合酶（PARP)切割，在完 全培养基中，将表达mlgE. Fq的Ramos细胞（5 X 10 5个细胞/ml)与浓度为1 μ g/ml的嵌 合抗C ε mX mAb、奥马珠单抗或对照抗体在37°C下一起孵育1小时。然后用对人IgG Fe片 段具有特异的山羊F(ab'）2片段以10 μ g/ml的终浓度处理细胞，并于37°C下再孵育24小 时。用冰冷的PBS洗涤5X IO6个细胞，并重悬浮于100 μ 1冰冷的改良RIPA裂解缓冲液 [20禮1'1^8&!17.4)、1501111似(：1、1%1'1^011-父100、0.5%脱氧胆酸、0.1%十二烷基硫 酸钠（SDS)、5mM EDTA和蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich)]中。将裂解物于冰上孵育20分 钟。将样品在4°C下以16000Xg离心20分钟。将上清液转移到新的I. 5ml管中，并储存 于-80°C。用DC蛋白测定（Bio-Rad Laboratories)按照厂商的建议对每个澄清裂解物中 的蛋白量进行定量。将每个样品的总蛋白含量进行标准化，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE)，然后转移到PVDF膜（GE Healthcare)上。从Cell Signaling Techonology 获得半胱天冬酶3和PARP的兔多克隆抗体，并以1:500稀释使用。HRP偶联的山羊抗兔 IgG 二抗（Sigma-Aldrich)以 1:10, 000 稀释使用。用 ECL 试剂（ImmobilonTM Western ； Millipore)对膜进行显影。通过用β肌动蛋白的抗体（Sigma-Aldrich)探测印迹来核实加 载了等量的蛋白。在用c4B12、c26H2和奥马珠单抗而不是ca20处理表达mlgE. Ramos 细胞24小时以后，半胱天冬酶3明显切割成Mr 19-和17-kDa的片段。此外，在c4B12-、 c26H2-和奥马珠单抗处理的表达mlgE. Fq的Ramos细胞中，利用识别M , 116kDa的完整 PARP和Mr 89kDa的切割产物的抗体可检测到PARP的切割（图4C)。
[0026] 附图简要说明
[0027] 图1显示代表C ε mX的连续片段的3个合成肽，及多种抗C ε mX mAb与这些肽的反 应。以粗体显示CemX结构域的氨基酸残基，CH4-migis:SEQ ID N0:11;P1:SEQ ID N0:12; P2:SEQ ID N0:3；P4:SEQ ID N0:13〇
[0028] 图2显示多种抗C ε mX mAb与表达mlgE· ?(^或mlgE· Fe 5的CHO或Ramos细胞系 的结合。
[0029] 图3A显示嵌合c4B12和c26H2以多个E/T比诱导针对表达mlgE. Ramos细 胞诱导的ADCC。图3B显示嵌合c4B12和c26H2以剂量响应的方式诱导针对表达mlgE. Fcl 的Ramos细胞的ADCC。
[0030] 图4A显示嵌合c4B12和c26H2在表达mlgE. Ramos细胞中所诱导的PS暴露 是剂量依赖性的。图4B显示在嵌合c4B12和c26H2所处理的表达mlgE. Ramos细胞 中观察到凋亡的细胞核。图4C显示在嵌合c4B12和c26H2所处理的表达mlgE. Ramos 细胞中观察到半胱天冬酶3和PARP的切割。
[0031] 图5显示亲本小鼠4B12的VL和VH、VL和VH的各自所选的人生殖系模板KV2和 HV4以及人源化4B12 (hu4B12)的氨基酸序列比对，人源化4B12 (hu4B12)在比对中被标记为 "R印Iace (取代）"。该hu4B12与嵌合4B12 (c4B12)对C ε mX重组蛋白和表达mlgE. FcL的 Ramos细胞具有相同的结合亲和力，4B12轻链：SEQ ID N0:5;4B12重链：SEQ ID N0:8;KV2 轻链：SEQ ID N0:6 ;HV4重链：SEQ ID N0:9 ;Hu4B12(取代）轻链：SEQ ID N0:7 ;Hu4B12(取 代）重链：SEQ ID NO: 10。
[0032] 所引用的参考文献
[0033] 相关的专利文件
[0034] US5, 091, 3132/1992 Chang
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【主权项】
1. 诱导免疫应答的方法，其包括： 给予有需要的人个体有效量的选自GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID N0:2)和 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID N0:3)的免疫原以及佐剂。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述免疫原是GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID N0:2)。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述免疫原是HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR (SEQ ID NO:3)〇
4. 如权利要求2所述的方法，其中所述个体患有IgE介导的疾病。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述IgE介导的疾病是寒冷诱发的荨麻瘆，慢性荨麻 瘆，胆碱能性荨麻瘆，慢性鼻窦炎，系统性肥大细胞增生症，皮肤肥大细胞增生症，过敏性支 气管肺曲霉病，复发性先天血管性水肿，间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的肠胃病症。
6. 如权利要求4所述的方法，其中所述IgE介导的疾病是过敏性疾病。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述过敏性疾病是过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性 皮炎。
8. 如权利要求2所述的方法，其中所述免疫应答是诱导对GLAGGSAQSQRAPDRVL (SEQ ID NO:2)具有特异性的抗体产生的抗体应答。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述抗体能够结合B淋巴细胞上的膜结合IgE并诱 导B淋巴细胞的凋亡。
10. 如权利要求3所述的方法，其中所述个体患有IgE介导的疾病。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述IgE介导的疾病是寒冷诱发的荨麻瘆，慢性荨 麻瘆，胆碱能性荨麻瘆，慢性鼻窦炎，系统性肥大细胞增生症，皮肤肥大细胞增生症，过敏性 支气管肺曲霉病，复发性先天血管性水肿，间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的肠胃病症。
12. 如权利要求10所述的方法，其中所述IgE介导的疾病是过敏性疾病。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述过敏性疾病是过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应 性皮炎。
14. 如权利要求3所述的方法，其中所述免疫应答是诱导对 HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR (SEQ ID NO: 3)具有特异性的抗体产生的抗体应答。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述抗体能够结合B淋巴细胞上的膜结合IgE并 诱导B淋巴细胞的凋亡。
【专利摘要】本发明涉及可与人B淋巴细胞表面所表达的膜结合IgE(mIgE)的CεmX结构域有效结合的抗体的产生和应用。提出将位于人膜结合ε链的CH4结构域和C末端膜锚定肽之间的52个氨基酸残基的CεmX结构域作为抗原位点，用于免疫靶向表达mIgE的B细胞。以前所报道的与CεmX的C末端的RADWPGPP(SEQ ID NO:1)肽结合的单克隆抗体，包括a20在内，目前据发现与人B细胞上的mIgE的结合较差。我们发现，只有对CεmX的某些片段具有特异性的单克隆抗体可与人B细胞上的mIgE有效结合，这些片段例如GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)，并因此具有靶向那些B细胞而用于治疗IgE介导的疾病的应用。
【IPC分类】A61K39-385, A61P11-02, A61P11-06, A61P17-00, A61P37-08, A61P1-14
【公开号】CN104667271
【申请号】CN201510069440
【发明人】张子文, 陈君柏, 费迪亚斯·C·吴, 阿尔弗尔·F·洪
【申请人】中央研究院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2010年2月25日
【公告号】CN102482351A, CN102482351B, EP2401300A1, EP2401300A4, US8460664, US8741294, US8974794, US20120207746, US20130302314, US20140220042, WO2010097012A1