离。
[0083] G2:脱色后凝胶长度，染色后凝胶下缘到分离胶上缘的距离。
[0084] (b)表达产物分子量的估算：
[0085] 通过标准蛋白分子量及其迀移率，建立IgMV与Rf之间的回归方程，根据重组蛋白 的Rf值计算分子量。
[0086] 对筛选出的重组毕赤酵母，经过摇瓶诱导培养48h后，将含等量总蛋白浓度的上 清液进行Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳，结果在65KD附近均出现目标条带，与预测大小相 符，而对照：X-33 (原始酵母）、S0 (以空载体pPICZ α进行电转化获得的重组毕赤酵母）均 未出现（如图3)，初步认为人的谷氨酸脱羧酶GAD65获得表达。
[0087] 实施例3 :重组菌发酵的谷氨酸脱羧酶GAD65的活性检测
[0088] 采用Western Blot鉴定融合蛋白hGAD65〇
[0089] (1)以GAD抗体阳性的糖尿病病人血清为一抗：
[0090] ① Tricine-SDS-PAGE :取摇瓶水平蛋白样品200 μ 1沉样进行 Tricine-SDS-PAGE ；
[0091] ②转印：取一张与凝胶大小相同的硝酸纤维素滤膜（NC)和6块3_的滤纸浸泡于 电转缓冲液中l〇_15min。电泳结束后，取下凝胶，切去积层胶做标记，用电转缓冲液漂洗并 平衡20min。按照以下顺序安装：阳极-海绵-3张滤纸-NC膜-凝胶-3张滤纸-海绵-阴 极。每放置一层，要去除各层之间的气泡，以免影响转移效果。用塑料支架夹紧固定上述各 层，置于电泳转移槽中并接通电源，采用恒流方式〇. SmA/cm2转移1小时；然后，将NC滤膜 取出，放置干净的滤纸上，室温干燥30-60分钟。
[0092] ③抗原抗体反应：将NC膜浸入适量的封闭液中，4°C放置过夜；以抗体稀释液清 洗NC膜2次后将其置入一塑料袋中，然后，用抗体稀释液稀释病人血清抗体至I :100-1 : 1000,封闭塑料袋，37°C放置2小时。剪开塑料袋，以PBS清洗NC膜2次，加入1:200-1 :1000 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37°C放置2小时；
[0093] ④显色：按照DAB显色试剂盒说明书，在干净的平皿中加入IOml蒸馏水，取A、B、 C溶液各5滴，混匀后加入NC膜，约3分钟后显色；
[0094] (2)以人源GAD单克隆抗体标准品为一抗：
[0095] 方法同（1)。
[0096] -抗为GAD(+)病人血清：由图4可见，用于Western Blot检测的硝酸纤维素膜经 底物显色后有一条小于66. 4KD的单一条带，其位置与重组毕赤酵母诱导表达产物的特异 性条带位置一致。
[0097] -抗为GAD65单克隆抗体：如图4,硝酸纤维素膜经底物显色后有一条小于66. 4KD 的单一条带，其位置与重组毕赤酵母诱导表达产物的特异性条带位置一致。
[0098] 以上数据说明，采用本发明方法实现了人的GAD在毕赤酵母中的活性表达。
[0099] 实施例4 :产物蛋白的纯化与蛋白浓度的测定
[0100] ⑴产物蛋白的纯化
[0101] 取实施例2得到的诱导表达产物，经离心取上清液进行蛋白纯化，收集洗脱液并 取20 μ 1进行电泳鉴定。
[0102] 纯化具体步骤：
[0103] (a)去掉镍柱上层管中储存液（20%的乙醇），IOml平衡液平衡镍柱；
[0104] (b)待平衡液流尽后，向镍柱上层管中加入样品（通过20μπι滤膜），让其自然滴 下；液体流尽后，加入IOml的平衡液，清洗杂蛋白，不需要收集
[0105] (c)洗杂结束后，先用3ml的含200mM咪唑的洗脱液洗脱收集；
[0106] (d)进行SDS-PAGE，检测洗脱目的蛋白。
[0107] (e)使用结束的镍柱，再次使用IOml的平衡进行平衡，流尽后，再用20 %的乙醇保 存。
[0108] 其中，平衡液：20mM 的磷酸盐缓冲液（NaH2P04、Na2HPO4)，500mM NaCl，20mM 咪唑， ρΗ7· 4 ;洗脱液：20mM 的磷酸盐缓冲液（NaH2P04、Na2HPO4)，500mM NaCl，200mM 咪唑，ρΗ7· 4。
[0109] 纯化产物仅在大小约为66. 4KD处有一条蛋白质条带，并且其位置与诱导表达产 物中的融合蛋白位置相一致。
[0110] ⑵蛋白浓度的测定
[0111] Bradford 法定量测 hGAD65:
[0112] 取10支试管，1支加待测样品，其余9支试管按顺序分别加入：0、2. 5、5. 0、7. 5、 10. 0、12. 5、15. 0、17. 5、20. 0 μ L标准蛋白质溶液（BSA)，每个样品准备3份。
[0113] (a)用0· 9% NaCl溶液补充溶液总体积到0· lmL。
[0114] (b)各试管中分别加入ImL Bradford工作液，2min内加完试剂，用比色皿在分光 光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值（A595)。
[0115] (c)测出A值以后，以A595值为纵坐标，标准蛋白（BSA)含量为横坐标，绘制标准 曲线。
[0116] 400ml酵母培养液表达的上清液中蛋白经镍柱纯化后共获得20ml洗脱液。以 BSA为标识物，用Bradford法测蛋白IiGAD65*度为46. Omg/ml，则每升培养液可得蛋白= 46. 0X20 + 400*1000 = 2. 36g/L。
[0117] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高效活性表达人的谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法是构建以毕赤 酵母为宿主表达核苷酸序列如SEQIDNO: 1所述的谷氨酸脱羧酶的重组菌，然后以该重组 菌发酵生产人的谷氨酸脱羧酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是将SEQIDNO: 1所述的谷氨酸 脱羧酶基因6六065连接到表达载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZa-hGAD65，然后电转入 毕赤酵母X-33菌株，使GAD65*编码序列插入酵母基因组中，筛选得到重组菌。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵是将重组菌活化后接种于BMGY 培养基培养20h，然后静置弃上清，用BMMY培养基重悬菌体并加入甲醇诱导培养。4. 一种毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主表达核 苷酸序列如SEQIDNO: 1所述的谷氨酸脱羧酶。5. 根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建：将 SEQIDN0:1所述的谷氨酸脱羧酶基因6六065连接到表达载体pPICZa上，得到重组质粒 pPICZa-hGAD65，然后电转入毕赤酵母X-33菌株，使GAD65*编码序列插入酵母基因组中，筛 选得到重组菌。6. 根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主是毕赤酵母X-33菌株。7. 权利要求4-6任一所述基因工程菌生产的谷氨酸脱羧酶。8. 权利要求7所述谷氨酸脱羧酶在制备药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌，属于基因工程技术领域。本发明将人谷氨酸脱羧酶基因GAD65与载体pPICZα连接构建表达载体pPICZα-hGAD65，电转至毕赤酵母X-33中，获得过量表达人谷氨酸脱羧酶(GAD65)的重组菌株。本发明的重组菌株经摇瓶发酵、Tricine-SDS-PAGE和Western？Blot鉴定，证实人源谷氨酸脱羧酶(GAD65)实现了诱导表达，通过对发酵上清液进行分离纯化得到融合蛋白，经过蛋白浓度测定，蛋白hGAD65浓度达到2.36g/L。
【IPC分类】C12N15/81, A61P3/10, C12R1/84, C12N1/19, C12N9/88, A61K38/51
【公开号】CN105400813
【申请号】CN201510997621
【发明人】刘立明, 罗秋玲, 刘佳
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月28日