人凝血因子viii冻干及干热处理保护剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，不含有人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇，由可溶性盐、氨基酸及表面活性剂组成，不存在传播其他病毒或病原体的风险，适合人群范围广，包括糖尿病患者；使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品冻干后复溶快，复溶效果好，仍然保持高效价和高比活性，效价大于80%、比活性大于40IU/mg；此外，本发明人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂成本低廉，制备简单，保护效果明显，安全有效，具有很好的工业应用前景。
【专利说明】人凝血因子Vl I I冻干及干热处理保护剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护 剂。
【背景技术】
[0002] 血友病是一种遗传性出血性疾病，是由于凝血因子基因突变导致人体内凝血因子 水平降低或缺乏，从而导致出血。凝血因子F VDI的缺乏或不足导致血友病A，凝血因子IX的 缺乏或不足导致血友病B。凝血因子替代治疗是血友病的主要治疗措施。
[0003] 随着现代层析技术的发展，国外血液制品企业已开发出高纯度人凝血因子制品， 满足了血友病患者的需求。我国从病毒安全性考虑，国家药监部门尚未批准人血液来源的 凝血因子进口。国内血液制品企业限于技术能力，多以生产人血白蛋白和免疫球蛋白为主， 凝血因子类等市场份额非常少，其中凝血因子VDI(防治血友病）极其短缺。因此研究开发凝 血因子类血液制品新产品、开展新技术新方法研究，将是血液制品领域的大势所趋。
[0004] 由于制备人凝血因子VIII产品均以人血浆为原料，因此不能排除传播乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒或者其他病毒/病原体的可能性，因此制备工艺流程中必 须包含病毒灭活或去除的方法，例如巴氏灭活、S/D法灭活、20 nm纳米膜过滤法灭活等。而 凝血因子VIII易失活，冷冻干燥或干热处理过程容易破坏凝血因子VIII的蛋白稳定性，弓丨 起变形，导致凝血因子VIII失活，所以在凝血因子VIII进行冷冻干燥或干热处理时必须添 加一定的保护剂或稳定剂。
[0005] 目前常规的凝血因子VIII保护剂或稳定剂主要使用白蛋白或糖醇，协同氨基酸、 无机盐等发挥作用，如中国发明专利201110240278. 2和201210468069. 8公开的保护剂中 引入了人血白蛋白，中国发明专利201210060299. 0采用糖醇和氨基酸组合作为保护剂。但 是，引入人血白蛋白不但成本高，而且人血白蛋白的使用很可能存在潜在的传播其他病毒 或病原体的风险，而使用糖或糖醇制得的产品又不适合糖尿病患者使用，限制了该制品的 应用范围，同时该专利制品经热处理灭活病毒后，凝血因子VIII的效价下降严重，热处理 后凝血活性收率仅33%左右，实际应用价值不大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种人凝血因子VIII冻干及 干热处理保护剂，不使用人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇。
[0007] 本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现： 一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，包括柠檬酸钠广25 mmol/L、氯化钠 10?150 mmol/L、氯化|丐2?9 mmol/L、甘氨酸10?150 mmol/L、精氨酸10?150 mmol/L、组氨酸 ΚΓ150 mmol/L、赖氨酸ΚΓ150 mmol/L、表面活性剂0. 01?0. 25 mmol/L;所述表面活性剂为 非离子型表面活性剂。
[0008] 作为一种优选方案，所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由柠檬酸钠 10?15 mmol/L、氯化钠 5CTl00 mmol/L、氯化|丐4?7 mmol/L、甘氨酸 5CTl00 mmol/L、精氨酸 50?100 mmol/L、组氛酸50?100 mmol/L、赖氛酸50?100 mmol/L、表面活性剂0· I?0· 2 mmol / L组成，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
[0009] 作为一种进一步优选方案，所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由柠檬 酸钠 13 mmol/L、氯化钠 80 mmol/L、氯化|丐6 mmol/L、甘氨酸 80 mmol/L、精氨酸 80 mmol/ L、组氨酸80 mmol/L、赖氨酸80 mmol/L、表面活性剂0. 15 mmol/L组成，所述表面活性剂为 非离子型表面活性剂。
[0010] 本发明使用非离子型表面活性剂的，不但可以协同柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙、甘 氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸发挥保护作用，提高人凝血因子VIII的稳定性，还可以降低 人凝血因子VIII冻干制品复溶于水的介电常数，避免蛋白质成分因带电荷而导致絮凝沉 淀，保证了最后人凝血因子VIII制品的质量。此外通过实验证明，常规的阳离子表面活性 齐|J(如十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基氯化铵等）和阴离子表面活性剂(如硬脂酸钠、 十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸酯等）对人凝血因子VIII的保护作用明显不如非离子型表面 活性剂优越，同时阳离子型表面活性剂毒性较大，阴离子型表面活性剂溶血活性较强，会降 低人凝血因子VIII产品的品质。
[0011] 优选地，所述非离子型表面活性剂为Tween类(聚山梨酯，吐温)、Span类（失水山 梨醇脂肪酸酯，司盘)、辛基酚聚氧乙烯醚类、壬基酚聚氧乙烯醚类、二缩甘露醇单油酸酯类 或Pluronic类(泊洛沙姆类）表面活性剂。
[0012] 具体地,所述非离子型表面活性剂为吐温80、吐温60、吐温40、司盘80、司盘60、司 盘 20、TritonX-IOCKNeutronyx 600、Arlacel A 等。
[0013] 更优选地，所述非离子型表面活性剂为Tween类表面活性剂，如吐温80、吐温60、 吐温40等。
[0014] 最优选地，所述表面活性剂为吐温80,制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保 护剂效果最优。
[0015] 作为一种实施方案，本发明所述干热处理的条件是80°C干热处理72 h或KKTC干 热处理0. 5 h。
[0016] 本发明所述冻干为本领域常规的冷冻干燥处理。
[0017] 本发明选用的氨基酸种类和用量配比并非常规选择，必须同时使用上述用量配比 的甘氨酸、精氨酸、组氨酸和赖氨酸的保护剂才能实现人凝血因子VIII制品经干热处理灭 活病毒保持高效价和高比活性的作用。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： (1)不含有人血白蛋白或其它动物源蛋白、也不含有糖或糖醇，由可溶性盐、氨基酸及 表面活性剂组成，不存在传播其他病毒或病原体的风险，适合人群范围广，包括糖尿病患 者。
[0019] (2)使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品经干热处理灭活病毒后，凝血因子 VIII仍然保持高效价和高比活性，效价大于标示量的80%、比活性大于40 IU/mg。
[0020] (3)使用本发明保护剂的人凝血因子VIII制品冻干后复溶快，远低于复溶时间 30min的质量标准，而且复溶效果好，复溶液澄清微带乳光。
[0021] (4)本发明人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂不含人血白蛋白，成本低廉， 制备简单，保护效果明显，安全有效，具有很好的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明 作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0023] 实施例1 一、制备人凝血因子VIII溶液 (1)制作冷沉淀及冷沉淀溶解 以新鲜冰冻人血浆为原料，经血浆融化，离心制备冷沉淀，将冷沉淀用15~20°c预冷的 含有8 IU/ml肝素的生理盐水溶解，生理盐水的用量为沉淀重量的7、倍，搅拌溶解后静置 60 min〇
[0024] (2)铝胶吸附 将静置后的溶解液升温至25~28°C，加入同温度质量浓度3%的氢氧化铝凝胶，加入量 为冷沉淀重量的40%，采用搅拌下浸润的方式加入，即在8(T100 rpm搅拌速度下，用乳胶 管将氢氧化铝凝胶泵入溶解液的液面以下，添加速度为8(T100 ml/min，添加完毕后降温至 15?20°C，12000 rpm离心除杂，去上清液。
[0025] (3)S/D病毒灭活 上清液升温至35°C，加入S/D病毒灭活剂保温3h完成第一次病毒灭活，得到病毒灭活 液，其中S/D病毒灭活剂含有1%聚山梨醇（Tween-80)、0. 3%磷酸三丁酯（TNBP)。
[0026] (4)凝胶柱层析纯化 将凝胶柱用洗液1平衡，病毒灭活液上样凝胶柱层析，在280 nm波长紫外光监测 下，用洗液2洗柱4倍柱体积，用洗液3洗脱凝血因子VIII，并收集。其中凝胶型号为 DEAE-SAPHROSE FF，上样及洗脱流速为22(T250 ml/min，洗液1的配方为110 mM氯化钠， 10 mM枸橼酸钠 ，I mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7.0;洗液2的配方为150 mM 氯化钠，10 mM枸橼酸钠 ，I mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7. 0 ;洗液3的配方 为250 mM氯化钠，10 mM枸橼酸钠 ，I mM氯化钙，16 mM赖氨酸，120 mM甘氨酸，pH7.0。
[0027] (5)超滤浓缩 将收集的凝血因子VIII进行超滤脱醇和脱盐，得到高浓度浓缩凝血因子VIII溶液，凝 血因子VIII的效价控制在40 IU/ml。
[0028] 二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂 按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因 子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原 来的浓度如下：朽1檬酸钠13 mmol/L、氯化钠80 mmol/L、氯化興6 mmol/L、甘氨酸80 mmol/ L、精氨酸 80 mmol/L、组氨酸 80 mmol/L、赖氨酸 80 mmol/L、吐温 80 0. 15 mmol/L。
[0029] 三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用 将步骤一制得的凝血因子VIII溶液与步骤二制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂按照体积比1:1混合，使得凝血因子VIII的效价控制在20 IU/ml，再将混合溶液分 装到蛋白瓶内（10 ml/瓶)，冷冻干燥后封盖，再经过80°C干热处理灭活病毒，制得人凝血因 子VIII成品。
[0030] 实施例2 一、制备人凝血因子VIII溶液 参照实施例1的步骤一。
[0031] 二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂 按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因 子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原 来的浓度如下：朽1檬酸钠10 mrnol/L、氯化钠100 mmol/L、氯化I丐4 mmol/L、甘氨酸50 mmol/ L、精氨酸 50 mmol/L、组氨酸 100 mmol/L、赖氨酸 100 mmol/L、吐温 80 0.1 mmol/L。
[0032] 三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用 参照实施例1的步骤三。
[0033] 实施例3 一、制备人凝血因子VIII溶液 参照实施例1的步骤一。
[0034] 二、制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂 按比例称取各类无机盐、氨基酸及表面活性剂，采用普通医用注射用水配置人凝血因 子VIII冻干及干热处理保护剂，制得的人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂中各类原 来的浓度如下：朽1檬酸钠15 mmol/L、氯化钠50 mmol/L、氯化興7 mmol/L、甘氨酸100 mmol/ L、精氨酸 100 mm〇l/L、组氨酸 80 mmol/L、赖氨酸 80 mmol/L、吐温 80 0. 2 mmol/L。
[0035] 三、人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂的使用 参照实施例1的步骤三。
[0036] 实施例4 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为吐温60。
[0037] 实施例5 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为吐温40。
[0038] 实施例6 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为司盘80。
[0039] 实施例7 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为TritonX-100。
[0040] 实施例8 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为Neutronyx 600。
[0041] 实施例9 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制备人凝血因子VIII冻干及干热处理 保护剂时将吐温80替换为Arlacel A (失水甘露糖醇单油酸酯)。
[0042] 对比例1 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂不含有吐温80成分。
[0043] 对比例2 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中吐温80的含量为0. 5 mmol/L。
[0044] 对比例3 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中不含有甘氨酸。
[0045] 对比例4 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中不含有精氨酸。
[0046] 对比例5 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中不含有组氨酸。
[0047] 对比例6 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中不含有赖氨酸。
[0048] 对比例7 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二制备人凝血因子VIII冻干及干热处理保 护剂时将吐温80替换为十六烷基氯化吡啶。
[0049] 对比例8 主要步骤与实施例1相同，区别点在于步骤二中制得的人凝血因子VIII冻干及干热处 理保护剂中将吐温80替换为十二烷基硫酸钠。
[0050] 相关检测 (一）将上述实施例及对比例制得人凝血因子VIII成品参照中国药典质量标准的检测 方法进行检验，采用下列指标进行产品优劣分析： 1、产品干热后效价。
[0051] 2、产品干热比活性(药典质量标准为彡I. 0 IU/mg蛋白质)。
[0052] 3、产品外观、可见异物和复溶时间(符合药典规定为合格，不符合药典规定为不合 格。药典规定：外观应为乳白色疏松体，复溶后溶液应为无色澄清液体，可带轻微乳光；可 见异物，除允许有微量细小蛋白颗粒外，其余应符合规定；复溶时间应< 30 min)。
[0053] 检测结果如下表所示：
【权利要求】
1. 一种人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，包括柠檬酸钠1~25 mm〇l/L、氯化钠10?150 mmol/L、氯化|丐2?9 mmol/L、甘氨酸10?150 mmol/L、精氨酸10?150 mmol/L、组氛酸 10?150 mmol/L、赖氛酸 10?150 mmol/L、表面活性剂 0. 01 ?0. 25 mmol/L ;所 述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
2. 根据权利要求1所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，所述人 凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由柠檬酸钠1(T15 mmol/L、氯化钠5(Tl00 mmol/L、 氯化|丐4?7 mmol/L、甘氨酸50?100 mmol/L、精氨酸50?100 mmol/L、组氨酸50?100 mmol / L、赖氨酸5(Tl00 mmol/L、表面活性剂0.1~0. 2 mmol/L组成，所述表面活性剂为非离子型表 面活性剂。
3. 根据权利要求2所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，所述人 凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂由朽 1檬酸钠13 mmol/L、氯化钠80 mmol/L、氯化|丐6 mmol/L、甘氨酸 80 mmol/L、精氨酸 80 mmol/L、组氨酸 80 mmol/L、赖氨酸 80 mmol/L、表面 活性剂0. 15 mmol/L组成，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
4. 根据权利要求1~3任一项所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在 于，所述非离子型表面活性剂为Tween类、Span类、辛基酚聚氧乙烯醚类、壬基酚聚氧乙烯 醚类、二缩甘露醇单油酸酯类或Pluronic类表面活性剂。
5. 根据权利要求1~3任一项所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征 在于，所述非离子型表面活性剂为吐温80、吐温60、吐温40、司盘80、司盘60、司盘20、 TritonX-100、Neutronyx 600 或Arlacel A。
6. 根据权利要求4所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，所述非 离子型表面活性剂为Tween类表面活性剂。
7. 根据权利要求6所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，所述 Tween类表面活性剂为吐温80、吐温60或吐温40。
8. 根据权利要求7所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在于，所述 Tween类表面活性剂为吐温80。
9. 根据权利要求1~3任一项所述人凝血因子VIII冻干及干热处理保护剂，其特征在 于，所述干热处理的条件是80°C干热处理72 h或10(TC干热处理0. 5 h。
【文档编号】A61K47/18GK104225601SQ201410495678
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】朱光祖, 蒋桂香 申请人:广东双林生物制药有限公司