专利名称：一种利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用生物磷酰化技术从核苷酸前体物质制备核苷酸的新方法。
背景技术：
核苷酸(NMP)是一种重要的磷酰基化合物，它参与人体代谢，促进内脏器官改进和恢复，改善骨髓造血功能，并可作为治疗癌症病毒的辅助药物。它可使白细胞过量增生，对于各种放射性物质或药物引起的白细胞下降、非特异性血小板减少等症状有良好的疗效，也用于急、慢性肝炎的治疗。四种5，-核苷酸不但能够做为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料，如可以用于合成抗病毒药物泛昔洛韦、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、恩曲他滨等。这些新合成的药物有望成为继磺胺类药物，抗生素之后的又一类新型的抗病毒，抗肿瘤药物。在食品行业中，已经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中。尤其是核苷酸在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢
疾的能力，减少腹泻的发生。
目前，核苷酸的合成方法主要有以下三种化学合成法、RNA酶解法以及生物催化法。
化学法生产核苷酸，通常是用磷酸或者焦磷酸的活性衍生物对核苷进行磷酸酯化反应。 一般常用的焦磷酸的活性衍生物有三卤氧化磷、焦磷酰氯、双-对-硝基苯焦磷酸等。另外，要得到5'-核苷酸，必须在磷酸化反应前以适当的保护基保护核苷上核糖的2，， 3'羟基。 一般采用乙酰基、卞基、异丙叉基或苯亚甲基的功能化学基团保护。工业上广泛采用核苷与三氯氧化磷在磷酸三烷基酯中反应的方法。化学法合成核苷酸经历的步骤多、路线长，立体选择性差，而且所涉及的试剂昂贵，并有一定毒性，生产成本较高。
RNA酶解法生产核苷酸是以酵母RNA为原料，利用桔青霉和金色链霉菌生产的5'-磷酸二酯酶降解RNA，生产核苷酸。其工艺流程是将酵母经稀碱或浓盐抽提后，在pH2.5下沉淀，得到RNA，再经5'-磷酸二酯酶酶解，得到四种核苷酸的混合液，将该混合物经离子交换树脂分离纯化可以得到四种核苷酸的纯品。其中磷酸二酯酶主要是通过桔青霉固体发酵生产的核酸酶Pl。它是一个胞外酶，可以直接用于水解核酸，其水解率一般在70%-85%之间)，该生产工艺简单，原料来源丰富，成本低廉，所以长期以来，我国都是以此方法进行趁苷酸的工业生产。但是四种核苷酸用途及用量各异，市场需求相
4差较大，但是该方法几乎是等量的产生四种核苷酸，给产品的销售带来了一定困难。
生物催化法合成核苷酸，就是利用微生物作为酶源，催化核苷酸的前体物质转化为核苷酸。日本协和发酵公司通过对菌种进行改良，利用尿苷酸前体物质乳清酸转化UMP，目前UMP的累积量高达28g/L(Fujio T, MaruyamaA.. Biosci Biotech Biochem, 1997， 61(6):956-959)国内只有上海师范大学和山东大学有该类化合物合成的报道，上海师范大学(钱秀萍，中国医药工业杂志，2006,37(12))采用了链霉素抗性、卡那霉素抗性和产物结构类似物抗性等作为筛选手段，对产氨短杆菌进行离子束和紫外诱变，选育出一株UMP生成能力较强的菌株，UMP的转化能力达到了2g/L，但与国际先进水平相差甚远。山东大学(ApplMicrobiolBiotechnol 2007， 76 (2) 321-328)通过对产氨短杆菌转化条件的优化使得UMP累积浓度达到了 10g/L。
但是目前只有尿苷酸有相关的报道，而其他几种重要的核苷酸类物质，譬如腺苷酸、胞苷酸等都没有利用生物催化技术合成的报道。本发明者认为目前难于实现核苷酸生物催化合成的原因主要在于1.细胞代谢途径复杂，在正常生理条件下，细胞按固有的方式分配代谢流，不能超量生产核苷酸类磷酰化合物；2.在利用腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、乳清酸等前体物质合成核苷酸的过程中，涉及到的磷酰化反应很多，但是无法建立起高效的能量再生偶联体系；3.重要中间体磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的合成过程中无法建立起高效的辅酶再生体系，致使PRPP的合成受阻；4.反应过程涉及到EMP (糖酵解途径)和HMP (磷酸戊糖途径)两条相互竞争的代谢途径代谢流的分配，无法实现代谢流的最优分配。以上问题的存在使得生物催化合成核苷酸的技术没有得到大规模的应用。
发明内容
针对以上生物合成核苷酸的问题，本发明提供了一种利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，以具有从核苷酸前体物质和糖生成核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖类化合物的水性介质中进行酶反应，产生并累积核苷酸。
本发明的关键在于
1、 本发明采用了全细胞催化技术，直接利用了细胞的自有酶系催化核苷酸的前体物质合成核苷酸，前体物质包括乳清酸、腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶，可以根据需求生产任意的核苷酸，反应体系简单，无毒，生产成本低廉。
2、 利用了吩嗪甲基硫酸盐、黄素衍生物等小分子物质改变了细胞内的辅酶(NAD/NADH、 NADP/NADPH)再生平衡，促使代谢流向目标路径转移，底物利用率得
5到提升，副产物含量减少，这使得后提取工艺相对简单容易。
3、 通过加入化学小分子效应物质如苹果酸、丙酮酸、富马酸等有机酸类和镁离子、钾离子和铵离子等金属离子，控制ATP等能量的再生速率，将ATP再生和磷酰化反应偶联起来，核苷酸的得率大幅上升。
4、 本发明通过对细胞的通透性进行预处理，改善了细胞壁的通透性，加速反应组分向微生物细胞的渗透，使得反应时间大幅縮短。
本发明采用的具体技术方案如下
一种利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，以嘌呤或嘧啶类的核苷酸前体物质和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞，通过化学小分子效应物质调控辅因子再生体系、物质能量偶联再生体系和代谢途径关键酶酶活，实现高效制备核苷酸。
其中，所述的核苷酸(NMP)是指腺苷一磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、胞苷一磷酸(CMP)，其结构式如下
amp cmp ump 。其中，所述的嘌呤或嘧啶类的核苷酸前体物质为乳清酸、腺嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。
其中，制备核苷酸的反应在水溶液中进行，反应条件为pH5 10，优选pH6 8，温度为20 50'C，优选25 4(TC，反应时间为10~40小时，优选2 12小时。
其中，核苷酸前体物质的加入量为1 100mM， PO^的加入量为0.01 2M，优选0.02 0.5M,葡萄糖的加入量为0.1 1M，微生物细胞的加入量为按湿菌体100 800g/L。
其中，所述的化学小分子效应物质为与辅因子再生相关的化学小分子物质，和与能量偶联再生体系相关的化学小分子物质，和与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子物质；其中，所述的与辅因子再生相关的化学小分子物质为吩嗪甲基硫酸盐和黄素
衍生物中的一种或几种，所述的与能量偶联再生体系相关的化学小分子物质为镁离子、钾离子、..铵离子中的一种或几种，所述的与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子物质为苹果酸、丙酮酸、富马酸中的一种或几种。其中，与辅因子再生相关的化学小分子物质使用浓度为0.01 20mM，优选0.05 5mM;与能暈偶联再生体系相关的化学小分子物质使用浓度为1 200mM，优选1 50mM;与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子物质使用浓度为0.001mM lmM，优选0.005 0.5mM。
其中，所述的微生物细胞为能够利用核苷酸前体物质合成核苷酸的微生物，包括气杆菌属、埃希氏菌属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。
其中，所述的微生物细胞优选具有较强ATP再生活性和PRPP合成活性的菌株，包括产氨短杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和白球拟酵母。
其中，所述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用如下方法进行菌体破壁处理而得，从而改变细胞膜的通透性具体包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法，超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌法。优选表面活性剂法或有机溶剂法；所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂(如聚环氧乙烷胺、曲拉通X—IOO)、阳离子型表面活性剂(如十六烷基三甲胺'溴化物)或阴离子表面活性剂(月桂酰'肌氨酸盐)，使用浓度为0.1 50g/L，优选l 20g/L的浓度使用，即表面活性剂法处理微生物细胞时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1~50g，优选加入l~20g;所述的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1 50mL/L，优选l 20mL/L的浓度使用，即有机溶剂法处理微生物细胞时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入(U 50mL，优选加入1 20mL。其它处理细胞透性的方法，如冻融法、超声波处理法、风干法等，采用先将菌株细胞处理后，再将处理好的菌株加入反应液的方式。
其中，上述生产菌株的利用形式是生产菌株细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干菌株或废酵母泥。
其中，磷酸离子可举出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等无机磷酸盐。
本发明的有益效果为
本发明所涉及的反应体系简单， 一般只需要对细胞进行一定的预处理，然后加入底物、及一定量的效应物质，即可使反应顺利进行，这使得后提取工艺相对于简单容易；本发明不仅反应条件温和，无污染，避免了化学法合成的缺点，还可以根据需求生产任意种类的核苷酸，避免了酶解生产法带来的四种核苷酸销售不平衡的缺点；本发明所加的一系列效应物质改善了能量及辅酶的再生及利用状况，使得代谢流向目标路径发生了迁移，所以代谢副产物大幅降低，产物得率也有较大提高；本发明采用的改变细胞膜透性的方法加速了反应组分向微生物细胞的渗透，使得反应时间大幅縮短，底物及其他原料(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:利用腺嘌呤合成AMP。
在容量为15L的反应槽中调制由腺嘌呤300mMol、葡萄糖1.5Mol、硫酸镁12mMo1、微球菌细胞2800克，风干处理，再超声处理20分钟，硫酸铵15mMo1，磷酸氢二钠0.3Mol，吩嗪甲基硫酸盐7.5mMol，丙酮酸0.2mMol和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于30'C低速搅拌反应4小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对AMP进行定量分析，转化液中含AMP287mM(112g)。
实施例2:利用尿嘧啶合成UMP。
在容量为15L的反应槽中调制由尿嘧啶740mMo1、葡萄糖6Mo1、硫酸镁18mMo1、产氨短杆菌细胞2700克，硫酸铵18mMo1，核黄素7.6mMo1，磷酸二氢钠0.26Mol，富马酸0.8mMo1，甲苯10毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于3(TC低速搅拌反应4小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对UMP进行定量分析，转化液中含UMP711mM(323g)。
实施例3:利用乳清酸合成UMP。
在容量为15L的反应槽中调制由乳清酸900mMo1，葡萄糖8.6Mol,枯草芽孢杆菌细胞3000克，氯化铵20mMo1，氯化镁15mMo1，磷酸二氢钠0.2Mol，吩嗪甲基硫酸盐0.8mMo1，苹果酸3mMo1，月桂酰，肌氨酸盐15g和水组成的反应液10L,用氢氧化钠调pH至6.5，于37'C条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对UMP进行定量分析，转化液中含UMP787mM(289g)。
实施例4:利用胞嘧啶合成CMP。
在容量为300L的反应槽中调制由胞嘧啶22.5Mo1，葡萄糖240Mo1，谷氨棒杆菌细胞20千克，氯化钾350mMo1,氯化镁400mMol，磷酸氢二钠6.1Mol，核黄素16mMol，富马酸50mMol，聚环氧乙烷胺350g和水组成的反应液300L，用氢氧化钠调pH至6.5，于37'C条件下低速搅拌反应10h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对UMP进行定量分析，转化液中含CMP21Mol(6783g)。
8
权利要求
1、一种利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是以嘌呤或嘧啶类的核苷酸前体物质和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞，通过化学小分子效应物质调控辅因子再生体系、物质能量偶联再生体系和代谢途径关键酶酶活，实现高效制备核苷酸。
2、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的核苷酸NMP是指腺苷一磷酸AMP、尿苷一磷酸UMP、胞苷一磷酸CMP，其结构 式如下AMP CMP UMP Q
3、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的嘌呤或嘧啶类的核苷酸前体物质为乳清酸、腺嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶。
4、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是制 备核苷酸的反应在水溶液中进行，pH5 10，反应温度为20 50°C，反应时间为10 40 小时。
5、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是核 苷酸前体物质的加入量为1 100mM， PO^的加入量为0.01 2M，葡萄糖的加入量为 0.1 1M，微生物细胞的加入量为按湿菌体100 800g/L。
6、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的化学小分子效应物质为与辅因子再生相关的化学小分子物质，和与能量偶联再生 体系相关的化学小分子物质，和与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子物质；其 中，所述的与辅因子再生相关的化学小分子物质为吩嗪甲基硫酸盐和黄素衍生物中的一 种或几种，所述的与能量偶联再生体系相关的化学小分子物质为镁离子、钾离子、铵离 子中的一种或几种，所述的与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子物质为苹果 酸、丙酮酸、富马酸中的一种或几种。
7、 根据权利要求6所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是与 辅因子再生相关的化学小分子物质使用浓度为Q.01 20mM;与能量偶联再生体系相关的化学小分子物质使用浓度为1 200mM;与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分 子物质使用浓度为0.001 lmM。
8、 根据权利要求7所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新万法，其特征是与 辅因子再生相关的化学小分子物质使用浓度为0.05 5mM;与能量偶联再生体系相关的 化学小分子物质使用浓度为1 50mM;与调节代谢途径关键酶酶活相关的化学小分子 物质使用浓度为0.005 0.5mM 。
9、 根据权利要求1所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的微生物细胞为能够利用核苷酸前体物质合成核苷酸的微生物，包括气杆菌属、埃希 氏菌属、赛氏杆菌属、微球菌属的细菌；酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母 属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的酵母。
10、 根据权利要求9所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的微生物细胞优选具有较强ATP再生活性和PRPP合成活性的菌株，包括产氨短杆菌、 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和白球拟酵母。
11、 根据权利要求l所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是所 述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用如下方法进行处理而得表面活性剂法、 有机溶剂法、冻融法，超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌法。
12、 根据权利要求11所述的利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，其特征是 所述的有透性的微生物细胞是将微生物细胞采用表面活性剂法或有机溶剂法处理而得； 所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂或阴离子表面活性剂， 使用浓度为0.1 50g/L;所述的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯， 使用浓度为0.1 50mL/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用生物磷酰化技术制备核苷酸的新方法，以嘌呤或嘧啶类的核苷酸前体物质和磷酸根离子为底物，以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体，利用有透性的微生物细胞，通过化学小分子效应物质调控辅因子再生体系、物质能量偶联再生体系和代谢途径关键酶酶活，实现高效制备核苷酸。本发明采用小分子化学效应物质调控代谢流量，改善了能量及辅酶的再生及利用状况，使得代谢流向目标路径发生了迁移，代谢副产物减少，产物得率提高；本发明采用的改变细胞膜透性的方法加速了反应组分向微生物细胞的渗透，使得反应时间缩短，底物利用率提高。
文档编号C12R1/265GK101503724SQ20091002598
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者周锡群, 应汉杰, 磊 张, 杨蕴毅, 柏建新, 欧阳平凯, 健 熊, 勇 陈 申请人:南京工业大学;南京同凯兆业生物技术有限责任公司