用于等温核酸扩增的材料和方法

专利名称：用于等温核酸扩增的材料和方法
用于等温核酸扩增的材料和方法对相关申请的引用本申请要求2010年I月8日提交的美国临时专利申请号61/293，372的优先权，通过提及而将其完整收入本文。
背景技术：
核酸扩增广泛用于研究、法医学、医学和农业。聚合酶链式反应(PCR)是用于体外DNA扩增的最广泛使用的方法。PCR反应通常利用与靶序列的5’和3’边界杂交的两种寡核苷酸引物和通过聚合脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)延伸退火引物以生成双链产物的DNA依赖性DNA聚合酶。通过提高和降低反应混合物的温度(称为热循环)，DNA产物的两条链被分开，并且可以充当下一轮退火和延伸的模板，并且重复该过程。在过去几年中，已经开发出不依赖于热循环的其它核酸扩增方法。这些方法由于 它们不依赖于运行温度变化的重复循环的实情而宽泛地分类为“等温靶物扩增”。一个此类例子是解旋酶依赖性扩增(HDA)。在体内，聚合酶借助于多种辅助蛋白质扩增核酸。一种此类辅助蛋白质称作“解旋酶”，其共享将核酸的双重链分成单链，然后，其可接近聚合酶进行扩增的共同特征。HAD通过利用解旋酶生成单链模板以进行引物杂交及随后聚合酶的引物延伸在体外模拟此通用方案。通过对反应混合物添加解旋酶，可以在不需要重复熔解和将引物再退火至模板的情况下继续扩增的重复轮次。因而，可以避免昂贵的热循环装置或乏味的手动热循环。另外，HAD通过具有单一反应方案并且是整个过程可以于一个温度实施的真正等温反应提供与其它等温DNA扩增相比的几个优点。一种PCR变型(称作逆转录酶PCR(RT-PCR))通常用于测量基因表达、分析样品中的RNA、和合成经修饰的互补cDNA探针、等等。在典型的方案中，具有逆转录酶活性的酶使用RNA模板生成互补的DNA链(cDNA)，然后经由PCR将其扩增。HAD也可以用于扩增cDNA，在该情况中该过程称作逆转录酶HDA(RT-HDA)。在任一种情况中，每种活性通常使用不同酶逆转录酶用于生成cDNA ；DNA依赖性DNA聚合酶用于扩增cDNA ;而在HAD的情况中，解旋酶用于生成单链模板。不幸地，酶逆转录酶可以是高度易错的，因为它们通常不拥有校对能力。此外，对反应混合物添加的每种酶增加不同最佳温度、反应条件、试剂等的潜在必要性。如此，寻找生成大量高保真性DNA的一组酶和一组条件经常是困难的任务。一种简化此任务的方式是减少牵涉的酶的数目。发明概述本文中公开了使用具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶实施靶核酸等温扩增的材料和方法。一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶等温扩增靶核酸的方法。另一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶等温扩增靶RNA的的方法。另一方面涉及使用具有切口诱导活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶等温扩增靶RNA的方法。另一方面涉及使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶的RT-HAD的方法。另一方面涉及鉴定样品中人乳头瘤病毒(HPV)的存在的方法，包括通过使用具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶检测HPV的核酸序列。又一方面涉及用于等温扩增靶核酸的试剂盒，其包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶。在另一方面，提供了用于等温扩增靶RNA的试剂盒，其包含具有解旋酶活性的酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶，并且不包含具有DNA依赖性DNA
聚合酶活性的任何其它酶。另一方面涉及用于RT-HAD的试剂盒，其中用具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶替换具有逆转录酶活性的酶或具有聚合酶活性的酶，或这两者。另一方面涉及用于测定样品中至少一种人乳头瘤病毒(HPV)的存在和/或丰度的试剂盒，其包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶。附图
简述图I显示了 PYROPHAGE 3173在一步RT-HAD中与在存在Bst聚合酶的情况下的其它逆转录酶一样有效。利用Bst聚合酶(2U)和uvrD解旋酶(IU)在25 μ I中实施扩增75分钟。使用CtRNA作为靶物。对10和100个RNA拷贝给出Thermoscript、Thermo-X,Transcriptor 和 PYROPHAGE 的测定信号(Luminex MFI)。图2显示了 PYROPHAGE 3173酶在一步等温RT-HAD中可以作为逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶运行。在25 μ L中实施扩增75分钟。反应混合物含有具有Bst (标记为Bst+的柱形)或没有添加的Bst聚合酶(标记为Bst-的柱形)的PYROPHAGE 3173 (2. 5U)。使用Ct RNA(25或100个拷贝)作为靶物。在Luminex上实施检测，并且结果以信号/噪
音呈现。图3显示了在没有Bst聚合酶的情况下使用THERM0-X、THERM0SCRIPT、TRANSCRIPT0R、和PYROPHAGE 3173的RT-HAD反应。反应条件与图2中所描述相同。图4显示了 PYROPHAGE 3173酶可以在没有Bst的情况下扩增DNA。在50 μ L中实施扩增90分钟。反应含有PYROPHAGE 3173 (5U)或Bst聚合酶(20U)。使用HPV16DNA作为具有碱变性的标准tHDA测定法的靶物。在Luminex上实施检测，并且结果以信号/噪音呈现。图5显示了扩增两种HPV 16RNA靶物的RT-HAD反应的信噪比(signal overnoise, S / N)。每个柱形代表用多个引物浓度扩增后两种靶物中每种的S / N(y-轴)。在X轴上标示引物浓度和扩增的靶物。发明详述在一方面,通过具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶实现靶核酸的扩增。作为使用DNA依赖性DNA聚合酶和/或逆转录酶的替代或者在使用DNA依赖性DNA聚合酶和/或逆转录酶外,使用具有双重活性的这种酶。
如本文中所使用的，“核酸”指双链(ds)或单链(ss) DNA、RNA分子或DNA-RNA杂合物。双链核酸分子可以是有切口的或完整的。双链或单链核酸分子可以是线性或环形的。双链体可以是平端的或者具有单链尾部。单链分子可以具有发夹或环和茎形式的二级结构。核酸可以从多种来源，包括环境、食物、农业、发酵、生物流体诸如血液、奶、脑脊液、痰、唾液、粪、肺吸出物、粘膜组织的拭子或组织样品或细胞分离。核酸样品可以自细胞、细菌或病毒获得，并且可以包括下列任一种染色体DNA、染色体外DNA，包括质粒DNA、重组DNA、DNA片段、信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、双链RNA或存在于细胞、细菌或病毒中的其它RNA。核酸可以分离、克隆或依靠化学合成在体外合成。任何上文所描述的核酸可以进行修饰，其中将核酸内的各个核苷酸化学改变(例如，通过甲基化进行)。修饰可以天然出现或者通过体外合成进行。术语“双链体”指整个或部分双链的核酸分子。如本文中所使用的，术语“靶核酸”指意图进行扩增的任何核酸序列。要扩增的靶核酸的大小可以例如，在约50bp至约IOOkb的范围中，包括高于100至5000bp的范围。靶核酸可以包含在较长的双链或单链核酸内。或者，靶核酸可以是整条双链或单链核酸。在一个实施方案中，具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶是 PYROPHAGE 3173。PYROPHAGE 3173记载于美国专利申请No. 12/089，221 (以美国专利申请公开文本No. 2008/0268498公布)，将其内容完整收录。PYROPHAGE 3173可获自LUCIGENCorporation,并且是一种具有导致高保真性扩增的固有3’ 一 5’外切核酸酶(校对)活性的热稳定性噬菌体酶。由于此活性，可以是优选的是，使用硫代磷酸酯引物和在扩增前对靶核酸模板和引物的最小暴露。或者，可以使用突变体型式，其中已经将3’ 一 5’外切核酸酶活性灭活(PYROPHAGE 3173Exo_突变体)。PYROPHAGE 3173还具有链置换活性，其容许贯穿整条双链DNA的DNA合成。它还在切口处有效地启动，并且因此，可以用引物或在通过位点特异性切口酶引入的切口处启动DNA合成。PYROPHAGE 3173还具有逆转录活性，并且如此可以在RNA模板上运行单管、单酶逆转录PCR。由于此双重活性，PYROPHAGE 3173可以在RT-HAD中作为逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶的替代使用。另外，PYROPHAGE 3173酶的较高热稳定性可以容许较高的RNA扩增率。在一个实施方案中，使用等温扩增来扩增靶核酸。“等温扩增”指于单一温度发生扩增。这不包括扩增起始时单一的短暂时间段(小于15分钟)，其可以与扩增规程于相同温度或于更高的温度进行。在一个实施方案中，等温扩增方法是RT-HAD。传统上，在RT-HAD中使用三种酶逆转录酶、解旋酶、和DNA依赖性DNA聚合酶。逆转录酶(又称为RNA依赖性DNA聚合酶)是一种具有通过聚合脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)将单链RNA(ssRNA)转录成互补单链DNA(cDNA)的DNA聚合酶活性的酶。相同的Pyrophage酶也可以聚合cDNA的“第二条链”，生成ds-DNA。这消除在自ss-RNA的ds_DNA合成的传统过程中使用两种酶(逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶)。解旋酶具有解开ds-DNA以重复(扩增)ds-DNA的上链和下链的引物依赖性DNA聚合的酶促活性。然后，DNA依赖性DNA聚合酶通过聚合dNTP将cDNA转录成互补的单链DNA。此过程自身重复，使得可以在不需要热循环的情况中于单一温度实现指数扩增。在一个实施方案中，使用提供逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的单一酶实施RT-HDA。如本文中所使用的，“HAD”指解旋酶依赖性扩增，其是一种通过使用解旋酶制备物解开双链核酸以生成扩增模板来扩增核酸的体外方法。如本文中所使用的，“解旋酶”或“有或具有解旋酶活性的酶”指能够解开双链核酸的任何酶。例如，解旋酶是存在于所有生物体及牵涉核酸的所有过程诸如复制、重组、修复、转录、翻译和RNA剪接中的酶。可以使用任何解旋酶，其沿着DNA或RNA以5 ’ 一 3 ’方向或以相反的3’一 5’方向移位。这包括自原核生物、病毒、古细菌(archaea)、和真核生物获得的解旋酶或天然存在的酶的重组形式及具有规定活性的类似物或衍生物。天然存在的DNA解旋酶的例子包括大肠杆菌(E. coli)解旋酶I、II、III和IV、Itep、DnaB、PriA、PcrA、T4Gp41解旋酶、T4Dda解旋酶、T7Gp4解旋酶、SV40大T抗原、酵母RAD。可以是有用的其它解旋酶包括RecQ解旋酶、来自腾冲嗜热菌(T. tengcongensis)和极端嗜热菌(T. thermophilus)的热稳定性UvrD解旋酶、来自水生栖热菌(T. aquaticus)的热稳定性DnaB解旋酶、和来自古细菌和真核生物体的MCM解旋酶。在另一个实施方案中，解旋酶是一种热稳定性解旋酶。可以通过在包括例如范围为45。C至75° C的较高温度的温育条件下使用热稳定性解旋酶制备物加速核酸双链体的变性。于较高温度使用热稳定性解旋酶制备物和热稳定性聚合酶实施HAD可以提高引物 结合的特异性，这可以改善扩增的特异性。在又一个实施方案中，在扩增反应中使用多种不同酶解旋酶。多种解旋酶的使用可以在不同解旋酶协调各种功能以提高双链体核酸的解开效率的某些条件下提高HAD中靶物扩增的产率和长度。例如，可以组合具有低的持续合成能力，但是能够熔解平端DNA的解旋酶与具有较大持续合成能力，但是识别在启动解开的双链体区边界的单链尾部的第二解旋酶。在此例子中，第一解旋酶最初分开长的核酸双链体的平端，生成5’和3’单链尾部，然后由于其有限的持续合成能力而自所述底物分开。随后，此部分解开的底物被第二解旋酶识别，然后，所述第二解旋酶以卓越的持续合成能力继续解开过程。这样，可以通过使用含有多种解旋酶的解旋酶制备物解开核酸双链体中的长的靶物，随后在HAD反应中扩增。在又一个实施方案中，辅助蛋白包含在反应混合物内。“辅助蛋白”指能够刺激解旋酶活性的任何蛋白质。例如，大肠杆菌MutL蛋白是一种用于增强UvrD解旋酶活性的辅助蛋白。辅助蛋白与选定的解旋酶一起是有用的。然而，可以在没有辅助蛋白的情况中通过解旋酶实现核酸的解开。在另一个实施方案中，至少一种单链结合蛋白(SSB)包含在反应混合物内。中温解旋酶在存在SSB的情况下显示改善的活性。在这些情况中，SSB的选择一般不限于特定的蛋白质。单链结合蛋白的例子是T4基因32蛋白、大肠杆菌SSB、T7gp2. 5SSB、噬菌体phi29SSB及这些蛋白质的截短形式。如此，在某些实施方案中，可以对扩增反应添加一种或多种SSB。在又一个实施方案中，提供了至少一种辅因子。“辅因子”指解旋酶解开活性需要的小分子剂。解旋酶辅因子包括核苷三磷酸(NTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)和镁(或其它二价阳离子)。例如，ATP (三磷酸腺苷)可以以范围为O. I至IOOmM,且优选地范围为I至IOmM(例如3mM)的浓度作为UvrD解旋酶辅因子使用。类似地，dTTP (脱氧胸苷三磷酸)可以在范围I至IOmM (例如3mM)中作为T7Gp4B解旋酶的辅因子使用。在又一个实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶以序列依赖性扩增转录cDNA。“序列依赖性合成”或“序列依赖性扩增”指借助于靶物特异性引物相对于存在于样品中的非靶序列扩增靶序列。如本文中所使用的，“靶物特异性引物”指能够结合靶核酸上预先确定的单链区以便于要选择性扩增的靶核酸的聚合酶依赖性复制的单链核酸。在一个实施方案中，使用靶物特异性引物对(一条与靶序列的5’侧翼杂交，而另一条与靶物的3’侧翼杂交)来实现靶序列的指数扩增。在另一个实施方案中，可以在单一反应中利用多对靶物特异性引物以在多重反应中使用不同检测标签同时扩增多种靶物。通常在单核苷酸多态性(SNP)分析及检测病原体中使用多重化(multiplexing)。一般地，合适的靶物特异性引物对是短的合成的寡核苷酸，例如，其具有10个或更多个核苷酸且小于50个核苷酸的长度。靶物特异性、寡核苷酸引物设计牵涉多种参数诸如基于串的比对得分、熔解温度、引物长度和GC含量。在设计靶物特异性引物时，重要的因素之一是选择靶片段内对要扩增的核酸分子特异性的序列。另一个重要的因素是计算反应的靶物特异性引物的熔解温度。通过所述寡核苷酸的长度和GC含量测定靶物特异性引物的熔解温度。优选地，引物的熔解温度比会发生引物杂交和靶物扩增的温度高约10至
30。Co“弓丨物杂交”指寡核苷酸引物在引物仅特异性结合一条模板链上的其互补序列的条件下结合单链核酸模板的某个区域(不是模板中的其它区域)。可以通过寡核苷酸引物的长度、实施杂交反应的温度、离子强度、和反应混合物的PH影响杂交的特异性。每条靶物特异性引物与靶核酸的每个末端杂交，并且可以使用靶核苷酸序列作为模板通过聚合酶以3’ 一 5’方向延伸。为了实现特异性扩增，同源的或完全匹配的靶物特异性引物是优选的。然而，靶物特异性引物可以包含与靶核苷酸序列不互补的5’端引物。或者，靶物特异性引物在任何部分可以含有与靶核酸不完全互补的核苷酸或序列。靶物特异性引物可以包含任何脱氧核糖核苷酸碱基A、T、G或C和/或一种或多种核糖核苷酸碱基A、C、U、G和/或一种或多种经修饰的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，其中该修饰不阻止引物与核酸杂交或靶物特异性引物延长或双链分子变性。可以用化学基团诸如硫代磷酸酯或膦酸甲酯或者用非核苷酸接头修饰靶物特异性引物以增强其性能或者便于表征扩增产物。一般地，适合于容许靶物特异性引物-模板识别的特异性及随后退火的变性温度可以存在于某个温度范围里，例如0° C至75° C。可以依照为熔解过程选择的解旋酶选择优选的变性温度。可以通过常规实验通过改变反应混合物的温度并使用凝胶电泳比较扩增产物确定用于测定在存在选定的解旋酶的情况中扩增核酸的最佳温度的测试。靶物特异性引物可以进行修饰，诸如荧光或化学发光标记、和生物素化(例如，荧光标签诸如羧基荧光素的胺反应性荧光素酯)。其它标记方法包括放射性同位素、生色团和配体诸如生物素或半抗原，其虽然不直接可检测，但是可以通过与其特异性结合配偶体，例如分别为亲合素和抗体的标记形式反应容易地检测。可以使用此类修饰检测扩增产物。“熔解”、“解开”、或“变性”指分开核酸双链体的两条互补链的整个或部分。在又一个实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶以不依赖于序列的扩增转录cDNA。如本文中所使用的，“不依赖于序列的扩增”指通过不扩增特定序列的DNA依赖性DNA聚、合酶实施的任何扩增。作为例子而非限制，可以使用随机引物混合物或切口诱导剂来启动不依赖于序列的扩增。
如本文中所使用的，“随机引物混合物”指短的随机生成的寡核苷酸序列的混合物。如本文中所使用的，“切口启动的聚合酶活性”指由模板中的单链断裂启动的在没有外源引物的情况中的聚合酶活性。合成在DNA中的单链断裂处，而不是在外源合成引物的末端启动。凭借切口启动的合成，引物的除去是不必要的，这降低成本、加工时间和损失或降解产物的潜力。另外，切口启动的合成降低由引物的自身延伸引起的假扩增信号。切口可以通过使用在识别序列处产生切口的酶在限定位置处引入，或者可以在靶多核苷酸中随机引入。如本文中所使用的，“切口诱导剂”指在双链核酸的一条链中的两个相邻核苷酸间的磷酸二酯键中引入断裂的任何酶促或化学剂或物理处理。切口诱导酶的例子包括BpulOI>BstNB I,Alw I.BbvC I.BbvC I,Bsm I、BsrD、和大肠杆菌内切核酸酶I。在一个实施方案中，至少一种切口诱导酶作为解旋酶的替换包含在反应混合物中。在另一个实施方案中，在至少一种解旋酶外，将至少一种切口诱导酶添加至反应混合物。在合适的情况中，其它扩增反应组分可以包括缓冲液、生物分子、盐、尿素、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、镁、拓扑异构酶、辅助蛋白、变性剂、辅因子、或其混合物。在引物启动的扩增是期望的时，将引物添加至扩增反应组分。 添加脱氧核糖核苷酸三磷酸dNTP (即，dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，其用于建造DNA的新链。添加ATP或TTP作为能源。ATP或TTP是高度持续解旋酶的一种通常优选的能源。DNA解旋酶解开I至4个碱基对消耗平均I个ATP分子。为了扩增较长的靶物，与较短的靶物相比，可以消耗更多ATP。在这些情况中，可以期望包括与解旋酶一起使用的基于丙酮酸激酶的ATP再生系统。如此，在某些实施方案中，可以对扩增反应组分添加ATP或TTP或组合或基于丙酮酸激酶的ATP再生系统。可以在长的HAD反应中使用拓扑异构酶以提高HAD扩增长靶物扩增子的能力。在通过解旋酶分开非常长的线性DNA双链体时，拓扑异构酶的旋转(松弛)功能消除扭曲并阻止过卷(over-winding)。例如,可以使用大肠杆菌拓扑异构酶I通过将切口引入一条DNA链中松弛负超螺旋的DNA。DNA促旋酶(拓扑异构酶II)将瞬时双链断裂引入DNA中，容许DNA链彼此穿过。如此，在某些实施方案中，可以对扩增反应添加拓扑异构酶或促旋酶，或这两者。在又一个实施方案中，可以通过多种方法，包括溴化乙啶染色和依靠标记物，诸如但不限于放射性标记物、突光标记物、和酶检测扩增序列来检测扩增的核酸产物。例如，可以使用突光标记的LUX引物(Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.)(其是设计为具有接近发夹结构中3’端的荧光团的寡核苷酸)实时检测HDA扩增的产物。此构型在没有分开的淬灭模块的情况中固有地给予荧光淬灭能力。在引物被掺入双链扩增产物中时，将荧光团去淬灭，导致荧光信号的显著升高。本公开内容还涵盖包含具有解旋酶活性的酶和具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶的试剂盒。试剂盒可以进一步包含扩增反应组分，其选自但不限于下列一种或多种dNTP、ATP、TTP、引物、镁、拓扑异构酶、SSB蛋白、辅助蛋白、变性剂、聚乙二醇、辅因子、或其混合物。又一个实施方案涉及包含作为等温扩增靶物的核酸的混合物。核酸靶物可以是ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、RNA-DNA杂合物、或任何上述物质的混合物。包含靶核酸的混合物还包含至少一种具有解旋酶活性的酶和至少一种具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶。包含靶核酸和酶的混合物还可以包含先前所描述的一种或多种扩增反应组分。另一方面是通过所描述的扩增方法获得的扩增核酸。扩增核酸可以是DNA或RNA。在另一方面，提供了使用等温逆转录酶/扩增反应检测HPV RNA的试剂盒，其中该试剂盒包含至少一种具有逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的酶。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种具有选自下组的活性的酶解 旋酶活性和切口诱导活性。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种具有解旋酶活性的酶和至少一种具有切口诱导活性的酶。试剂盒可以进一步包含进行期望的扩增必需的其它试剂，包括但不限于缓冲液；生物分子；盐；尿素；二甲基亚砜(DMSO);聚乙二醇(PEG);镁；拓扑异构酶；促旋酶；辅助蛋白；变性剂；辅因子；dNTP ；ATP ；TTP ;序列特异性引物组，包括但不限于未标记的引物和经标记的引物，诸如生物素化的引物和LUX引物；和随机引物。如使用的，术语“包括”包括“基本上由…组成”和“由…组成”。
实施例实施例I :使用PYROPHAGE 3173作为RT-HAD中RT酶的替换PYROPHAGE 3173DNA 聚合酶与 Transcriptor 和 Thermoscript 逆转录酶相比具有几个优点。例如，已知Thermoscript和Transcriptor于65° C在HAD缓冲液中具有有限的活性。测试PYROPHAGE 3173DNA聚合酶以测定它是否可以在一步等温RT-HAD扩增中替换这些逆转录酶。简言之，创建25 μ L反应混合物，其包含(1)0、10、或100个拷贝的在体外转录、合成的RNA,其包含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)隐蔽性质粒RNA (ct-RNA) (GenBank登录号 X06707) (SEQ ID NO: I) ； (2)正向引物 5’-ATC GCA TGC AAG ATA TCG AGT ATGCGT-3，(SEQ ID NO:2)和反向引物5’-CTC ATA ATT AGC MG CTG CCT CAG AAT-3，(“ct-orf引物”)(SEQ ID NO: 3) ； (3) 2. 5 个 U 的 Thermoscript、Thermo-X、Transcriptor、或Pyrophage 3173 ; (4) 2个U的Bst聚合酶；和(5) I个U的uvrD解旋酶。于65。C实施扩增75分钟。反应混合物含有表I中所列的终浓度的试剂。如可以在图I看出的，PYROPHAGE3173与其它RT酶一样好地实施扩增。
试剂__终浓度_
Tris-HCl 20 mM
_5]KCl__IOmM_
MgSOq4 mM
NaC丨40 mM_
............dNTP I 0.4 mM
dMP I 3mM_

表 I
实施例2 :使用PYROPHAGE 3173作为RT和DNA依赖性DNA聚合酶两者的替换测试PYROPHAGE 3173DNA聚合酶以测定它是否可以替换在一步等温RT-HAD扩增中的逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶两者。简言之，创建25 μ L反应混合物，其包含(I) 0、25、或 100 个拷贝的 ct-RNA ;(2)ct_orf 引物；(3) 2. 5 个U 的 Pyrophage 3173 ;(4)0 个U或2个U Bst聚合酶；和(5) I个UuvrD解旋酶。反应混合物含有表I中所列的终浓度的试剂。于62° C或65° C实施扩增75分钟。在图2显示结果。如可以看到的，PYROPHAGE3173能够替换在一步等温RT-HAD中的逆转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶两者。还在没有不同DNA依赖性DNA聚合酶的情况下实施RT-HAD的能力方面比较PYROPHAGE 3173DNA聚合酶与具有逆转录酶活性的其它酶。简言之，创建25yL反应混合物，其包含(I) O、25、或100个拷贝的ct-RNA ； (2) ct-orf引物；(3) 2. 5个U的Thermoscript、Thermo-X> Transcriptor、或 Pyrophage3173 ;和(4) I 个 U 的 uvrD 解旋酶。于65° C实施扩增75分钟。通过Luminex检测，如在实施例I中的。结果在图3显示。与 PYROPHAGE 3173形成对比，其它逆转录酶对于RT-HAD不是Bst聚合酶的有效替代物。在省略Bst聚合酶时，对利用Thermo-X、Thermoscript或Transcriptor的RT-HAD反应观察到很少的测定信号或无测定信号。仅PYROPHAGE 3173能够在没有Bst聚合酶的反应中产生信号。实施例3 :使用PYROPHAGE 3173进行DNA扩增靶物扩增.使用HPV16DNA作为HAD测定法中的靶DNA。将双链DNA靶物在5 μ I
O.IM NaOH中于65° C变性10分钟。然后，添加等体积的O. 2Μ Hepes以中和变性的靶物。将15 μ I预混合物和25 μ I扩增混合物添加至靶物，并于65° C温育I. 5小时。表2中列出了预混合物和扩增混合物组分。
扩增子检测.将HAD产物(5 μ L)转移至U底杂交板，然后在5 μ I IX变性试剂(Digene HC2DNR, Qiagen Gaithersburg, Inc. , Gaithersburg, MD)中稀释。然后，将板密封，并以IlOOrpm在Digene摇动器中摇动30秒,并于室温温育15分钟。添加杂交稀释剂(5 μ IIX hc2 探针稀释剂，Qiagen Gaithersburg, Inc. , Gaithersburg, MD),并将板再密封，并以IlOOrpm在Digene摇动器中摇动30秒。将与扩增子具有互补寡核苷酸的Luminex珠混合物(IX TE中的10 μ I)添加至每孔(3000个珠/孔)，将板再次密封，并于50° C温育30分钟，期间在黑暗中摇动。添加链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(Moss Corp.)(在PBS中稀释至12. 5ng/ μ I的10 μ I),并将板再次密封,并在防光的Digene摇动器中以IIOOrpm摇动5分钟。然后，添加磷酸盐缓冲盐水(150 μ I)，将板再密封，并以800rpm摇动I分钟。使用Luminex 100和Luminex I. 7软件测定中值荧光强度(MFI)。在图4显示结果。高于背景水平的MFI与DNA靶物的存在相关联。实施例4 :使用一步RT-HAD检测两种HPV 16mRNA序列使用与HPV 16E6-7基因和HPV 16L1基因对应的合成的、体外转录的RNA作为靶物。每个反应中包含25或250个拷贝的每种靶核酸。如实施例2中那样运行一步等温RT-HAD反应，其使用表3中所列的引物替换Ct-orf引物进行。以终浓度75mM使用反向引物，而正向引物浓度是35禮、401111、451111、501111、或551111。在图5显示结果。各25个拷贝的两种HPV 16RNA的检测对于RT-HAD反应是稳健的。此实验中的最佳引物浓度是75mM每种反向、生物素化的引物和40或45mM每种正向引物。S/N的变异系数(n=3)对于这些反应是
权利要求
1.一种用于等温扩增靶核酸的方法，该方法包括所述靶核酸与反应混合物起反应，所述反应混合物包含 a)具有解旋酶活性的第一酶；和 b)第二酶，其具有 1.逆转录酶活性；和 ii.DNA依赖性DNA聚合酶活性。
2.权利要求I的方法，其中所述靶核酸选自下组dsDNA、dsRNA、ssDNA、或ssRNA。
3.权利要求I或权利要求2的方法，其中所述具有逆转录酶活性的第二酶是PYROPHAGE 3173。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述靶核酸是HPV核酸。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述反应混合物进一步包含靶特异性核酸引物。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述反应混合物包含随机引物。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述反应混合物进一步包含拓扑异构酶或促旋酶。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述靶核酸是靶RNA，且所述第二酶通过包括逆转录反应的方法将所述靶RNA转化成靶DNA。
9.权利要求8的方法，其进一步包括扩增反应，其中所述第二酶扩增所述靶DNA。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述反应混合物包含 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ； d.NaCl ； e.dNTP ；f.dATP ;和 g.引物组。
11.权利要求10的方法，其中所述引物组选自下组靶特异性核酸引物组和随机引物组。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述引物组包含选自下组的引物SEQIDNO:2 到 SEQ ID NO:7。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其进一步包括自样品分离所述靶核酸。
14.权利要求13的方法，其中通过如下方法自所述样品分离所述靶核酸，所述方法包括 a.生成包含所述靶核酸的DNA= RNA杂合物； b.将所述DNA= RNA杂合物结合至固相；并 c.自所述样品分离结合至所述固相的所述DNA:RNA杂合物。
15.权利要求14的方法，其中所述DNA= RNA杂合物结合至抗DNA = RNA抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗DNA= RNA抗体结合或适合于结合至所述固相。
17.权利要求13的方法，其中在扩增所述靶核酸前自所述样品纯化所述靶核酸。
18.权利要求13的方法，其中在扩增所述靶核酸后自所述样品纯化所述靶核酸。
19.一种试剂盒，其包含 a)具有解旋酶活性的第一酶；和 b)第二酶，其具有 i.逆转录酶活性；和 ii.DNA依赖性DNA聚合酶活性。
20.权利要求19的试剂盒，其进一步包含至少一种选自下组的组分 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ； d.NaCl ； e.dNTP ； f.dATP ； g.促旋酶； h.拓扑异构酶； i.引物组； j.核酸探针； k.抗DNA = RNA杂合物抗体；和 I.固相， 其中任选地，每种组分是储备溶液的组分。
21.权利要求19或权利要求20的试剂盒，其包含核酸探针、抗DNA:RNA杂合物抗体、和固相，其中 a.所述抗DNA:RNA抗体适合于结合至所述固相或结合至所述固相；或 b.所述核酸探针适合于结合至所述固相或结合至所述固相。
22.权利要求19-21中任一项的试剂盒，其包括包含KCl和TrisHCl的储备退火缓冲液。
23.权利要求22的试剂盒，其中配制所述退火缓冲液，使得可稀释至IOmMKCl和20mMTris-HCl的终浓度。
24.权利要求19-23中任一项的试剂盒，其中所述第二酶是PYR0PHAGE3173。
25.一种混合物，其包含 a.靶核酸； b.具有解旋酶活性的第一酶；和 c.第二酶，其具有 i.逆转录酶活性；和 ii.DNA依赖性DNA聚合酶活性。
26.权利要求25的混合物，其进一步包含至少一种选自下组的组分 a.KCl ；b.TrisHCl ； c.MgSO4 ；d.NaCl ； e.dNTP ； f.dATP ； g.促旋酶； h.拓扑异构酶； i.引物组； j.核酸探针； k.抗DNA = RNA杂合物抗体；和 I.固相。
27.权利要求25或26的混合物，其包含核酸探针、抗DNA= RNA杂合物抗体、和固相，其中 a.所述抗DNA:RNA抗体适合于结合至所述固相或结合至所述固相；或 b.所述核酸探针适合于结合至所述固相或结合至所述固相。
28.权利要求25-27中任一项的混合物，其包含水溶液中的下列组分a.IOmM KCl ；b.20mM Tris HCl ；c.4mM MgSO4 ；d.40mM NaCl ；e.0. 4mM dNTP ；f.3mM dATP。
29.权利要求25-28中任一项的混合物，其中所述第二酶是PYR0PHAGE3173。
30.通过权利要求1-18中任一项的方法获得的扩增核酸。
全文摘要
本发明公开了一种用于等温扩增靶核酸序列的方法。通过具有解旋酶活性的酶和具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶扩增靶核酸。还公开了用于等温扩增靶核酸序列，包括HPV核酸的试剂盒。该试剂盒包含具有解旋酶活性的第一酶和具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性两者的第二酶。
文档编号C12Q1/68GK102791884SQ201180013177
公开日2012年11月21日 申请日期2011年1月7日 优先权日2010年1月8日
发明者A.福尔布莱特, B.洛维 申请人:奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司