专利名称：制备两个基因随机重组库的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别是一种制备两个基因随机重组库的方法。
背景技术：
基因的连锁和交换定律的实质是在进行减数分裂形成配子时，位于同一条染色体上的不同基因，常常连在一起进入配子；在减数分裂形成四分体时，位于同源染色体上的等位基因有时会随着非姐妹染色单体的交换而发生交换，因而产生了基因的重组。但自然重组多发生在配对的同源染色体上，且交换重组的频率非常低，且由于存在连锁遗传现象， 自然条件下获得重组基因的种类非常有限。DNA聚合酶最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的共同性质是以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中的DNA链的3 ‘ -OH末端；催化DNA 合成的方向是5' -3'。一些DNA聚合酶具有3’ -5’或5’ -3’外切活性，不同聚合酶之间的外切活性不同，利用这种区别进行两个基因的重组，暂未见到文献报道。
发明内容
本发明根据上述领域的空白，提供一种制备随机重组基因和蛋白的方法。制备两个基因随机重组库的方法，所述两个基因命名为A基因和B基因，制备A、B 基因正向随机重组库的步骤如下(1)设计并合成以下引物A基因和B基因的正、反向引物；接头引物LApF :5’ -人工接头序列1+A的正向引物序列_3’，LBpR :5，-人工接头序列2+B的反向引物序列_3，；(2)不对称PCR制备A的反向单链模板以A基因的双链DNA为模板，PCR体系中的A基因的正向引物浓度高于A基因的反向引物，使不对称PCR主要产生A基因的反向单链；(3)不对称PCR获得B的反向单链模板以B基因的双链DNA为模板，引物为B基因的正向引物和B基因的反向接头引物 LBpR, PCR体系中反向接头引物LBpR浓度高于B基因的正向引物，使不对称PCR主要产生B 基因的反向单链；(4)单引物PCR获得A基因的正向随机长度片段以A基因的反向单链为模板，以LApF为引物，PCR体系中采用的dNIPs中还混有双脱氧三磷酸碱基核糖核苷酸中的一种，采用Taq聚合酶；⑶模板重组PCR:步骤(4)获得A基因的正向随机长度片段与步骤(3)获得的带接头序列的B基因反向单链混合，退火，延伸为完整重组双链，延伸聚合酶采用KOD聚合酶；(6)重组选扩PCR 以完整重组双链为模板，选扩引物为人工接头序列1和人工接头序列2，采用KOD聚合酶进行PCR扩增获得A、B基因正向随机重组库。所述人工接头序列内设计有用于克隆的酶切位点。步骤(6)的PCR产物经分离纯化回收得到的DNA片段克隆到载体质粒中，并转化感受态大肠杆菌。所述A基因为cry2Aa，B基因为cry2Ad，所述cry2Aa的正反向引物如下正向引物F :ATGAATAATGTATTGAATAGTGGA,反向引物R ATAAAGTGGTGGAAGATTAGTT，正向接头引物为LF :AACCTTGTAGCGCGGATCCGATGAATAATGTATTGAAT ；cry2Ad 的正向引物 F，为 ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGA，反向接头引物LR TTAGCTGGAAACGCGTCGACATAAAGTGGTGAAGATT ；重组基因选扩引物为SF :AACCTTGTAGCGCGGATCCG/SR TTAGCTGGAAACGCGTCGAC.所述不对称PCR制备cry2Aa的反向单链模板中，F与R的浓度比例为1 50 100 ；所述不对称PCR制备cry2Ad的反向单链模板中，F’与LR的浓度比例为1 50 100。步骤(4)中，退火，延伸程序如下94°C3min，60°C 3min，65°C 3min，68°C IOmin, 10°c保温。所述载体质粒指pEB，所述大肠杆菌感受态细胞指JMllO感受态细胞。上述方法制备得到的重组基因库中筛选得到的重组基因。
所述筛选采用高分辨溶解曲线系统。获得重组蛋白的方法，指对上述重组基因表达的重组蛋白进行活性测定及功能筛选，获得具有功能的重组蛋白。本发明以双脱氧末端终止法为基础，应用KOD DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶不同的3' -5'外切能力，创建了一种新的产生单交换重组体的体外随机基因重组方法，应用这种方法将两种不同的基因(cry2Aa和cry2Ad基因)进行正向重组和反向重组，得到一系列重组基因。本发明提供了两个基因(cry2Aa和cry2Ad基因)正向重组的示例，本领域技术人员依照本发明给出的技术方案，可以得出反向重组方案。并且能够举一反三得出在选用不同双脱氧核糖核酸从而得出不同的基因重组库的方法。
图1.本发明基因重组策略2.正向重组单引物PCRM :DM2000 Marker Lane 1 :cry2Aa 阳性对照 Lane 2 :cry2Aa单弓丨物PCR Lane 3 cry2Aa阴性对照
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图3.反向重组单引物PCRM :DM2000Marker Lane 1 :cry2Ad 阳性对照 Lane 2 :cry2Ad 单引物 PCR, Lane 3 cry2Ad阴性对照图4.正向重组以及重组基因选扩PCRM :DM2000 Lanel :cry2Aa正向随机单链与cry2Ad反向单链重组，Lane2 正向重组基因选扩PCR，Lane3 :cry2Aa 阴性对照图5.测序重组位点及重组次数.重组体用R1-R37表示，括号中的数字表示各个类型重组体的个数图6. HRM筛选重组体红色重组体；黑色cry2Ad (正向重组)或cry2Aa (反向重组)；白色无信号图7. cry2Aa和cry2Ad在区域l_157bp的序列比对图 8. cry2Aa 和 cry2Ad 在区域 1743_1899bp 的序列比对图9.重组类型的数目与有效碱基A或T的数目的关系图10. KOD聚合酶3' - 5'外切能力对延伸能力的影响M :DM2000 Marker ；Lane 1 :cry2Ad 阳性对照；Lane 2:引物 3'末端有一个碱基不配对；Lane 3:引物3'末端有两个碱基不配对；Lane 4:引物3'末端有三个碱基不配对图11. cry2Aa、cry2Ad以及各种重组体在大肠杆菌Rosetta中的表达图12. R23和R24三级结构对比13.重组体R25和似6的氨基酸比对图14. R25和似6三级结构对比15. R26和R27三级结构对比16. cry2Aa基因以及定点突变基因在大肠杆菌Rosetta中的表达
具体实施例方式以下通过具体实验说明本发明的技术方案。材料与试剂大肠杆菌JMllO质粒pEB，pEB2Ad(载有 Cry2Ad 基因的 pEB)，pEB2Aa (载有 Cry2Aa 基因的 pEB) 以及载有本发明获得的重组体基因的PEB质粒(其中包括载有8个定点突变体基因的pEB 质粒)，本实验室均有保存，可向公众发放用于验证试验。液体 LB :Tryptone 1%, Yeast extract 0. 5%, NaCl 1%, pH 7· 0，15 磅 20min ； 固体LB 在液体培养基中加1. 4%琼脂。氨苄青霉素，水溶液50mg/mL ；氯霉素，无水乙醇溶解，3%ig/mL。-20°C保存。酶及化学试剂KOD高保真DNA聚合酶购自博迈德，Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自北京汇天东方公司，限制性内切酶、连接试剂盒、ddNTP等购自AxygeruPromega和Τ0Υ0Β0公司，DNA回收试剂盒购自美国Axygen公司，分析纯化学试剂均为市售。
质粒提取液溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH 8. 0), IOmM EDTA (pH 8.0)；溶液11:0. 2MNa0H, 1 % SDS ；(用时现配)溶液III :3M KAc，用冰乙酸调至pH 4. 8。核酸电泳试剂10 XPCR 缓冲液500mM KCl, 15mM MgCl2, 500mM Tris-HCl (pH 8.0).TE 缓冲液=EDTA (pH 8. 0)，IOmM Tris-HCl (pH 8. 0)，ImM.IXTAE :0. OOlM EDTA(pH 8. 0) ,0. 04M Tris-乙酸.RNase溶液10mg RNase溶于ImL水，沸水浴中加热15min，_20°C保存备用。IPTG IPTG 水溶液 1M，-20 "C 保存。X-Gal :2mg X-Gal 溶于 ImL 二甲基甲酰胺，_20°C保存。标准分子量LambdaDNA/Ecol30I(bp) 19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、 421。DM2000(bp) :2000、1000、750、500、250、100。蛋白质电泳试剂3倍上样缓冲液=SDS 6g、Tris 3. 63g、甘油30mL、溴酚蓝0. 3g、巯基乙醇15mL、调 pH 6. 8定容至 100mL。30%丙烯酰胺(Acr)/甲叉丙烯酰胺(Bis)丙烯酰胺30. Og,甲叉丙烯酰胺0. Sg, 加蒸馏水至lOOmL。电极缓冲液Tris 3.03g、SDS lg、甘氨酸14. 41g、蒸馏水定容至1，OOOmL，pH
8.3 οSDS-PAGE 染色液SI 乙酸，50%乙醇，45%去离子水；SII 7. 5%乙酸，5%乙醇，87. 5%去离子水；SIII 0. 25%的考马斯亮兰R250的95%乙醇溶液。其它试剂Tris-HCl1. 5M(pH 8. 8)、Tris-HCl 1. 0M(pH 6. 8)、TEMED、SDS 10%, 0. 5MNa0H、10%过硫酸铵(用时现配)。标准蛋白分子量High Marker(kDa) :200、116、97、66、44。Low Marker(kDa) 97、66、44、29、20。仪器设备摇床D250，美国NBS公司产品；恒温培养箱DHP120，上海实验仪器总厂；台式离心机M15C，德国 Eppenddorf ；PCR 仪，美国 AmpGene 4800 ；HRM (高分辨熔点仪)，美国Idaho公司；蛋白电泳仪Mini protein III，美国 Bio-Rad 公司;凝胶成像系统fegle EyeII System，美国 STRAGENE 公司；
高速立式离心机RC-5，美国杜邦公司；核酸电泳仪，北京六一厂；P2. 5、P20、P200、P1000 μ L 移液器，德国 Eppendorf■公司；光学显微镜，日本OLYMPUS CX21 ；超声波破碎仪，科尔帕默公司750瓦超声波破碎仪。供试昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)来自本实验室提供的标准化试虫；水稻二化螟(Chilo supperssalis)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)禾口亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)，分别来自中国农科院植物保护研究所水稻害虫组、棉花害虫组和玉米害虫组提供的标准化试虫。本实验均有保存，可提供用于验证试验。表1本发明所用的引物
权利要求
1.制备两个基因的随机重组库的方法，所述两个基因命名为A基因和B基因，制备A、 B基因正向随机重组库的步骤如下(1)设计并合成以下引物A基因和B基因的正、反向引物； 接头引物LApF :5’ -人工接头序列1+A的正向引物序列-3’， LBpR :5’ -人工接头序列2+B的反向引物序列_3’ ；(2)不对称PCR制备A的反向单链模板以A基因的双链DNA为模板，PCR体系中的A基因的正向引物浓度高于A基因的反向引物，使不对称PCR主要产生A基因的反向单链；(3)不对称PCR获得B的反向单链模板以B基因的双链DNA为模板，引物为B基因的正向引物和B基因的反向接头引物LBpR， PCR体系中反向接头引物LBpR浓度高于B基因的正向引物，使不对称PCR主要产生B基因的反向单链；(4)单引物PCR获得A基因的正向随机长度片段以A基因的反向单链为模板，以LApF为引物，PCR体系中采用的dNIPs中还混有双脱氧三磷酸碱基核糖核苷酸中的一种，采用Taq聚合酶；(5)模板重组PCR步骤(4)获得A基因的正向随机长度片段与步骤(3)获得的带接头序列的B基因反向单链混合，退火，延伸为完整重组双链，延伸聚合酶采用KOD聚合酶；(6)重组选扩PCR:以完整重组双链为模板，选扩引物为人工接头序列1和人工接头序列2，采用KOD聚合酶进行PCR扩增获得A、B基因正向随机重组库。
2.根据权利要求1所述的方法，所述人工接头序列内设计有用于克隆的酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(6)的PCR产物经分离纯化回收得到的DNA 片段克隆到载体质粒中，并转化感受态大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，所述A基因为Cry2Aa，B基因为cry2Ad， 所述cry2Aa的正反向引物如下正向引物 F :ATGAATAATGTATTGAATAGTGGA, 反向引物 R ATAAAGTGGTGGAAGATTAGTT，正向接头引物为 LF :AACCTTGTAGCGCGGATCCGATGAATAATGTATTGAAT ； cry2Ad 的正向引物 F，为 ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGA， 反向接头引物 LR :TTAGCTGGAAACGCGTCGACATAAAGTGGTGAAGATT ； 重组基因选扩引物为SF :AACCTTGTAGCGCGGATCCG/SR :TTAGCTGGAAACGCGTCGAC。
5.根据权利要求4所述的方法，所述不对称PCR制备cry2Aa的反向单链模板中，F与 R的浓度比例为1 50 100 ；所述不对称PCR制备cry2Ad的反向单链模板中，F’与LR 的浓度比例为1 50 100。
6.根据权利要求4所述的方法，步骤(4)中，退火、延伸程序如下94°C3min, 60°C 3min,65°C 3min,68°C lOmin，10°C保温。
7.根据权利要求4所述的方法，所述载体质粒指pEB，所述大肠杆菌感受态细胞指 JMllO感受态细胞。
8.权利要求1 7任一所述方法制备得到的重组基因库中筛选得到的重组基因。
9.根据权利要求8所述的重组基因，所述筛选采用高分辨溶解曲线系统。
10.获得重组蛋白的方法，指权利要求8所述的重组基因表达的重组蛋白进行活性测定及功能筛选，获得具有功能的重组蛋白。
全文摘要
本发明“制备两个基因随机重组库的方法”，属于生物工程技术。以双脱氧末端终止法为基础，应用KOD DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶不同的3′→5′外切能力，创建的一种新的产生单交换重组体的体外随机基因重组方法，应用这种方法将两种不同的基因进行正向重组和反向重组，得到一系列重组基因；利用高分辨溶解曲线(HRM)系统筛选出杂合基因；进一步表达蛋白，测定活性。
文档编号C12N15/10GK102268427SQ20111018015
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者宋福平, 张 杰, 束长龙, 耿丽丽, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所