存活、迀移以及分化成产髓磷脂的少突神经胶质细胞和星形细胞的特征。这些研究一起证实了，按照本发明方法制造的GRP成功地整合、分化成少突神经胶质细胞和星形细胞，并使脑和脊髓的脱髓鞘神经组织中的轴突重新形成髓鞘。
[0046]因此，本发明还涉及用于使用按照本发明制造的GRP细胞在哺乳动物体内产生星形细胞和少突神经胶质细胞并在患有与神经元脱髓鞘相关的疾病、障碍、损伤或损坏的哺乳动物中增加神经元的髓鞘重新形成的方法。使用本技术领域的专业神经外科医生熟悉的导管或针，通过包含一次或多次注射的直接实质移植，可以施用在I万和I亿之间的细胞。这些移植可以在通过使用颅穿洞术或椎板切除术直接接近神经组织后执行。可选地，可以由本技术领域的专业介入放射科医生，通过CT引导的经皮递送方法不需直接目测接近神经靶组织而将移植物导入脊髓中。此外，可以通过例如腰椎穿刺术或其它适合的方法将细胞施用到脑脊液(CSF)而不是直接施用到实质。对于某些疾病来说，施用细胞也可以通过静脉内施用。最后，对于这些疾病，使用其它神经细胞类型的几个临床试验目前正在进行之中。在这些使用其它神经细胞的临床试验中所使用的类似流程和程序可以由本技术领域的专业人员通过常规改造以用于按照本发明制造的GRP。
[0047]证实了根据本发明制造的人GRP在异种移植到体内神经胶质行为模型战栗小鼠(Nave，J.Neurosci，Res.1994 38:607-612)的脑中时的存活、迀移、增殖和分化。战栗小鼠具有常染色体隐性突变，所述突变导致这些小鼠不能产生髓磷脂碱性蛋白(BP)。战栗小鼠CNS中所形成的内源性少突神经胶质细胞不能装配起密实的髓磷脂(Pri vat等，Neurosc1.Lett.1979 12:107-112)。为了使移植存活率最大化，开发了一种战栗小鼠品系，所述小鼠品系还携带了产生成熟的8和1'淋巴细胞所必需的蛋白的编码基因Rag2的常染色体隐性突变，并因此表现出细胞介导的免疫缺陷(Shinkai等，Cell 1992 68:855-867)。在靶向室下区的单一位点处，向新生的双纯合战栗/rag免疫缺陷小鼠移植100，000个人GRP。在移植后8或12周，将动物处死，并通过免疫细胞化学评估人GRP及其后代的存活和分布。人细胞的广泛分布证明了人GRP在该遗传免疫缺损模型中存活和迀移的能力。使用6DIV和20DIV GRP两者，在战栗/rag2小鼠中观察到了类似的体内存活、迀移和分化结果。
[0048]在来自这些小鼠的脑切片中，通过免疫细胞化学方法评估了人GRP的体内分化潜力。一组小鼠在移植后第8周处死，而另一组出于人道原因在神经退化导致显著的行动受损和频繁的持续抽搐发作时(典型为出生后12至18周)处死。将脑切片用抗髓磷脂碱性蛋白(MBP;在战栗小鼠中没有观察到由该抗体识别的完整MBP的表达，因此MBP表达只来自于移植的人GRP)和抗人GFAP抗体(其不识别鼠GFAP)染色。尽管不能对星形细胞和少突神经胶质细胞的数量进行定量，但是通过在处死后测量MBP和GFAP体内免疫反应性的面积，证实从人GRP产生了这两种细胞类型。这些数据详细描述了本发明的人GRP分化成适合的细胞表型的能力。
[0〇49 ]使用针对在大多数神经元中表达的蛋白NeuN以及人核抗原(HuNA)的抗体，还执行了脑切片的双重染色。这些数据从用于确定MBP和GFAP表达的相同动物收集。在8周时处死的动物中，人GRP集中在胼胝体附近，并观察到小于0.3 %的HuNA/NeuN双阳性细胞。这些细胞分化成神经胶质而不是神经元的能力与在神经变性疾病中的应用有关，在所述神经变性疾病中，当使用神经干细胞(其产生神经元和神经胶质两者)作为细胞疗法时，报道了伴有痛觉异常样过敏的异常轴突萌生(Hof stetter等，Nat.Neurosc1.2005 8: 346-353;Macias等，Exp.Neuro1.2006 201:335-348)。
[0050]还在大鼠中评估了人GRP在脊髓内施用后的细胞存活和分布。将IyL体积中的6万(60,000)个人GRP移植到处于C-4水平的12只无胸腺大鼠的脊髓中。在三个时间点(移植后
1、4和12周)的每个时间点处死4只动物。在处死时将动物用聚甲醛灌注，收获它们的脊髓，并使用横切片的HuNA抗体染色分析1-cm颈髓中人GRP的存在。在用人细胞移植的无胸腺大鼠的脊髓中，在移植后1、4和12周后没有检测到增殖性团块。在4和12周时间点时观察到移植的人细胞的存活。人GRP存在于脊髓的整个横截面上，在执行注射的背柱中观察到最大的细胞密度。在移植后I周时的4只动物中的I只以及在移植后4和12周时的4只动物中的4只，在尸检后有人GRP存在。在4周时，所分析的约2/3的切片具有人GRP(0.63-cm的头尾向范围)；并且在12周时，所分析的所有切片具有人GRP(l-cm的头尾向范围)。
[0051]确定了按照本发明方法制备的人GRP在使用两种不同细胞剂量脊髓内施用后的细胞存活和分布。在移植后28天，通过肉眼尸检没有检测到脊髓异常。使用HuNA和K1-67抗体进行的免疫细胞化学分析揭示，在800，000或1，200，000个总人61^/动物的任一剂量下，在无胸腺大鼠的脊髓中没有增殖性团块。人GRP存在于脊髓的整个横截面上，在执行注射的背柱中观察到最大的细胞密度。在用800，000个总细胞注射的动物中，他嫩/灯-67的共定位非常低，并且在所分析的整个Ι-cm脊髓区段上，在所有用HuNA抗体染色的切片中检测到人GRP。在用I，200，000个总细胞注射的大鼠的脊髓中，人GRP细胞密度太高而不能人工计数；然而，HuNA/K1-67共定位的目测评估与在低剂量动物中观察到的相似。
[0052]已建立了用于在Lewis大鼠的脊髓上诱导局灶性炎性脱髓鞘病损的条件。该动物模型模拟人类中的横贯性脊髓炎的病理，并被用于确定移植的按照本发明产生的人GRP在诱导的局灶性脱髓鞘病损附近存活的能力。该大鼠模型基于已发表的模型(Kerschensteiner等，Am.J.Pathol.2004 164:1455-1469)，并对其进行改良以更可靠地诱导局灶性炎性脱髓鞘的临床和组织学迹象。用悬浮在弗氏不完全佐剂中的髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫接种成年Lewis大鼠，在10天后，进行T9椎板切除术并注射肿瘤坏死因子α、白介素6、干扰素α和溴化乙锭(EtBr)的混合物。在混合物注射后4天，在Lewis大鼠背柱中观察到局灶性炎症。在细胞因子和EtBr注射后10-14天，活动性炎症得到极大的缓解;然而，该区域广泛的脱髓鞘持续存在。在移植后3、8和14周时检测到移植入该区域中的人GRP，头尾向范围长达13_，表明它们能够在脱髓鞘的病损中存活。
[0053]还评估了按照本发明产生的人GRP在模拟多发性硬化症的炎性环境中的存活。将Dark Agouti雌性大鼠(体重150-175克)在尾基处用不完全弗氏佐剂中的10-mg MOG注射。大鼠在免疫接种后10-12天时发生临床疾病(EAE分值为2.5-3.0;后肢轻瘫)。从移植人GRP细胞的前两天开始，并且在此后每天用10-mg/kg的环孢素A IP注射大鼠。在胸位(T8-T9)处执行椎板切除术，并且每只动物接受单次注射，将2-yL盐水中的约150,000个人GRP注射到背柱中。动物在出现疾病症状后第2或7天用人GRP移植。在移植后I周、2周和4周时处死动物。使用HuNA抗体在靠近移植位点的脊髓的40-μπι横切片中检测到移植的人GRP细胞。使用0X42抗体检测在炎性应答期间出现的宿主激活的小神经胶质细胞表面上的CDllb。使用苏木精和曙红(H&E)染色来确定巨噬细胞和小神经胶质细胞浸润。在移植后I周时，HuNA染色紧密定位于使用0X42的免疫染色。注射位点周围的显著H&E染色也表明宿主的巨噬细胞和小神经胶质细胞浸润。到移植后2周时，不再观察到HuNA与0X42染色的共定位，但仍能观察到H&E染色，尽管不太显著。在疾病发生后2天和7天时注射后，移植的人GRP均能在DA/EAE大鼠脊髓中存活长达12周，即所评估的最长时间点。因此，人GRP能够在模拟在人类多发性硬化症的炎性病损中存在的条件的条件下存活。
[0054]本文中证实的按照本发明制造的GRP细胞在神经胶质细胞相关的神经变性疾病或障碍的多种动物模型中的功效，表明它们在治疗或减轻