专利名称：抑制烟曲霉菌粘附角膜的Pc-E多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于感染性眼病的生物防治技术领域，具体涉及抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽。
背景技术：
角膜炎是眼部最常见的多发病，引起角膜炎的病原微生物包括真菌、细菌、病毒和棘阿米巴等。近年来，随着广谱抗生素和免疫抑制剂的滥用，以及角膜接触镜的普遍佩戴，角膜炎的发病几率大大增加。真菌性角膜炎多见于以农业人口为主的发展中国家，在我国有逐年増加的趋势，相关统计数据显示真菌性角膜炎在我国感染性角膜病中所占比例高达34. 8% 61. 9%，在部分地区已经成为角膜盲的首要原因。真菌性角膜炎常因感染菌属或菌株不明，对药物敏感性不一，治疗较为棘手。患者一旦诊治不够及时就有致盲的危险。所以，对角膜炎在发病初期进行有效的治疗是至关重要的。为此，开展真菌与角膜上皮细胞的 相互作用研究，以期寻找可以更早、更快、更强阻断真菌感染进程的作用靶点，具有重要的临床意义。病原菌的致病过程是其与宿主相互作用的結果。病原体、宿主细胞相互作用的研究常着眼于单一分子或少数分子，甚至在某些研究体系中仅观察到单个基因就判断为决定宿主对某病原体的敏感性的关键因素。但由于双方各自的复杂性和对对方的适应性，病原体-宿主间的相互作用处于动态的变化中。目前对于病原菌与角膜细胞的相互作用机制并不十分清楚。已知病原真菌和细菌粘附于宿主的角膜上皮细胞是角膜炎发生的首要步骤，这其中特异性配体-受体间的结合或非特异性的理化作用产生的粘附都发挥着重要作用，所以阻断这些粘附过程是防治角膜炎的一个很好的策略，将疾病控制在萌芽状态。烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)作为最常见的真菌性角膜炎的致病菌种之一，其毒性较强，引发的病情发展迅速。但目前对于烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的具体机制还并不很清楚，因此对于如何在粘附阶段阻断烟曲霉菌感染角膜细胞的研究还处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的是提供抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽，即可以更早、更快、更强阻断烟曲霉菌感染角膜的作用靶点，为感染性角膜病的临床治疗提供新的思路，以弥补现有技术的不足。本发明利用人角膜上皮细胞对噬菌体展示的随机12肽文库进行三轮生物亲和淘筛，对所得的克隆大量扩增后，进行DNA的提取和序列測定，然后对所筛选的多肽进行人工合成，经ELISA方法进ー步验证人工合成的肽段与人角膜上皮细胞的亲和力。接着利用细胞模型和器官模型研究合成肽段对烟曲霉菌与角膜上皮细胞相互作用的影响，从而验证多肽对感染性角膜病的防治效果。本发明包括以下几个部分
本发明的ー个方面是提供抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽，包括有(I)序列分别为SEQ ID NO 1的多肽，(2)与(I)中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与(I)中的多肽功能相同或相似。对于(2)中所述的多肽，可以是与(I)中的多肽具有75%同源性(3个氨基酸的不同)、80%以上同源性(2个氨基酸的不同)和90%以上同源性(I个氨基酸的不同)的多肽，该多肽的功能与⑴中的多肽功能相同或相似。本发明的另ー个方面是提供包含序列为SEQ ID NO :1多肽的融合多肽。所述的融合多肽可以是通过化学結合方法、酶切方法或物理断裂方法处理多肽片段所获得的。例如Pc-E多肽与抗原载体连接形成的蛋白复合体，抗原载体可以是卵清白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)。
本发明还提供ー种多核苷酸，所述的多核苷酸是I)编码序列为SEQ ID NO : I多肽的核苷酸2)编码与(I)中的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所编码的多肽的功能与(I)中的多肽功能相同或相似。所述的核苷酸为DNA或RNA，优选DNA。本发明还提供ー种药物组合物，包括序列为SEQ ID NO :1的多肽；所述的制品具有预防烟曲霉菌粘附角膜的功能。本发明所提供的序列为SEQ ID NO :1的多肽用于制备抗体，制备的抗体应用在防治烟曲霉菌粘附角膜的药物中，同时制备的抗体还可以应用在检测烟曲霉菌的产品中。本发明所筛选的多肽对烟曲霉菌与角膜上皮细胞的相互作用都有不同程度的竞争性抑制作用，可以特异性的阻断烟曲霉菌表面的配体与角膜上皮细胞受体的粘附，成为真菌性角膜炎治疗药物设计的新靶点，从而为其临床治疗提供新的思路。
图I :本发明的多肽Pc-E与人角膜上皮细胞、角膜成纤维细胞和血管内皮细胞亲和力的ELISA检测效果柱状图；图2 :本发明的多肽Pc-E对眼科常见致病真菌烟曲霉菌粘附于人角膜上皮细胞的抑制作用；图3 :本发明的多肽Pc-E不同浓度对烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的抑制作用；图4 :本发明的多肽Pc-E在小鼠模型中对烟曲霉菌粘附角膜上皮的抑制作用；图5 :本发明的多肽Pc-E对烟曲霉菌引发的小鼠角膜炎发展进程的抑制作用，CK为阴性对照组，Pc-E为多肽处理组，Natacyn为阳性药物处理组；图6 :本发明的多肽Pc-E对烟曲霉菌感染小鼠角膜3天时角膜病变的抑制作用，CK为阴性对照组，Pc-E为多肽处理组，Natacyn为阳性药物处理组；图7 :本发明的多肽Pc-E不同浓度对人角膜上皮细胞的毒性。
具体实施例方式下面对本发明的多肽及其它方面的操作进行详细描述。
一、多肽的筛选噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术，并且表达在噬菌体外売上的蛋白能折叠成天然构象而具有相应的生物学活性。这些载有外源蛋白的噬菌体可组成噬菌体肽库，其在病原体与宿主相互作用的研究中具有巨大的潜 力。应用噬菌体多肽文库筛选模拟配体(细胞因子等)的多肽，筛选到的小肽可以与相应的受体结合，竞争性拮抗其配体的活性。噬菌体展示技术是目前应用很广泛的ー种研究配体-受体相互作用的方法，利用此方法寻找已知受体的配基的模拟物，为研制具有疾病治疗的生物技术新药有着重要的理论意义和潜在的应用价值。实施例I :筛选抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽I)将培养至单层的人角膜上皮细胞(HCEC)与IOuiPfu的噬菌体展示的12肽文库(New England Biolabs公司产品，在M13噬菌体的pill蛋白中嵌入12氨基酸长的随机肽)37°C孵育lhr，PBS洗去未结合的噬菌体，甘氨酸洗脱液洗脱下结合在HCEC表面的噬菌体，经扩增滴定后再进行同样的2轮淘筛，最終获得能够与HCEC发生结合的噬菌体14条多肽。挑取噬菌体单克隆进行序列測定，将获得的核苷酸序列SEQ ID NO 2 (AGCACGCGTAGGATTAGGAAACGGCGACTCCGCATG)翻译成多肽，其氨基酸序列为 SEQ ID NO I (YALRPGMPQffLE) 2)多肽片段的人工合成与鉴定将从噬菌体展示的12肽文库中筛选出的对角膜上皮细胞有粘附作用，且通过对应基因功能分析有可能參与病原菌与宿住相互作用的12肽片段进行人工合成，N端生物素化修饰以利于后续检测，C端酰胺化修饰以防止降解。将一定量的合成肽段与封闭后的人角膜上皮细胞孵育，采用HRP直标的亲和素通过ELISA方法检测合成的12肽片段与人角膜上皮细胞、角膜成纤维细胞(HTK)和血管内皮细胞(HUVEC)的亲和カ(图I)。所筛选的Pc-E多肽可以与人角膜上皮细胞结合。3)合成多肽抑制病原菌粘附角膜上皮细胞的实验培养至单层的人角膜上皮细胞先与IOOuM的多肽孵育lhr，然后加入适量烟曲霉菌孢子在37°C孵育Ihr后，PBS洗去未结合的真菌，将作用后的细胞和粘附的病原菌在显微镜下检测粘附于细胞表面的真菌数目；同时将作用后的体系用裂解液裂解，对其中粘附的真菌进行计数。然后同样方法进ー步研究不同浓度的候选多肽对烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的抑制作用，从而计算半数抑制浓度(IC5tl)。并利用角膜的器官模型研究候选多肽对烟曲霉菌粘附角膜的抑制作用，最终确定能够抑制烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的多肽。筛选出的Pc-E多肽对眼科常见致病真菌烟曲霉菌粘附于人角膜上皮细胞的抑制作用将培养至80%的人角膜上皮细胞先分别与10条IOOuM的多肽37°C孵育lhr，然后各加入106cfu的烟曲霉菌再37°C孵育lhr，PBS洗去未结合的病原菌，裂解液裂解后显微镜下直接计数，不加多肽处理的作为阴性对照(图2)。可见与对照相比，Pc-E多肽可抑制烟曲霉菌粘附于角膜上皮细胞，抑制率可达90%。选择通过噬菌体展示筛选出的多肽，进行半数抑菌浓度(IC50)的測定，即采用上述方法检测不同浓度多肽(lOOuM，IOuM, IuM, O. IuM和O. OluM)对烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的抑制作用(图3)。结果表明Pc-E多肽对烟曲霉菌粘附角膜上皮细胞的抑制表现一定的剂量依赖性，随着多肽浓度的升高，对粘附的抑制率升高。
4)合成多肽抑制病原菌粘附小鼠角膜上皮的实验将麻醉后的BALB/c小鼠角膜用滤纸刮擦损伤角膜上皮，然后在表面滴加IOOuM的多肽与IO7Cfu的烟曲霉菌的混合液，塑料套管套眼球保证液体充分与眼球接触，作用Ihr后，PBS冲洗未结合的真菌孢子，剪下角膜匀浆，梯度稀释铺板计数，不加多肽处理的作为阴性对照(图4)。结果表明Pc-E多肽对烟曲霉菌粘附小鼠角膜抑制作用，与对照相比粘附的菌量显著減少。 5)合成多肽抑制烟曲霉菌感染小鼠角膜的实验利用BALB/c小鼠的真菌性角膜炎模型进ー步检测多肽对烟曲霉菌感染角膜进程的抑制作用。即感染前Ihr用IOOuM的多肽点眼4次，间隔15min，然后滴加IO7Cfu的烟曲霉菌，继续用用IOOuM的多肽每小时点眼I次，点5次。在感染后1，3，5，7和10天时，对小鼠角膜病变情况在裂隙灯显微镜下观察进行临床评分(图5)。同时对感染后第三天的小鼠角膜进行组织病理染色观察(图6)。实验中利用真菌性角膜炎临床治疗常用药物那他霉素滴眼液(含5%的那他霉素)作为阳性对照。结果表明多肽Pc-E对烟曲霉菌引发的角膜炎有抑制作用。6)合成多肽对角膜上皮细胞的毒性实验利用MTT法測定合成多肽对人角膜上皮细胞的毒性。測定多肽的浓度范围为0，O. 01，O. 1，1，10和IOOuM,结果发现多肽对人角膜上皮细胞毒性较低(图7)。ニ、与SEQ ID NO 1的多肽具有同源性的多肽、多肽片段及其融合蛋白本发明还保护与SEQ ID NO 1中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与SEQ ID NO :I的多肽功能相同或相似。所述的具有同源性多肽，可以是与序列为SEQ ID NO 1的多肽具有75%同源性(3个氨基酸的不同)、80%以上同源性(2个氨基酸的不同)和90%以上同源性(I个氨基酸的不同)的多肽，该多肽的功能与与序列为SEQ ID NO :1的任一条多肽功能相同或相似。例如，序列为SEQ ID NO 3 (SGSYALRPGMPQffLE)的多肽，其与位点名称为Pc-E的多肽相比，是在N端加上了 Ser-Gly-Ser (SGS)，而抑制病原菌粘附角膜上皮细胞的实验表明序列为SEQ ID NO 3的多肽也具有抑制烟曲霉菌粘附的功能。所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成仪或Pioneer 肽合成仪等多肽合成仪器按固相化学技术合成。也可以通过插入目的核苷酸片段的表达载体表达出所需要的多肽。本发明所述的十条多肽还可以与蛋白载体连接制成完全抗原，蛋白载体可以是卵清白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)，通过碳化ニ亚胺法，将多肽N末端的氨基与载体蛋白上的羧基相连，然后再采用梯度法透析后得到高纯度的完全抗原。实施例2 :完全抗原的制备(I)将本发明所述的Pc-E多肽溶于ニ甲基亚砜(DMSO)中配制成O. I μ g/μ L的多肽母液；将水溶性碳化ニ亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和卵清白蛋白(OVA)用O. OlM磷酸盐缓冲液(PBS，ρΗ7. 5)分别配制成lmg/mL的工作液；(2)取100 μ L多肽母液，加入20 μ L EDC工作液和12 μ L NHS工作液，STX、EDC、NHS反应的摩尔比为I : 2-3 1-2，室温震荡反应3h，获得最初反应液；(3)将蛋白载体用O. OlM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 5)配成lmg/mL的工作液。
(4) STX和载体蛋白反应的最佳摩尔比为10 I ;将⑵步骤中的反应物加入到100 μ L的载体蛋白工作液中，4°C震荡反应12h，获得最终反应液；(5)将上述的最终反应液转移到透析卡中，用300mL0. OlM pH7. 5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液I次，透析采用梯度透析法，透析完后取出反应物，最终得到完全抗原，并可用于后续实施例的抗体制备。三、包含Pc-E多肽的药物组合物本发明所述的多肽可以用来制备药物组合物，用于预防烟曲霉菌对宿主细胞的粘附。所述的药物组合物含有治疗有效量的Pc-E多肽，以及ー种或几种的药品エ业上可接受的载体或溶剂等辅料。实施例3 :复合多肽滴眼液的制备及其防治烟曲霉菌感染效果检测 取一定量Pc-E多肽冻干粉溶解于滴眼液常用溶剂硼酸盐缓冲液，配制成多肽浓度各为O. I %的滴眼液，并且利用碳酸氢钠调pH值至5. 5-7. 5，利用葡萄糖调节渗透压为270-310m0sm/kg，使其符合常规滴眼液的标准。于感染前Ihr用复合多肽滴眼液对健康BALB/c小鼠滴眼，15min/次，连续5次，然后利用角膜划伤配合角膜接触镜法建立烟曲霉菌(IO7Cfu)感染的小鼠模型，感染后继续用复合多肽滴眼液进行点眼防治，15min/次，连续5次，Shr后取下角膜，匀浆裂解后梯度稀释铺板计数，只感染不进行复合多肽滴眼液防治的同步实验小鼠作为对照。结果发现此滴眼液对烟曲霉菌的感染有较好的防治效果，抑菌率可达80%。四、本发明的Pc-E多肽用于制备抗体实施例4 :抗体的制备免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200 μ L Pc-E多肽(含5 μ g多肽)与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量Pc-E多肽与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射。免疫三次后取尾血測定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫。待效价大于要求值后，杀死小鼠取血，取出的血室温放置30min，8000r/min离心20min,取上层血清,用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清,制成抗Pc-E多肽的抗体。所制备的抗体用间接竞争ELISA法测其效价，以阳性血清的OD值大于阴性的2倍为參照，小鼠血清效价达到2400，实验证明小鼠体内产生了抗体。用实施例2制备的Pc-E多肽的完全抗原免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，间接竞争ELISA法测其效价，结果表明，连接了蛋白载体的Pc-E多肽的小鼠血清效价达到了 3500，远高于Pc-E多肽半抗原的效价。制备的抗体可以用于制备药品或检测试剂盒，用于检测烟曲霉菌。利用所制备的抗体与烟曲霉菌表面多肽对应抗原的特异性反应，来对烟曲霉菌进行检测。首先在利用烟曲霉菌构建的BALB/c小鼠的真菌性角膜炎模型中进行实验，刮取病变角膜表面病灶组织，铺片后利用制备的抗体行免疫组织化学检测，若显阳性则说明病变角膜上有烟曲霉菌存在。另外可以在临床上疑似真菌性角膜炎的病变角膜的病灶组织刮片中通过免疫组化方法进行检测试剂盒的有效性验证，若可检测到阳性抗原，则说明是烟曲霉菌感染角膜所致病变。
权利要求
1.一种抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽，包括有 (1)序列为SEQID NO :I的多肽； (2)与⑴中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与⑴中的多肽功能相同或相似。
2.一种融合蛋白，是将权利要求I所述的多肽与载体蛋白连接形成的。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述的载体蛋白为卵清白蛋白或牛血清白蛋白中的任一种或几种。
4.一种多核苷酸,所述的多核苷酸是 1)编码序列为SEQID NO :I多肽的核苷酸； 2)编码与⑴中所述的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所编码的多肽的功能与⑴中所述的多肽功能相同或相似。
5.如权利要求4所属的多核苷酸，其特征在于核苷酸的序列分别为SEQID NO 20
6.一种抑制烟曲霉菌粘附角膜的药物组合物，其特征在于，包含有权利要求I所述的多肽。
7.一种单克隆或多克隆抗体，其特征在于是由权利要求I所述的多肽作为抗原制备的。
8.一种单克隆或多克隆抗体，其特征在于是由权利要求2所述融合蛋白作为抗原制备的。
9.如权利要求7或8所述的抗体，应用在防治烟曲霉菌粘附角膜的药物中。
10.如权利要求7或8所述的抗体，应用在检测烟曲霉菌的产品中。
全文摘要
本发明涉及抑制烟曲霉菌粘附角膜的多肽Pc-E，包括有(1)序列为SEQ ID NO1的多肽；(2)与(1)中的多肽具有70％或以上同源性的多肽，该多肽的功能与(1)中的多肽功能相同或相似。本发明还涉及一种多核苷酸，所述的多核苷酸用于编码Pc-E多肽。本发明所筛选Pc-E多肽对烟曲霉菌与角膜上皮细胞的相互作用都有不同程度的竞争性抑制作用，可以特异性的阻断烟曲霉菌表面的配体与角膜上皮细胞受体的粘附，成为真菌性角膜炎治疗药物设计的新靶点，从而为其临床治疗提供新的思路。
文档编号C07K16/14GK102659926SQ20121000616
公开日2012年9月12日 申请日期2012年1月10日 优先权日2011年3月21日
发明者李思媛, 王宜强, 赵格 申请人:山东省眼科研究所