本实施例一种动物免疫佐剂与实施例6的不同之处在于，加入的黄芪多糖为2g ; 加入的猪链球菌磷酸酶为〇. 〇lg。
[0057] 实施例8
[0058] 本实施例一种动物免疫佐剂与实施例6的不同之处在于，加入的黄芪多糖为 2. 5g ;加入的猪链球菌磷酸酶为0. 8g。
[0059] 实施例9
[0060] 本实施例一种动物免疫佐剂与实施例6的不同之处在于，加入的黄芪多糖为 I. 5g ;加入的猪链球菌磷酸酶为0. lg。
[0061] 实施例10
[0062] 本实施例一种动物免疫佐剂与实施例6的不同之处在于，加入的黄芪多糖为3g ; 加入的猪链球菌磷酸酶为〇. 5g。
[0063] 以上实施例6-10中所述猪链球菌磷酸酶通过以下基因序列合成制 得：atggctttct cttctgttaacctggacgaa aacccgcgta tccgtggtgg ttcttgcctg gctaccatca aaatcatgga aatcgctctg ctgaccgacg ttggtcagaaacgttctaac aaccaggact acatcaaccgttacaaaaac cgtgctggta tcgacctggt tgttctggct gacggtatgg gtggtcaccgtgctggtcac atcgcttctg aaatggctgc taccgacctg ggtgctgctt gggttgacac ccagctggtt accctgaacg acgttcgtgaatggatggtt getatcateg acgctgaaaa ccagaaaatc cacgaactgg gtcagaccga agaatacaaa ggtatgggtaccaccctgga agctgttgtt gttatcgaca accagatgat ctacgctcac gttggtgact ctcgtgttgg tctgatccgt gacggtgaatacacccgtct gaccaacgac cactctctgg ttggtgctct ggttcgtget ggtcagetga ccgaagaaga agctcagcgtcacccgcaga aaaacatcgt tacccagtct atcggtcagg ctgaaccgat cgaaccggac atcgctctga aaaccctggaagttggtgac tacgttctga tcaactctga cggtctgacc aacatgatcc cgaccgaaga catccgtgac atcgttctgt ctgacgtttctatcgaatct aaagttgaaa ccctggttcg tttcgctaac aacgctggtg gtctggacaa catcaccgtt ggtctgctgc acatcaccgaagaagctcgt〇
[0064] 实施例11
[0065] 向实施例1、3、5所制得动物免疫佐剂中100g水溶性碳二亚胺，然后与人丙种球蛋 白抗原按体积比为2 : 1混合，放入研钵内研磨乳化，滴水试验合格后静置lh，分别标记1、 3λ5〇
[0066] 实施例12
[0067] 向实施例2、4、6所制得动物免疫佐剂中加入IOmg戊二醇，然后与人白蛋白抗原按 体积比为1 : 3混合，于乳化器内乳化，滴水试验合格后静置lh，分别标记2、4、6。
[0068] 实施例13
[0069] 向实施例7、9所制得动物免疫佐剂中加入0.1 mg水溶性碳二亚胺，然后与人C反 应蛋白抗原按体积比为1 : 1混合，放入研钵内研磨乳化，滴水试验合格后静置lh，分别标 记 7、9。
[0070] 实施例14
[0071] 向实施例8、10所制得动物免疫佐剂中加入Img戊二醇，然后与人载脂蛋白B抗原 按体积比为I : 1混合，于乳化器内乳化，滴水试验合格后静置lh，分别标记8、10。
[0072] 实施例15
[0073] 取实施例6的方法，不加入纳米级羟基磷灰石，制得动物免疫佐剂，然后向所得动 物免疫佐剂中加入IOOmg水溶性碳二亚胺，然后与人丙种球蛋白抗原按体积比为I : 1混 合，于乳化器内乳化，滴水试验合格后静置lh，作为对照标记CK1。
[0074] 实施例16
[0075] 将实施例6所制得动物免疫佐剂与人白蛋白抗原按体积比为I : 1混合，放入研 钵内研磨乳化，滴水试验合格后静置lh，作为对照标记CK2。
[0076] 验证试验
[0077] 取普通水溶性佐剂作为对照标记CK3、白油佐剂作为对照标记CK4。对实施例 11-14中标号1-10和CK1、CK2、CK3、CK4的免疫佐剂作以下测定，3次平行试验。结果如表 1所示。
[0078] 具体检测方法如下：
[0079] 1、效价：琼脂双扩散法，琼脂块中心打一小孔，加入10微升lmg/mL浓度的抗原，小 孔周围每隔60度距离5毫米打一小孔，分别加入2、4、8、16、32倍稀释的抗体溶液，以出现 沉淀线的最高稀释倍数为该样品的效价。
[0080] 2、有效抗体含量：抗原结合到亲和柱上面作为吸附剂，吸附剂和血清按照2 : 1体 积比进行吸附，按是否被吸附区分有效抗体和无效抗体，并计算出其比值。
[0081] 3、反应灵敏度：抗血清与抗体按10 : 1混合，37°C孵育5分钟后混合均匀，测定 0D600的吸光度值。
[0082] 表1所得产品的效价、有效抗体含量和反应灵敏度
[0083]
【主权项】
1. 一种动物免疫佐剂，其特征在于：按质量份数包括油剂和免疫增强剂；其中，所述油 剂包括表面活性剂和60-70份的液体石蜡；所述表面活性剂包括20-35份羊毛脂和0. 1-2 份斯盘-80 ;所述免疫增强剂包括0. 05-0. 3份卡介苗、0. 1-1份胞壁酰二肽、1-5份左旋咪 唑和0. 5-3份纳米级羟基磷灰石。
2. 根据权利要求1所述的动物免疫佐剂，其特征在于：所述免疫增强剂还包括1-3份 黄芪多糖、〇. 01-0. 1份猪链球菌磷酸酶。
3. 根据权利要求2所述的动物免疫佐剂，其特征在于：所述猪链球菌磷酸酶通过以 下基因序列合成制得：atggctttct cttctgttaa cctggacgaa aacccgcgta tccgtggtgg ttcttgcctg gctaccatca aaatcatgga aatcgctctg ctgaccgacg ttggtcagaa acgttctaac aaccaggact acatcaaccg ttacaaaaac cgtgctggta tcgacctggt tgttctggct gacggtatgg gtggtcaccg tgctggtcac atcgcttctg aaatggctgc taccgacctg ggtgctgctt gggttgacac ccagctggtt accctgaacg acgttcgtga atggatggtt gctatcateg acgctgaaaa ccagaaaatc cacgaactgg gtcagaccga agaatacaaa ggtatgggta ccaccctgga agctgttgtt gttatcgaca accagatgat ctacgctcac gttggtgact ctcgtgttgg tctgatccgt gacggtgaat acacccgtct gaccaacgac cactctctgg ttggtgctct ggttcgtgct ggtcagctga ccgaagaaga agctcagcgt cacccgcaga aaaacatcgt tacccagtct atcggtcagg ctgaaccgat cgaaccggac atcgctctga aaaccctgga agttggtgac tacgttctga tcaactctga cggtctgacc aacatgatcc cgaccgaaga catccgtgac atcgttctgt ctgacgtttc tatcgaatct aaagttgaaa ccctggttcg tttcgctaac aacgctggtg gtctggacaa catcaccgtt ggtctgctgc acatcaccga agaagctcgt〇
4. 一种动物免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 一、 按照顺序边混合边加入液体石蜡、羊毛脂、斯盘-80、纳米级羟基磷灰石、左旋咪唑、 胞壁酰二肽混合后于2000-4000r/min下搅拌20-30min ; 二、 将搅拌后的材料用蒸汽加热至120_130°C后进行灭菌20-40min ; 三、 灭菌后的佐剂冷却后加入卡介苗混匀，即制得动物免疫佐剂。
5. 根据权利要求4所述的动物免疫佐剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中按质 量份数还加入1-3份的黄芪多糖，其加入时间在纳米级羟基磷灰石与左旋咪唑之间。
6. 根据权利要求4所述的动物免疫佐剂的制备方法，其特征在于：所述步骤三中按质 量份数还加入0. 01-0. 1份的猪链球菌磷酸酶，其加入时间在卡介苗之后。
7. -种动物免疫佐剂的使用方法，其特征在于：按质量体积比向动物免疫佐剂中加入 千分之一到百万分之一的水溶性碳二亚胺或戊二醇，然后与抗原按体积比为2 : 1-1 : 2 混合，乳化，滴水试验合格后静置lh，即可。
【专利摘要】本发明一种动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法，涉及一种以免疫刺激添加剂为特征的医用配制品，特别是涉及一种用于动物的免疫刺激添加剂。其目的是为了提供一种无毒、副作用，直接修饰抗原增强免疫效果的动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法。本发明的动物免疫佐剂包括油剂和免疫增强剂；油剂包括液体石蜡和表面活性剂；表面活性剂包括羊毛脂和斯盘-80；免疫增强剂包括卡介苗、胞壁酰二肽、左旋咪唑和纳米级羟基磷灰石。本发明制备的动物免疫佐剂能够有效的诱导抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，利用各种修饰得到高效价、高灵敏度的抗体。本发明用免疫学及体外诊断领域。
【IPC分类】A61P37-04, A61K39-04, A61K39-39, A61P31-06
【公开号】CN104667272
【申请号】CN201510031609
【发明人】吴凡
【申请人】宿迁恒瑞生物科技有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月22日