一种动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以免疫刺激添加剂为特征的医用配制品，特别是涉及一种用于动 物的免疫刺激添加剂。
【背景技术】
[0002] 免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但与抗原物 质合并使用（与抗原一起注射或预先注入机体）时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免 疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质。
[0003] 常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产 物如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗）、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物（胞壁酰二 肽）等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸（双链多聚腺苷酸、尿苷酸）、左旋咪唑、 异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂又可分为弗 氏不完全佐剂和完全佐剂两种，是目前动物试验中最常用佐剂。
[0004] 目前的佐剂虽然能满足基本的增强免疫效果，但还有提升空间。因为目前的佐剂 主要通过物理吸附、分隔缓释达到提高抗原利用率、或者药物、生物制剂刺激免疫系统，但 鲜有直接通过直接修饰抗原增强免疫效果的佐剂出现。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种无毒、副作用，直接修饰抗原增强免疫效果 的动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法。
[0006] 本发明一种动物免疫佐剂，其特征在于：包括油剂和免疫增强剂；其中，所述油剂 包括表面活性剂和60-70份的液体石蜡；所述表面活性剂包括20-35份羊毛脂和0. 1-2份 斯盘-80 ;所述免疫增强剂包括0. 05-0. 3份卡介苗、0. 1-1份胞壁酰二肽、1-5份左旋咪唑 和0. 5-3份纳米级羟基磷灰石。
[0007] 进一步，本发明的一种动物免疫佐剂，所述免疫增强剂还包括1-3份黄芪多糖、 0. 01-0. 1份猪链球菌磷酸酶。
[0008] 更进一步，本发明的一种动物免疫佐剂，所述猪链球菌磷酸酶通过以下基 因序列合成制得：atggctttct cttctgttaa cctggacgaa aacccgcgta tccgtggtgg ttcttgcctg gctaccatca aaatcatgga aatcgctctgctgaccgacg ttggtcagaa acgttctaac aaccaggact acatcaaccg ttacaaaaac cgtgctggta tcgacctggt tgttctggctgacggtatgg gtggtcaccg tgctggtcac atcgcttctg aaatggctgc taccgacctg ggtgctgctt gggttgacac ccagctggttaccctgaacg acgttcgtga atggatggtt getatcateg acgctgaaaa ccagaaaatc cacgaactgg gtcagaccgaagaatacaaa ggtatgggta ccaccctgga agctgttgtt gttatcgaca accagatgat ctacgctcac gttggtgact ctcgtgttggtctgatccgt gacggtgaat acacccgtct gaccaacgac cactctctgg ttggtgctct ggttcgtgct ggtcagctga ccgaagaagaagctcagcgt cacccgcaga aaaacatcgt tacccagtct atcggtcagg ctgaaccgat cgaaccggac atcgctctgaaaaccctgga agttggtgac tacgttctga tcaactctga cggtctgacc aacatgatcc cgaccgaaga catccgtgac atcgttctgtctgacgtttc tatcgaatct aaagttgaaa ccctggttcg tttcgctaac aacgctggtg gtctggacaa catcaccgtt ggtctgctgcacatcaccga agaagctcgt〇
[0009] 本发明一种动物免疫佐剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0010] 一、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0011] 二、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0012] 三、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0013] 本发明的制备方法中原料的加入顺序采用先油性后水性，先简单后复杂，先稳定 后不稳定；首先保证的油包水的稳定性，同时保持了原料的活性。
[0014] 进一步，本发明一种动物免疫佐剂的制备方法，所述步骤一中按质量份数还加入 1-3份的黄芪多糖，其加入时间在纳米级羟基磷灰石与左旋咪唑之间。
[0015] 进一步，本发明一种动物免疫佐剂的制备方法，所述步骤三中按质量份数还加入 0. 01-0. 1份的猪链球菌磷酸酶，其加入时间在卡介苗之后。
[0016] 本发明一种动物免疫佐剂的使用方法，其步骤为：按质量体积比向动物免疫佐 剂中加入千分之一到百万分之一的水溶性碳二亚胺或戊二醇，然后与抗原按体积比为 2 : 1-1 : 2混合，乳化，滴水试验合格后静置lh，即可。
[0017] 本发明的动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法与现有技术的不同之处在于：
[0018] 1、本发明的动物免疫佐剂能够有效的诱导抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应 答，综合利用物理吸附、分隔缓释、药物刺激和抗原结构修饰等要素得到高效价、高灵敏度 的抗体。
[0019] 2、本发明中加入了黄芪多糖和猪链球菌磷酸酶，其抗体含量和反应灵敏度具有增 强的作用。
[0020] 3、本发明中加入的纳米级羟基磷灰石和水溶性碳二亚胺或戊二醇均能够修饰抗 原，增加抗原的体积，从而增强抗原被识别的几率，提高反应灵敏度。
[0021] 4、采用本发明的方法制得的免疫佐剂能够保持卡介苗的活性和其他原料的理化 性质，有利于免疫佐剂发挥其作用。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例与验证试验对本发明的动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法 作进一步的说明。
[0023] 实施例1
[0024] 本实施例一种动物免疫佐剂按照以下步骤制备：
[0025] -、称取原料：分别称取70g液体石蜡、31g羊毛脂、0.1 g斯盘-80、0. 3g卡介苗、 0. 3g胞壁酰二肽、4g左旋咪唑和3g纳米级羟基磷灰石；
[0026] 二、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0027] 三、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0028] 四、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0029] 实施例2
[0030] 本实施例一种动物免疫佐剂按照以下步骤制备：
[0031] -、称取原料：分别称取68g液体石蜡、20g羊毛脂、2g斯盘-80、0. 05g卡介苗、 0. 7g胞壁酰二肽、5g左旋咪唑和I. 2g纳米级羟基磷灰石；
[0032] 二、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0033] 三、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0034] 四、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0035] 实施例3
[0036] 本实施例一种动物免疫佐剂按照以下步骤制备：
[0037] -、称取原料：分别称取60g液体石蜡、35g羊毛脂、0. 6g斯盘-80、0. 24g卡介苗、 0.1 g胞壁酰二肽、2g左旋咪唑和2. 5g纳米级羟基磷灰石；
[0038] 二、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0039] 三、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0040] 四、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0041] 实施例4
[0042] 本实施例一种动物免疫佐剂按照以下步骤制备：
[0043] -、称取原料：分别称取62g液体石蜡、24g羊毛脂、I. 5g斯盘-80、0. 12g卡介苗、 Ig胞壁酰二肽、Ig左旋咪唑和0. 5g纳米级羟基磷灰石；
[0044] 二、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0045] 三、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0046] 四、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0047] 实施例5
[0048] 本实施例一种动物免疫佐剂按照以下步骤制备：
[0049] -、称取原料：分别称取65g液体石蜡、28g羊毛脂、Ig斯盘-80、0. 18g卡介苗、 0. 5g胞壁酰二肽、3g左旋咪唑和2g纳米级羟基磷灰石；
[0050] 二、按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋 咪唑、胞壁酰二肽，然后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ;
[0051] 三、将搅拌后的材料用蒸汽加热至120-130°C后进行灭菌20-40min ;
[0052] 四、灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
[0053] 实施例6
[0054] 本实施例一种动物免疫佐剂与实施例5的不同之处在于，步骤二中还加入Ig黄芪 多糖，其加入时间在纳米级羟基磷灰石与左旋咪唑之间；步骤四中还加入0. 2g猪链球菌磷 酸酶，其加入时间在卡介苗之后。
[0055] 实施例7
[0056]