：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
[0162] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0163] PCR扩增体系，总体积50yL:
[0164] 2XHiFi-PCR Master 25yL，引物TreS-F 2. 5yL，引物TreS-R 2. 5yL， pET15b-TreS 2. 5 y L, ddH20 17. 5 y L；
[0165] PCR扩增程序如下：
[0166] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin30s，共 30 个循环； 72°C继续延伸lOmin。
[0167] 将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将 所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续实验。
[0168] 将去掉终止密码子的CotD基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI 和Aatll酶切位点，所设计的引物序列如下：
[0169] CotD-F ：GGATCCATGCATCACTGCAGACCGCATA
[0170] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0171] 第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25 yL:
[0172] 2XHiFi-PCR Master 12. 5yL，胶回收产物CotD 2yL，胶回收产物TreS 2yL， ddH20 8.5 y L；
[0173] 第一轮融合PCR扩增程序如下：
[0174] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 4min，5 个循环；72°C继 续延伸l〇min。
[0175] 第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
[0176] 2 XHiFi-PCR Master 12. 5 yL，引物CotD-F 1 yL，引物TreS-R 1 yL，ddH20 10. 5 yL ；
[0177] 第二轮融合PCR扩增程序如下：
[0178] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 5min30s，共 30 个循环； 72°C继续延伸10min。
[0179] 同样，将克隆的PCR产物CotD-TreS使用SanPr印柱式DNA胶回收试剂盒进行胶 回收，将所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续试验。
[0180] 基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHTOl可以在枯草芽孢 杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒PHT01质粒构建表面展示系统pHTOl-CotD-TreS。
[0181] 采用BamHI和Aatll双酶切实施例1中的PCR产物CotD-TreS，胶回收后与同样 经过BamHI和Aatll双酶切的胶回收产物pHTOl质粒连接，得到整合型重组质粒命名为 pHTOl-CotD-TreS。
[0182] 重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
[0183] 将整合型重组质粒pHTOl-CotD-TreS转化到Bacillussubtilis168 (trp)，涂布 含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养 后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1 %的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液 显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆 菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯 草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotDT-01。
[0184] 表面展示CotD-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
[0185] 具体实验步骤参照实施例1。
[0186] 以CotD为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0.23U/mg，表明CotD可以作 为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
[0187] 实施例4
[0188] 以CotH为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的 制备。
[0189] 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotH基因的获得
[0190] 将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书 提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中cotH因的编码序列设计引物， 在上游和下游引物中分别引入BamHI和Xbal酶切位点，引物由生工生物工程（上海）股份 有限公司。采用宝生物工程有限公司的2XHiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆 菌基因组DNA为模板扩增CotH。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
[0191]CotH-F：GGATCCATGAAGAATCAATCCAATTTACCG
[0192]CotH-R：CGGGCTGGGTCATTCTAGATAAAATACTTA；
[0193]PCR扩增体系如下，总体积50 y L :
[0194] 2XHiFi-PCRMaster25y L，引物cotH-F2. 5y L，引物CotD-R2. 5y L，Bacillus subtilis168基因组 2. 5yL，ddH20 17. 5yL;
[0195]PCR扩增程序如下：
[0196] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，48°C退火 30s，72°C延伸IminlOs，共 30 个循环； 72°C继续延伸10min。
[0197] 将克隆得到的PCR产物CotH使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将 所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续试验。
[0198] 目的基因TreS基因的获得
[0199] 以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序 列。
[0200] 所述步骤（2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
[0201] TreS-F ：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
[0202] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0203] PCR扩增体系，总体积50 y L :
[0204] 2XHiFi-PCRMaster25yL，引物TreS-F2. 5yL，引物TreS-R2. 5yL， pET15b-TreS2. 5yL,ddH20 17. 5yL；
[0205] PCR扩增程序如下：
[0206] 95°C预变性5min ;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共30个循环； 72°C继续延伸lOmin。
[0207] 将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将 所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续实验。
[0208] 将去掉终止密码子的CotH基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI 和Aatll酶切位点，所设计的引物序列如下：
[0209] CotH-F ：GGATCCATGAAGAATCAATCCAATTTACCG
[0210] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0211] 第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25yL:
[0212]2XHiFi-PCR Master 12. 5 y L，胶回收产物CotH 2 y L，胶回收产物TreS 2 y L， ddH20 8. 5 y L；
[0213] 第一轮融合PCR扩增程序如下：
[0214] 95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸4min，5个循环；72°C继 续延伸l〇min。
[0215] 第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
[0216]2 XHiFi-PCR Master 12.5yL，引物CotH-F 1 yL，引物TreS-R 1 yL，ddH20 10.5yL ；
[0217] 第二轮融合PCR扩增程序如下：
[0218] 95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸5min30s，共30个循环； 72°C继续延伸10min。
[0219] 同样，将克隆的PCR产物CotH-TreS使用SanPr印柱式DNA胶回收试剂盒进行胶 回收，将所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续试验。
[0220] 基于大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的表达载体pHTOl可以在枯草芽孢 杆菌中高效表达重组外源蛋白。所以使用表达质粒PHT01质粒构建表面展示系统 pHTOl-CotH-TreS。
[0221] 采用BamHI和Aatll双酶切实施例1中的PCR产物CotH-TreS，胶回收后与同样 经过BamHI和Aatll双酶切的胶回收产物pHTOl质粒连接，得到整合型重组质粒命名为 pHTOl-CotH-TreS。
[0222] 重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
[0223] 将整合型重组质粒pHTOl-CotH-TreS转化到Bacillussubtilis168 (trp)，涂布 含氯霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落用接种针接在平板上。过夜培养 后，从平板上挑取单菌落点接在含有质量百分比1 %的淀粉LB平板上，继续培养，通过碘液 显色方式进行转化子鉴定。菌落自身及周围颜色为蓝色的表明重组基因插入到枯草芽孢杆 菌染色体上的淀粉酶基因中，若菌落自身及周围颜色为白色的表明重组基因没有插入到枯 草芽孢杆菌染色体上的淀粉酶基因中，鉴定为阳性的菌株命名为CotHT-01。
[0224] 表面展示CotH-TreS重组芽孢的诱导及其产海藻糖合酶酶活测定
[0225] 具体实验步骤参照实施例1。
[0226] 以CotH为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0. 08U/mg，表明CotH可以作 为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
[0227] 实施例5
[0228] 以CotG为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的 制备。
[0229] 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotG基因的获得
[0230] 将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书 提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotG因的编码序列设计引物， 在上游和下游引物中分别引入BamHI和Xbal酶切位点，引物由生工生物工程（上海）股份 有限公司。采用宝生物工程有限公司的2XHiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢杆 菌基因组DNA为模板扩增CotG。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
[0231]CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0232]CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
[0233] PCR扩增体系如下，总体积50 y L:
[0234] 2XHiFi-PCRMaster25yL，引物CotG-F2. 5yL，引物CotG-R2. 5yL，Bacillus subtilis168基因组2.5yL，ddH20 17.5yL;
[0235]PCR扩增程序如下：
[0236] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，48°C退火 30s，72°C延伸IminlOs，共 30 个循环； 72°C继续延伸10min。
[0237] 将克隆得到的PCR产物CotG使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将 所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续试验。
[0238] 目的基因TreS基因的获得
[0239] 以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶TreS的核苷酸序 列。
[0240] 所述步骤（2)中PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
[0241]TreS-F：AAATACAAATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
[0242]TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0243] PCR扩增体系，总体积50 y L:
[0244] 2XHiFi-PCRMaster25y1，引物TreS-F2. 5y1，引物TreS-R2. 5y1， pET15b-TreS2. 5y1,ddH2017. 5y1 ；
[0245] PCR扩增程序如下：
[0246] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin30s，共 30 个循环； 72°C继续延伸10min。
[0247] 将克隆得到的PCR产物TreS使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，将 所得到的DNA溶液置于-20°C保存用于后续实验。
[0248] 将去掉终止密码子的CotD基因与TreS基因融合，在上游和下游中分别引入BamHI 和Aatll酶切位点，所设计的引物序列如下：
[0249]CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0250]TreS-R：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT
[0251] 第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25y1:
[0252] 2XHiFi-PCRMaster12. 5y L，胶回收产物CotG2y L，胶回收产物TreS2y L， ddH20 8. 5yL；
[0253] 第一轮融合PCR扩增程序如下：
[0254] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退