能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗CεmX抗体的制作方法
【专利说明】能与人B淋巴细胞上的mlgE结合的抗C ε mX抗体
[0001] 发明背景
[0002] IgE在介导I型超敏反应中起到决定性作用，I型超敏反应负责导致的过敏性疾 病，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等。过敏性反应是免疫系统对无害环境物质 的应答，所述环境物质例如尘螨、树木和草的花粉、某些食品和药物以及蜜蜂和火蚁叮咬。 在这些反应中，过敏原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面IgE的结合引起IgE交联和相关 IgE. Fc受体的聚集，所述IgE. Fc受体为I型IgE. Fc受体或Fc ε RI。该受体聚集随后激活 信号途径，导致颗粒的胞吐和药理介质的释放，所述药理介质例如组胺、白三烯、类胰蛋白 酶、细胞因子和趋化因子。那些介质从肥大细胞和嗜碱性粒细胞的释放导致过敏反应的各 种病理表现。
[0003] 已经开发出用于治疗IgE介导的过敏性疾病的抗IgE的抗体，该抗体与血液和 组织液中的游离的IgE和B细胞上的mlgE结合，但是不与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的 Fc ε RI所结合的IgE结合。利用人源化抗IgE抗体即奥马珠单抗（商品名Xolair)的治疗 在多种过敏性病症中表现出弱化I型超敏性的多重药理作用。抗体与IgE在Fc的CH3结 构域中的位点高亲和力结合，该位点与Fc ε RI的结合位点重叠。因此，该疗法基于抗体与 游离IgE和B淋巴母细胞和记忆B细胞上的mlgE的结合，这导致血液和组织液中总的游离 IgE水平下降。
[0004] 抗IgE与游离的IgE的结合进一步阻止IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面上的 Fc ε RI的结合。由于未被IgE占据的Fc ε RI不稳定，且随后内化并降解，以抗IgE结合耗 尽游离的IgE也逐渐下调嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的Fc ε RI。已经发现了抗体疗法其它 作用的证据，包括中和细胞因子活性、弱化总炎性活性和可能通过IgE-抗-IgE免疫复合物 的累积清除过敏原。
[0005] 本发明的发明人之一（T. W. Chang)发现，IgE除了与奥马珠单抗结合的位于CH3上 的抗原位点之外，被称为C ε mX的另一个抗原位点存在于人mlgE上，用于祀向表达mlgE的 B淋巴细胞。CemX是位于人膜结合ε链（me)的CH4结构域和C末端膜锚定片段之间的 52个氨基酸的片段。在大多数所研宄的人个体中，已经证明，没有CemX的me (Hies)占有 极小的比例，而具有C ε mX的m ε链（m ε )优势表达。游离、分泌型IgE的ε链的mRNA和 mlgE的m ε 3和m ε 的mRNA都来源于ε RNA转录本的可选剪接。C ε mX的氨基酸和核苷酸 序列在整个蛋白和DNA数据库中是唯一的。因此，CemX为靶向mlgE和表达mlgE的B细 胞提供了特有的抗原位点。
[0006] Chang的研宄组以前报道了所开发的数种C ε mX特异性小鼠单克隆抗体，包括a20 在内，这些抗体能与含有C ε mX片段的重组蛋白和SK0-007细胞系的细胞结合，并且能与 CHO细胞系的细胞结合，所述SK0-007细胞系是表达人mlgE的人骨髓瘤来源的细胞系，所述 CHO细胞系用对应于m h的CH2结构域至细胞质末端的片段（m ε ;CM:细胞质）的基 因转染。单克隆抗体a20及其所有早期开发的抗体均被发现与位于52a. a. C ε mX结构域C 末端的 8-a. a.肽区域、RADWPGPP(SEQ ID N0:1)、残基 #45-52 结合。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及对人mlgE的C ε mx结构域具有特异性并能与人B淋巴细胞上的mlgE 结合的抗体的开发和鉴定。本发明还涉及这些抗体在治疗由IgE介导的过敏性疾病和其他 疾病中的应用。
[0009] 在研宄由Chang的研宄组开发的抗C ε mX单克隆抗体a20的过程中，发现a20与 m ε 基因所转染的细胞系的结合较好，所述细胞系，例如CHO细胞系或NSO细胞系，不 表达Iga (CD79a)、Ig0 (CD79b)、CD21、CD19、CD81和其他与B细胞受体（BCR)相关的蛋白。 然而，发现a20与m ε 基因所转染的表达Ig a、Ig β和其他BCR相关蛋白的细胞系结 合不良，例如Ramos细胞系。我们设想，a20所识别的位于C ε mX上的抗原表位可能被某些 BCR相关蛋白封闭。因此，a20单克隆抗体及其嵌合或人源化版本不适于在体内用于人类患 者中，用于靶向表达mlgE的B淋巴母细胞和记忆细胞的目的。
[0010] 如果肽表位RADWPGPP(SEQ ID N0:1)是用于诱导抗体应答的唯一表位，那么利用 以含人C ε mX的蛋白所免疫的小鼠由杂交瘤方法产生的单克隆抗体，对该肽区域都将是特 异性的。然而，如果该表位是优势表位，但不是唯一的免疫原性表位，那么仍可开发对C ε mX 上其他抗原表位具有特异性的单克隆抗体。可能在C ε mX上存在不能由BCR相关蛋白封闭 的表位，用于抗体结合。如果是这样，还可以开发与B细胞上的IgE结合并且可用于靶向这 些B细胞的抗体。
[0011] 在以下的实施例中，我们成功地表明，尽管RADWPGPP(SEQ ID N0:1)是优势表位， 但是其不是C ε mX上唯一的免疫原性和抗原表位。此外，我们发现了单克隆抗体、4B12和 26H2,其与不在RADWPGPP(SEQ ID N0:1)区域内的抗原表位上的CemX结合。那些单克隆 抗体在结合C ε mX中不与a20抗体竞争。它们与B细胞上mlgE的结合比a20更牢固，并且 在导致表达mlgE的细胞的抗体依赖性细胞溶解和凋亡中比a20更有效。
[0012] 实施例表明，诸如4B12和26H2的单克隆抗体能与人B淋巴细胞上的mlgE结合， 并且适合用于靶向表达mlgE的B淋巴母细胞和记忆B细胞，用于下调IgE合成。嵌合或人 源化形式的抗体适于用在受IgE介导的过敏性疾病所影响的患者中，所述过敏性疾病例如 过敏性哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。由于已证实抗IgE对IgE的中和可有效治疗寒冷 诱发的荨麻瘆、慢性荨麻瘆、胆碱能性荨麻瘆、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥 大细胞增生症、过敏性支气管肺曲霉病、复发性先天血管性水肿和间质性膀胱炎或嗜酸性 粒细胞相关的胃肠病症，因此也可以利用诸如4B12和26H2的抗体治疗这些各种疾病。
[0013] 实施例还提出4B12和26H2所识别的肽在诱导针对C ε mX和因而针对表达mlgE 的B细胞的免疫应答中的潜在应用。具有相似的抗原特性即具有与抗C ε mX抗体的结合活 性的肽及其类似物，例如4B12和26H2,可以单独使用或与分子构建体联合使用，所述分子 构建体还含有能诱导T细胞辅助的部分。这类构建体能诱导针对表达mlgE的B细胞的活 性免疫，并因此实现下调总IgE合成的作用。 实施例
[0014] 实施例1 :与RADWPGPP(SEQ ID NO: 1)之外的抗原位点结合的新的抗C ε mX单克 隆抗体。
[0015] 为了诱导抗C ε mX免疫应答，用50 μ g溶解的n- ^烷基-β -d_麦芽吡喃糖苷 (UDM ;Anatrace)mlgE. Fclj重组蛋白按照厂商的意见以两周的间隔皮下免疫BALB/c小鼠两 次，所述mlgE. Fclj重组蛋白在TiterMax Gold佐剂（Sigma-Aldrich)中乳化。我们避免超 免疫方案，以便小鼠不会仅产生针对优势RADWPGPP表位的抗体。用0.1 mgUDM溶解的mlgE. FcL重组蛋白在没有佐剂的情况下腹膜内进行最后一次加强。融合前一天，将NSO细胞以 5 X IO5个细胞/ml的细胞密度重新接种于新鲜的DMEM培养基（Invitrogen)中，所述DMEM 培养基补充有1〇%热灭活的胎牛血清$83;11^丨壮呢611)和1%青霉素-链霉素混合物 (IOOXPen-Strep溶液；Invitrogen)。最后一次加强3天后，收集来自2只免疫小鼠的脾细 胞，并用无血清DMEM培养基洗涤两次。收集5 X IO7个NSO细胞，并用无血清DMEM培养基洗 涤两次。洗涤后，在用移液管吸头轻轻地不断搅动细胞的同时，通过在1分钟内添加 Iml预 热的50%聚乙烯丙三醇1500(PEG 1500, Roche Applied Science)使脾细胞与NSO细胞融 合，再次搅动细胞持续1分钟，在2分钟内添加2ml预热的无血清DMEM，并最后在2分钟内 添加8ml无血清DMEM。以200 X g离心10分钟之后，用600ml HAT培养基[DMEM培养基补 充有2 %次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷混合物（50 X HAT溶液；Invitrogen)、10 % BM-Condimed Hl (Roche Applied Science)、10 %热灭活FBS和1 %青霉素-链霉素混合物]重悬浮融合 的细胞，并以200 μ 1/孔分布在30个96孔培养板中。第3天时，向每孔添加100 μ I HAT培 养基。在第7天和第10天时，通过吸去每孔一半体积的培养基，并用HAT培养基替换来更 新培养基。在第14天时，利用杂交瘤上清液通过酶联免疫吸附测定（ELISA)来筛查与UDM 溶解的mlgE. ?(^或mlgE. Fe s蛋白结合的抗C ε mX mAb。
[0016] 为了利用ELISA筛查分泌抗C ε mX mAb的杂交瘤，用纯化UDM溶解的mlgE. Fq 或mlgE. Fcs蛋白在0· IM NaCO 3(pH 9.6)中以50ng/孔于4°C下过夜包被96孔MaxiSorp 板（Nunc)。将包被的孔用PB S中1 % BSA以200 μ 1/孔室温封闭1小时。用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔将板洗涤三次，随后将100 μ 1杂交瘤上清液添加至孔中。于 室温孵育2小时。抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔将板洗涤 六次。将板与HRP偶联的山羊抗鼠 IgG抗体（Chemicon)的1:10, 000稀释液一起孵育1小 时（100 μ 1/孔）。然后抽吸所有的孔，并用含0. 05% Tween-20的PBS以200 μ 1/孔将板 洗涤六次。最后，通过50μ1/孔的四甲基联苯胺（TMB)底物溶液（SureBlueTM，KPL)使孔 显影，并通过以50 μ 1/孔添加 IN HCl来终止反应。在酶标仪上检测OD45tl处的吸光度。如 通过ELISA所测定的，从两次融合所筛查的MOOO个杂交瘤克隆中，17个克隆表现出对U