专利名称：一种磷脂酰肌醇的化学制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷脂酰肌醇的化学溶液分离制备方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)为革兰氏阳性无芽孢杆菌李斯特属，是一种重要的人畜共患食源性病原菌，可以引起人和多种动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等，病死率高达30% 70%。由于其具有耐热(60°C)、耐低温(4°C)、耐盐、耐干燥等特性，因此潜在危害很大，是食品安全风险评估所关注的重要食源性致病菌之一。1986年，WHO和FDA将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一 ；2000年，LM被WHO列为重点检测的食源性致病菌之一；国际食品法典委员于2009年开始使用食品中LM的限量标准。第51届世界卫生大会之后，我国开始逐步研究通过实施微生物学危险性评价(MRA) 和危害性分析关键控制点(HACCP)等原理来加强对微生物性有害因素的有效管理。2009年JEMRA及美国FDA/FSIS分别对即食食品中LM进行定量评估并发布了评估报告。近年来LM作为食品卫生及流行病学的研究热点，其分离和鉴定方法取得了很大的进步。LM的检测时间、特异性、灵敏度以及准确性等各方面都得到很大的改进。目前主要应用的方法有如下三类传统的培养方法、免疫学方法以及分子生物学检测方法。针对LM的快速检测的需要，许多国家致力于LM显色培养基的研究，针对LM特有的肌醇磷酸磷脂酶(PI-PLC)和P-D-葡萄糖苷酶(卩-D-glueosidase)设计显色底物对LM进行快速检测。商品化的显色培养基主要有以下几种以七叶灵为底物的PALCAM、0XF0RD、LPM、MOX培养基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和肌醇磷酸X-IP为底物的BCMI11listeria显色培养基；以X-IP为底物的Rapid’LMONO agar培养基；以5_溴_4_氯_3_吲哚吡喃糖苷和磷脂酰基醇为底物的CHROMagar Listeria显色培养基、ALOA培养基以及OCLA培养基。其中部分显色培养基已经得到大规模的商品化。而国内关于LM显色培养基的研究一直处于滞后状态，主要是由于底物价格昂贵，难以大规模开发应用。因此LM显色底物的制备研究成为制约LM显色培养基应用的关键技术，是目前研究的难点。国内外相关研究表明磷脂酰肌醇(I-a-phosphatidylinositol)能够作用于LM中的特异性磷脂酶PI-PLC，可以作为特异性检测底物应用于LM显色培养基。磷脂酰肌醇的主要分离制备方法有溶剂法、柱层析法、薄层色谱法、酶法和化学反应法等。其中溶剂法操作简便，便于工业化，但是具有消耗溶剂量大，生产成本高的缺点；柱层析法分离效率高，但负载量小，可重复性差；薄层色谱制备量小，分离能力有限，主要用于检测；化学反应方法合成容易使得肌醇磷脂中不饱和键着色且副产物难以有效分离；另外还有利用高效液相色谱制备少量磷脂酰肌醇纯品，但是由于成本高操作复杂且产量很少，只停留在实验室少量分析研究的阶段。目前国内的磷脂酰肌醇制备产率提高困难，难以商品化应用；国外引进又价格昂贵，从而限制了磷脂酰肌醇在微生物检测等方面的应用，亟需寻找一种高产率且商品化可行的制备工艺。在国内大豆磷脂酰肌醇的研究比较少，迄今为止主要有齐齐哈尔大学以及武汉工程学院做过相关方面的研究。齐齐哈尔大学在2003年到2006年做了用溶剂法分离制备大豆肌醇磷脂相关方面的研究，其中2005年陈志强等报道了可以采用乙醇-正己烷体系分离了肌醇磷脂，2006年吴平等进一步考察了溶剂法分离磷脂酰肌醇的优化条件，并称可以将产率提高到73. 89% ；2008年后武汉工业学院做了采用柱层析法分离制备大豆磷脂的研究，2008年以及2009年姜波等报道了用柱色谱法分离制备大豆磷脂，实验表明硅胶为吸附介质分离大豆磷脂是可行的，但是由于柱层析法负载量较小，且分离周期长，所得产量较低而一直没有得到实际应用。目前亟待开发一种简便有效的分离方法，得到便于工业化的优化工艺条件，使磷脂酰肌醇的制备工业化，为其在显色培养基中的应用创造条件。而国外相关研究集中在上世纪九十年代，目前已经发展到工业化应用领域。目前国外采用的获得大豆肌醇磷脂的方法主要为酶法及分子改性等化学手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷脂酰肌醇的化学制备方法，该方法简单易行，大大降·低了生产成本，便于工业化生产。利用该方法制备得到的磷脂酰肌醇产品的纯度高，经实验证实可以作为进口原料的替代品作为底物应用到LM显色培养基中，效果很好。本发明的磷脂酰肌醇的化学制备方法，其特征在于，包括以下步骤将粗品用硅胶柱层析，以体积比为2. 5 : I的氯仿/甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集组份，再经真空干燥，得到磷脂酰肌醇；所述的粗品通过以下方法制备(I):取大豆磷脂，按质量体积比I : 3 10g/ml加入碱性乙醇中浸提若干次，固液分离得到粗分离混合物，将粗分离混合物溶于正己烷中，然后再加入含有硝酸钾的体积分数为55%的乙醇水溶液进行液-液萃取，分离出乙醇水相，再按0. 03 0. 05g/100ml加入钙盐，充分溶解，静置待沉淀析出后分离沉淀，真空干燥得到粗品；或者(2)a)取大豆磷脂，将其溶于冷氯仿中，搅拌并加入冷甲醇，至大豆磷脂充分溶解后再继续搅拌2 4h，静置并在低温、5000 8000r/min下离心10 20min，弃去上层液体，b)取沉淀用冷氯仿溶解，搅拌并加入冷甲醇，溶解后再搅拌2 4小时，静置并在低温、5000 8000r/min下离心10 20min,弃去上层液体,取沉淀,重复b)步骤若干次,最后将沉淀浓缩干燥得粗品。含有硝酸钾的体积分数为55%的乙醇水溶液其硝酸钾含量优选为0.388g/100ml。所述的碱性乙醇的pH优选为8 11，在乙醇中添加的调节pH值的碱性物质为强碱或氨水。优选，所述的a)取大豆磷脂，将其溶于冷氯仿中，搅拌并加入等体积的冷甲醇；所述的b)取沉淀用冷氯仿溶解，搅拌并加入冷氯仿I 3倍体积的冷甲醇。所述的冷氯仿、冷甲醇和在低温下离心，其中的冷和低温，本领域技术人员均知，其指的是在4°C以下。利用本发明的磷脂酰肌醇的化学制备方法制备得到的磷脂酰肌醇产品，其纯度较高，以此产品作为LM显色培养基的底物，显色效果很好，因此可以作为进口原料的替代品应用到LM显色培养基，降低LM显色培养基中底物的价格。并且本发明的方法简便易行，大大降低了生产成本，有利于磷脂酰肌醇的应用。
图I是磷脂酰肌醇产品的红外光谱(IR)谱图；图2是磷脂酰肌醇产品与标准品的红外光谱(IR)对照图； 图3是磷脂酰肌醇产品的NMR-P31谱图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、磷脂酰肌醇的制备
实施例I :称取粉末大豆磷脂50g，加入300ml的碱性乙醇(pH值为10，加入的调节pH的是NaOH)，搅拌浸提3小时，离心分离固体，重复上述过程3次。经固液分离，收集固体得到粗分离混合物，经过高效液相色谱分析，其中含磷脂酰肌醇28. 5% ;粗分离产物用200ml正己烷溶解，在IOOml体积分数为55%的乙醇水溶液中加入0. 388g的硝酸钾，将此乙醇溶液加入正己烷中，室温下充分搅拌，在4°C冰柜中静置过夜，进行液-液萃取。分离乙醇水相，加入50mg的无水CaCl2固体，室温下搅拌1_2小时至充分溶解，静置24-48小时，离心分离沉淀，真空干燥得到粗品。粗品用高效液相色谱HPLC分析，其中含磷脂酰肌醇为76.7%。用硅胶100-200目，在120°C下活化40min，用流动相浸泡过夜后填湿法装柱。胶柱IOOcmX26mm，采用氯仿甲醇=2.5 1(体积比)为洗脱剂，负载量为0.25g/150g硅胶，称取粗品用洗脱剂溶解后上样，用洗脱剂洗脱，采用自动采样器收集产品组分，用旋转蒸发仪在真空条件下除去溶剂并干燥得到磷脂酰肌醇产品，经红外光谱(IR)分析以及与标准谱图的对比，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确，经HPLC分析，产物纯度为94. 7%。实施例2 本实施例与实施例I基本相同，只是有两个地方与实施例I不同(I):取50g大豆磷脂，加入150ml的碱性乙醇(pH值为8，加入的是氨水调pH值)；(2)分离出乙醇水相后，加入30mg的无水CaCl2固体，其它步骤与实施例I相同，得到磷脂酰肌醇产品，经红外光谱(IR)分析以及与标准谱图的对比，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确，经HPLC分析，产物纯度为90.3%。实施例3 本实施例与实施例I基本相同，只是取50g大豆磷脂，加入500ml的碱性乙醇(pH值为11，加入的是NaOH调pH值)，其它与实施例I相同，得到磷脂酰肌醇产品，经红外光谱(IR)分析以及与标准谱图的对比，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确，经HPLC分析，产物纯度为95. I %。实施例4称取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(4°C )溶解，搅拌并加入60ml冷甲醇(40C )，至大豆磷脂充分溶解后再继续搅拌2h，静置并在2°C、5000r/min下离心lOmin。弃去上层液体，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在搅拌下加入60ml冷甲醇(4°C)，搅拌2h后，静置并在2°C、5000r/min下离心lOmin。重复上述过程二次，取沉淀减压蒸馏并干燥得到粗品。所得粗品按照实施例I的硅胶柱层析的方法进行层析分离，收集产品，经红外光谱(IR)分析以及与标准谱图的对比，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确。所得产品经HPLC分析，产物纯度为97. 5%。实施例5 称取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(3°C )溶解，搅拌并加入60ml冷甲醇(3°C )，至大豆磷脂充分溶解后再继续搅拌4h，静置并在2°C、8000r/min下离心20min。弃去上层液体，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在搅拌下加入30ml冷甲醇(4°C)，搅拌4h后，静置并在2°C、8000r/min下离心20min。重复上述过程二次，取沉淀减压蒸馏并干燥得到粗品。所得粗品按照实施例I的硅胶柱层析的方法进行层析分离，收集产品，经红外光谱(IR)分析以及与标准谱图的对比，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确。所得产品经HPLC分析，产物纯度为92. I %。实施例6 称取5g粉末大豆磷脂，用60ml冷三氯甲烷(3°C )溶解，搅拌并加入60ml冷甲醇·(3°C ),至大豆磷脂充分溶解后再继续搅拌3h,静置并在4°C、6000r/min下离心15min。弃去上层液体，沉淀用30ml冷氯仿(4 °C)溶解，并在搅拌下加入90ml冷甲醇(4°C)，搅拌3h后，静置并在4°C、6000r/min下离心15min。重复上述过程二次，取沉淀减压蒸馏并干燥得到粗品。所得粗品按照实施例I的硅胶柱层析的方法进行层析分离，收集产品。该产品，经正己烷-异丙醇-I %乙酸(8 8 I)溶解后，上高效液相色谱HPLC分析，收集特征峰处产物，真空干燥。再经高效液相色谱分析，并与标准品对照(标准品采购自美国SIGMA公司)，纯度可以达到99. 81%。产物经NMR-P31以及红外光谱分析，NMR-P31的图谱见图3，由图3可以看出，NMR-P31只检测出单一磷脂峰，表明所得产物纯度较高，红外光谱解析如图I所示3400为醇羟基O-H的伸缩振动峰；2924，2853为甲基亚甲基的C-H伸缩振动峰；1741是-C0-0-中C = 0的伸缩振动峰;1235和1040分别为P = 0和P-O-C的伸缩振动峰；1066为酯基-C-O-C-的伸缩振动峰；1466和721分别为CH2的剪式变角振动峰和面内摇摆振动峰。经过谱图解析以及与标准谱图的对比(图2)，可以证明所制备的化合物磷脂酰肌醇结构正确。二、磷脂酰肌醇作为LM显色培养基的底物显色效果测试称取实施例I中的磷脂酰肌醇产品2g，蛋白胨23g、酵母浸出物23g、NaCl 5g，e-D-gluO. 05g，琼脂15g，将这些物质加入水中溶解，调节pH值为7. 0±0. 2，再定容至1L，制成LM显色培养基。或者称取幼牛脑200g、牛心250g、葡萄糖2g、氯化钠5g、碳酸氢二钠2. 5g、琼脂15g、月示胨10g、实施例I中的磷脂酰肌醇产品2g、5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷(^ -D-glu) 0. 05g,将这些物质加入水中溶解，调节pH值为7. 0±0. 2，再定容至1L，制成LM
显色培养基。将LM显色培养基在0，IMpa下高温灭菌，再将灭菌好的培养基倒平板，放入烘箱中干燥，待平板充分凝固且无水蒸气液滴残留时取出，划线接种LM标准菌株CMCC 54002，于38°C培养48h，观察菌落特征。以ALOA和CHRO Magar Listeria培养基作为对照，划线接种LM标准菌株CMCC 54002,于38°C培养48h，观察菌落特征。在三种显色培养基平板上，LM皆呈现蓝绿色菌落，周围环绕不透明晕环现象，其中ALOA培养基上菌落颜色较鲜艳，三种培养基均出现明显的白色晕环现象。
由此可见，按照本发明的方法制备得到的磷脂酰肌醇其纯度高，可以作为LM显色 培养基的底物使用。
权利要求
1.一种磷脂酰肌醇的化学制备方法，其特征在于，包括以下步骤 将粗品用硅胶柱层析，以体积比为2. 5 : I的氯仿/甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集组份，再经真空干燥，得到磷脂酰肌醇； 所述的粗品通过以下方法制备 (I):取大豆磷脂，按质量体积比I : 3 10g/ml加入碱性乙醇中浸提若干次，固液分离得到粗分离混合物，将粗分离混合物溶于正己烷中，然后再加入含有硝酸钾的体积分数为55%的乙醇水溶液进行液-液萃取，分离出乙醇水相，再按0. 03 0. 05g/100ml加入钙盐，充分溶解，静置待沉淀析出后分离沉淀，真空干燥得到粗品； 或者(2)a)取大豆磷脂，将其溶于冷氯仿中，搅拌并加入冷甲醇，至大豆磷脂充分溶解后再继续搅拌2 4h，静置并在低温、5000 8000r/min下离心10 20min，弃去上层液体，b)取沉淀用冷氯仿溶解，搅拌并加入冷甲醇，溶解后再搅拌2 4小时，静置并在低温、5000 8000r/min下离心10 20min,弃去上层液体,取沉淀,重复b)步骤若干次,最后将沉淀浓缩干燥得粗品。
2.根据权利要求I所述的磷脂酰肌醇的化学制备方法，其特征在于，所述的含有硝酸钾的体积分数为55%的乙醇水溶液其硝酸钾含量为0. 388g/100ml。
3.根据权利要求I所述的磷脂酰肌醇的化学制备方法，其特征在于，所述的碱性乙醇的pH为8 11，在乙醇中添加的调节pH值的碱性物质为强碱或氨水。
4.根据权利要求I所述的磷脂酰肌醇的化学制备方法，其特征在于，所述的a)取大豆磷脂，将其溶于冷氯仿中，搅拌并加入等体积的冷甲醇；所述的b)取沉淀用冷氯仿溶解，搅拌并加入冷氯仿I 3倍体积的冷甲醇。
全文摘要
本发明公开了一种磷脂酰肌醇的化学制备方法。本发明以大豆磷脂作为原料，利用溶剂萃取和硅胶柱层析分离的方法，得到磷脂酰肌醇产品。利用本发明的磷脂酰肌醇的化学制备方法制备得到的磷脂酰肌醇产品，其纯度高达90％以上，以此产品作为单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)显色培养基的底物，显色效果很好，与同类显色培养基相比无明显差异。因此可以作为进口原料的替代品应用到LM显色培养基，降低LM显色培养基中底物的价格。并且本发明的方法简便易行，大大降低了生产成本，有利于磷脂酰肌醇的应用。
文档编号C07F9/117GK102964380SQ20121000674
公开日2013年3月13日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者吴清平, 李琳, 张菊梅, 蔡芷荷, 郭伟鹏 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司