一种鸡传染性支气管炎病毒抗原及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒的血凝 或血凝抑制试验的鸡传染性支气管炎病毒抗原及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性支气管炎（IB)是由传染性支气管炎病毒（IBV)引起的一种急性高度接 触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下 降为特征；患病的鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。传支抗原特性，病毒本身 血凝性，须经特殊处理才能释放出凝集红细胞的受体，出现血凝性。目前传染性支气管苗的 效力检验主要采用攻毒保护方法。攻毒保护存在散毒风险，因此找到血清学替代方法非常 必要，血清学方法中血凝及血凝抑制最为简单可行，并制备血凝抗原就显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种用于鸡传染性支气管炎病毒的血凝或血凝抑制试验 的鸡传染性支气管炎病毒抗原及其制备方法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] -种鸡传染性支气管炎病毒抗原，包含病毒液和辅剂，所述病毒液为呼吸型 IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或肾型IBV-T株毒种的病毒液。所述辅剂为明胶、蔗糖、聚乙 二醇、甘露寡糖或壳聚糖等耐热稳定剂。
[0006] 其中，呼吸型IBV-M41株和肾型IBV-T株毒种，购于中国兽医药品监察所。腺胃型 IBV-YBX株为本申请人自行采集。
[0007] 上述抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的血凝或血凝抑制试验。
[0008] -种如上所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原的制备方法，具体步骤如下：
[0009] 1)将病毒毒种分别用无菌生理盐水100倍稀释，经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡 胚，每胚0. lml，置37°C鸡胚孵化箱孵化，24小时照胚1次，弃去死胚；继续孵化至48小时， 不论死亡与否，全部取出，置4°C冰箱冷却；
[0010] 2)收集尿囊液，3000rpm离心30分钟，取上清；
[0011] 3)将上清装入40ml离心管中，经30000rpm，4°C离心3小时；
[0012] 4)弃去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL缓冲液，进行吹打，混匀，将病毒混 悬液收集于一管内；
[0013] 5)取病毒混悬液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合；
[0014] 6)将病毒混合物37°C水浴2小时，每隔15分钟振荡混匀；最后4°C过夜；
[0015] 7)将步骤6)的混合物进行稀释，之后加入浓度为1%的硫柳汞，边加边混匀，硫柳 汞终浓度为〇. 01 %，混匀后4°c保存。
[0016] 由上的鸡传染性支气管炎病毒抗原制成抗原制剂；剂型为冻干剂。制备冻干剂时 使用的稳定剂为明胶、蔗糖、聚乙二醇、甘露寡糖或壳聚糖等耐热保护剂；使用的方法为真 空冷冻干燥技术，稳定剂的加入量为上述步骤7)制备的抗原液的1/10-1/3。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明的传染性支气管炎血凝抗原特异性强，只对传染性支气管炎阳性血清反 应呈阳性，对新城疫、禽流感和减蛋综合征阳性血清反应均呈阴性。用本发明的呼吸型 IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或肾型IBV-T株毒种加稳定剂后2~8°C保存5年效价仍在 8Log2及以上，稳定性良好。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] 一、抗原制备
[0021] 1、将呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株和肾型IBV-T株毒种分别用无菌生理 盐水100倍稀释，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，置37°C鸡胚孵化箱孵化， 24小时照胚1次，弃去死胚。直至48小时，不论死亡与否，全部取出，置4°C冰箱冷却。按 此方法每种抗原制备3批。
[0022] 2、收集尿囊液，装入500ml离心瓶中，3000rpm离心30分钟，取上清。
[0023] 3、将上清装入40ml离心管中，经30000g，4°C离心3小时。
[0024] 4、弃去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL缓冲液，进行吹打，混匀，将病毒混 悬液收集于一管内。
[0025] 5、取病毒混悬液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合。
[0026] 6、将病毒混合物37°C水浴2小时，每隔15分钟振荡混匀。最后4°C过夜，为IBV-HA 抗原。
[0027] 7、分别将IBV-HA抗原加入1 %硫柳汞，终浓度为0. 01 %，边加边混匀，混匀后4°C 保存。即得 M41-1 批、M41-2 批、M41-3 批；YBX-I 批、YBX-2 批、YBX-3 批；T-I 批、T-2 批、 T-3 批。
[0028] 将以上9种抗原分别与耐热稳定剂混合冻干。
[0029] 二、成品检验
[0030] 2. 1性状检验
[0031] 2. 2效价测定取96孔V型微量反应板对上述制备的抗原进行血凝效价检测，每孔 加25 μ I PBS (0. 01mol/L，pH值7. 0~7. 4)，第一排加25 μ 1抗原，并做2~4个重复孔， 然后将抗原进彳了 2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25 μ I PBS，最后再加入0. 5 %鸡红细胞 悬液25 μ 1，用微量振荡器混匀，2~8°C静置40分钟判定结果，以使100%红细胞凝集的抗 原最高稀释倍数作为判定终点。结果制备的抗原的血凝价均在91og2以上，结果详见表1。
[0032] 表1抗原血凝效价检测结果
[0033]
【主权项】
1. 一种鸡传染性支气管炎病毒抗原，包含病毒液和辅剂，其特征在于：所述病毒液为 呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或肾型IBV-T株毒种的病毒液；所述辅剂为明胶、蔗 糖、聚乙二醇、甘露寡糖或壳聚糖的任一种稳定剂。
2. -种由权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原制成的抗原制剂。
3. 根据权利要求2所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原制成的抗原制剂，其特征在于： 所述制剂的剂型为冻干剂。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原，其特征在于，用于鸡 传染性支气管炎病毒的血凝或血凝抑制试验。
5. -种根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原的制备方法，其特征在于， 具体步骤如下： 1) 将病毒毒种分别用无菌生理盐水100倍稀释，经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每 胚0. lml，置37°C鸡胚孵化箱孵化，24小时照胚1次，弃去死胚；继续孵化至48小时，不论 死亡与否，全部取出，置4°C冰箱冷却； 2) 收集尿囊液，3000rpm离心30分钟，取上清； 3) 将上清装入40ml离心管中，经30000rpm，4°C离心3小时； 4) 弃去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL缓冲液，进行吹打，混匀，将病毒混悬液 收集于一管内； 5) 取病毒混悬液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合； 6) 将病毒混合物37°C水浴2小时，每隔15分钟振荡混匀；最后4°C过夜； 7) 将步骤6)的混合物进行稀释，之后加入浓度为1%的硫柳汞，边加边混匀，硫柳汞终 浓度为〇. 01%，混匀后4°C保存。
【专利摘要】本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒的血凝或血凝抑制试验的鸡传染性支气管炎病毒抗原及其制备方法。包含病毒液和辅剂，所述病毒液为呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或肾型IBV-T株毒种的病毒液。所述辅剂为明胶、蔗糖、聚乙二醇、甘露寡糖或壳聚糖的任一种稳定剂。本发明的传染性支气管炎血凝抗原特异性强，只对传染性支气管炎阳性血清反应呈阳性，对新城疫、禽流感和减蛋综合征阳性血清反应均呈阴性。用本发明的呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株或肾型IBV-T株毒种加稳定剂后2～8℃保存5年效价仍在8Log2及以上，稳定性良好。
【IPC分类】A61P31-14, A61K9-19, A61K39-215, C12R1-93, C12N7-00
【公开号】CN104667270
【申请号】CN201510109503
【发明人】宋新宇, 马爽, 孙成友, 朱艳梅, 李金积, 杨代荣, 徐宝娟
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月12日