生产含有gla残基的丝氨酸蛋白酶的方法

专利名称：生产含有gla残基的丝氨酸蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及生产、纯化和配制蛋白酶蛋白的方法。
背景技术：
许多涉及凝血级联反应的蛋白，包括，例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和因子XIII，被证明是有用的医治各种病理学状况的治疗药物。通常，参与被称作凝血“级 联反应”的血液组份是酶原或酶原(zymogens)，所述酶原是可通过激活剂作用转化成蛋白 水解酶的酶促无活性蛋白，所述激活剂自身就是被激活的凝血因子。从事这类转化的凝 血因子通常称为“激活因子”，并且通过加上小写字母“a”作后缀来表示(例如，激活因子 VII(FVIIa))ο因为使用人血浆作为药物产品来源有许多不利方面，所以优选地用重组系统生产 这些蛋白。然而，凝血蛋白要经受各种翻译中和翻译后修饰，包括，例如，天冬酰胺连接的 (N-连接的)糖基化；0-连接的糖基化和谷氨酸的Y-羧化作用。由于这个原因，优选地在 哺乳动物细胞中生产这些蛋白，所述哺乳动物细胞可以正确地修饰所述重组蛋白。在从微生物或细胞系培养物生产凝血蛋白的过程中，最终的生产步骤是回收和任 意浓缩目的产物。除了其它污染物例如培养成份、核酸等，细胞生长和含有分泌蛋白的培养 基以及特别是含有细胞内目的蛋白的细胞裂解物也或多或少地含有由所述细胞生产的其 它蛋白。为了获得纯化的蛋白产物，因而必需将所述目的蛋白从存在于含有所述目的蛋白 的粗材料中的其它蛋白和多肽以及其它杂质中分离出来。美国专利5，700，914涉及用于FVII纯化的方法，其中锌至少存在于其中的一步纯 化步骤中。在传统的培养、纯化步骤和传统的配制过程中，由于激活的凝血蛋白的蛋白酶解 功能使所述蛋白易于自降解。因而，在本领域需要改进用于培养、纯化和配制被激活的凝血 蛋白的方法以在生产凝血蛋白特别是重组人因子VII或因子VII相关多肽的过程中减少其 自身降解。发明简述本发明在广义上涉及蛋白酶的纯化。此处描述的方法可用于纯化包括凝血因子 FXII/FXIIa、FXI/FXIa、FX/FXa、FIX/FIXa、FVII/FVIIa、凝血酶以及抗凝血蛋白 C 在内的任 何蛋白酶。优选地所述方法用于纯化在细胞培养条件下产生的重组蛋白酶。优选地所述 方法用于纯化含有GLA( γ -羧基谷氨酸)残基的丝氨酸蛋白酶、维生素K依赖性凝血因子 Vila、IXa、Xa、活化蛋白C和凝血酶。更优选地含有具有GLA( Y-羧基谷氨酸)残基的结构域的丝氨酸蛋白酶是因子IX 多肽例如FIXa。甚至更优选地含有具有GLA( γ-羧基谷氨酸)残基的结构域的丝氨酸蛋白 酶是因子VII多肽例如FVIIa。本发明的第一个方面涉及用于生产纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法， 所述方法包括(i)在适合于表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；其中在步骤(iii)中的游离钙离子浓度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属离子的游离离子浓度高 于0. 025mM ；和/或其中在步骤(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的第二个方面涉及用于生产纯化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在适合于表达因子VII多肽的条件下在培养基中培养表达因子VII多肽的宿 主细胞；(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化因子VII多肽；其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.2mM或低于0. IOmM;和/或其中在步 骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属离子的游离离子浓度高于0.025mM;和/或 其中在步骤(iii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的第三个方面涉及用于生产纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法， 所述方法包括(i)在适合于表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达含 有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；其中在步骤(iii)中钙离子与含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的摩尔比(Ca2+ 含 有GLA残基的丝氨酸蛋白酶)高于20或低于0.50;和/或其中在步骤(iii)中除了锌离 子和钙离子外的二价金属离子的游离离子浓度高于0.025mM;和/或其中在步骤(iii)中 pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一步方面涉及用于生产纯化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在适合于表达因子VII多肽的条件下在培养基中培养表达因子VII多肽的宿 主细胞。(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化因子VII多肽；其中在步骤(iii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0. 50 ；和/或其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属离子的游离离 子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在步骤(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法 包括(i)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；其中在步骤(ii)中钙离子与含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的摩尔比(Ca2+ 含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶)高于20或低于0.50;和/或其中在步骤(ii)中除了锌离子和 钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM;和/或其中在步骤(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收包含因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化因子VII多肽；其中在步骤(ii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0.50;和/或其中在步骤(ii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离 离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在步骤(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法 包括(i)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；其中在步骤(ii)中游离钙离子的浓度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在 步骤(ii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0.025mM;和/ 或其中在步骤(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，所述方法包括⑴回收包含因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化因子VII多肽；其中在步骤(ii)中游离钙离子的浓度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在 步骤(ii)中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0.025mM;和/ 或其中在步骤(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶溶液要经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中所述游离 钙离子浓度高于1. 2mM或低于0. ImM ；和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和钙 离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步骤 中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽方法，其中因子VII多肽溶液要经 过多个纯化步骤，其中在至少在一个纯化步骤中所述游离钙离子浓度高于1.2mM或低于 0. ImM ；和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游 离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步骤中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶溶液要经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中钙离子与 含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的摩尔比(Ca2+ 含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶)高于20或 低于0. 50 ；和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的 游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步骤中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶 液要经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中钙离子与因子VII多肽的摩尔比 (Ca2+ FVII多肽)高于20或低于0.50;和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和 钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步 骤中PH低于7. 5或高于8. 6。
本发明的进一方面涉及在包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液中稳定含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中将所述包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液经 过下列步骤加入钙以获得高于1. 2mM或低于0. IOmM的游离钙离子浓度；和/或加入除了 锌离子和钙离子外的二价金属阳离子以获得高于0. 025mM的锌和钙之外的二价金属阳离 子的游离离子浓度；和/或调节包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液的pH以使PiHS 于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及在含有因子VII多肽的溶液中稳定因子VII多肽的方 法，其中将所述含有因子VII多肽的溶液经过下列步骤加入钙以获得高于1. 2mM或低于 0. IOmM的游离钙离子浓度；和/或加入除了锌离子和钙离子外的二价金属阳离子以获得高 于0. 025mM的阳二价金属阳离子的游离离子浓度；和/或调节含有因子VII多肽的溶液的 PH以使pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及组合物，所述组合物包含(i)含有GLA残基的丝氨酸蛋白 酶和(ii)浓度高于1. 2mM或低于0. IOmM的游离钙离子；和/或除了锌离子和钙离子外的 浓度高于0. 025mM的游离二价金属阳离子；和/或其中所述组合物具有低于7. 5或高于8. 6 的pH。本发明的进一方面涉及组合物，所述组合物包含(i)因子VII多肽和(ii)浓度高 于1. 2mM或低于0. IOmM的游离钙离子；和/或除了锌离子和钙离子外的浓度高于0. 025mM 的游离二价金属阳离子；和/或其中所述组合物具有低于7. 5或高于8. 6的pH。发明详述为了减少极度活跃的FVII (a)类似物，例如具有比野生型人FVIIa更高蛋白酶解 活性的FVII多肽变体，的自身降解，通过下列方式减低所述活性和易感性a)在纯化过程 中在> 25mM 二价金属阳离子(除了锌离子和钙离子外)例如Cu2+存在的情况下，和/或b) 在纯化过程中在> 1. 2mM Ca2+存在的情况下和/或c)在纯化过程中在< 0. ImM Ca2+存在 的情况下和/或d)在纯化过程中在pH低于7. 5的情况下和/或e)在纯化过程中在pH高 于8. 6的情况下。在中性pH(pH= 7.5)时极度活跃的FVIIa类似物的自身降解非常严重并且在纯 化过程中导致相当大的产量损失。已知的解决办法包括在纯化方法中引入高毒性的蛋白酶 抑制剂或昂贵的“定制(tailored)，，的抑制剂或清除性肽/蛋白。由本发明的发明者进行的在pH6的条件下稳定培养上清液、免疫亲和捕获和通过 阴离子交换进行纯化的方法已显示具有大量优于已知FVII纯化方法的有利方面。本发明的一个方面涉及用于生产纯化的因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)在适合于表达因子VII多肽的条件下在培养基中培养表达因子VII多肽的宿 主细胞；(ii)回收包含因子VII多肽的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化因子VII多肽；其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1. 2mM或低于0. IOmM ；和/或其中在步 骤(iii)中除了锌离子和钙离子外二价金属阳离子的游离离子浓度高于0.025mM;和/或其中在步骤(iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的第二个方面涉及用于生产纯化的因子VII多肽的方法，所述方法包括
(i)在适合于表达因子VII多肽的条件下在培养基中培养表达因子VII多肽的宿 主细胞；(ii)回收包含所述因子VII多肽的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化因子VII多肽；其中在步骤(iii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比(Ca2+ 因子VII多肽)高 于20或低于0. 50 ；和/或其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外二价金属阳离子的 游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在步骤 (iii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的第三个方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收含有因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化因子VII多肽；其中在步骤(ii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比(Ca2+ FVII多肽)高于20 或低于0.50;和/或其中在步骤(ii)中除了锌离子和钙离子外二价金属阳离子的游离离 子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在步骤(ii)中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，所述方法包括(i)回收含有因子VII多肽的所有或部分溶液；并且(ii)从所述溶液中纯化因子VII多肽；其中在步骤(ii)中游离钙离子浓度高于1. 2mM或低于0. ImM ；和/或其中在步骤 (ii)中除锌离子和钙离子外二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在 步骤(ii)中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶液要 经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中所述游离钙离子浓度高于1.2mM或低于 0. ImM;和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和钙离子外二价金属阳离子的游离 离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步骤中pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于纯化因子VII多肽的方法，其中因子VII多肽溶液 要经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中所述钙离子和因子VII多肽的摩尔比 (Ca2+ FVII多肽)高于20或低于0.50;和/或其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和 钙离子外二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM ；和/或其中在至少一个纯化步骤 中PH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及在含有因子VII多肽的溶液中稳定因子VII多肽的方 法，其中将所述含有因子VII多肽的溶液经过下列步骤加入钙以获得高于1. 2mM或低于 0. IOmM的游离钙离子浓度；和/或加入除锌离子和钙离子外的二价金属阳离子以获得高于 0. 025mM的锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度；和/或调节含有因子VII 多肽的溶液的PH以使pH低于7. 5或高于8. 6。本发明的进一方面涉及用于生产纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所 述方法包括(i)在适合于表达含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达含 有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且(iii)从所述培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；
其中在步骤(iii)中pH具有在4. 5和6. 9之间的值或具有在8. 6和10之间的值。本发明的进一方面涉及用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液要经过多个步骤，其中在至少一个纯化步骤中pH具有在 4. 5和6. 9之间的值或具有在8. 6和10之间的值。 本发明的进一方面涉及在包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液中稳定含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中所述包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液要经 过下列步骤加入钙以获得高于1. 2mM或低于0. IOmM的游离钙离子浓度；和/或加入除锌 离子和钙离子外的二价金属阳离子以获得高于0. 025mM的锌离子和钙离子外的二价金属 阳离子的游离离子浓度；和/或将包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液的pH值调节在 4. 5和6. 9之间或在8. 6和10之间。本发明的进一方面涉及组合物，所述组合物包含存在于溶液(pH值为4. 5和6. 9 之间或8. 6和10之间)中的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。此处所使用的术语“含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶”是指选自因子VII多肽、因 子IX多肽、因子X和其变体和衍生物、蛋白C和其变体和衍生物以及凝血酶原/凝血酶和 其变体和衍生物的蛋白，其中所述蛋白包含一个或更多个Y-羧基谷氨酸(GLA)氨基酸残 基。在一个实施方案中，所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶是所述蛋白的活化形式，例如因 子Vila、因子IXa、因子Xa、活化的蛋白C和凝血酶。在一个实施方案中所述含有GLA残基 的丝氨酸蛋白酶的是人的丝氨酸蛋白酶。“稳定”存在于包含丝氨酸蛋白酶的组合物中的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶例 如因子VII多肽或因子IX多肽，是指减少组合物中所述丝氨酸蛋白酶的降解程度(即每 单位时间降解产物的量)，例如通过蛋白酶解的或化学的降解。优选地如此处描述的在 ⑶-FVIIa形成速度测定中所测量的降解低于⑶-FVIIa形成最大值的60%、例如⑶-FVIIa 形成最大值的50%、例如⑶-FVIIa形成最大值的40%、例如⑶-FVIIa形成最大值的30%、 例如⑶-FVIIa形成最大值的20%、例如⑶-FVIIa形成最大值的10%。应当理解“稳定”组合物中含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶，是指在重组蛋白生产过 程中的任何步骤增加其稳定性，所述步骤选自收获、捕获、贮存、处理、加工、纯化、大量预配 制(bulk preformulation)、大量配制(bulk formulation)、超/渗滤、离子交换、阴离子交 换捕获、大小排阻层析、疏水相互作用层析、沉淀和亲和纯化。如此处所使用的术语“被纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶”是指按重量计算 从至少大约50%的多核苷酸、脂类、糖类以及在真核宿主细胞表达后的培养基中发现的任 何其它污染多肽或其它污染物中分离的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶，所述污染物将干扰 其治疗、诊断、预防或研究用途。通过使用各种方法学可将所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白 酶纯化至基本不含来自培养基的天然污染物。也可将用于纯化所述含有GLA残基的丝氨酸 蛋白酶的标准层析分离技术用于某些纯化步骤。此处所使用的术语“纯化的因子VII多肽”是指按重量计算从至少大约50%的多 核苷酸、脂类、糖类以及在真核宿主细胞表达后的培养基中发现的任何其它污染多肽或其 它污染物中分离的因子VII多肽，所述污染物将干扰其治疗、诊断、预防或研究用途。通过 使用各种方法学可将所述因子VII多肽纯化至基本不含来自培养基的天然污染物。也可将 用于纯化所述因子VII多肽的标准层析分离技术用于某些纯化步骤。
从包含多肽和一种或更多种污染物的组合物中“纯化”多肽，是指通过从组合物中除去(全部或部分地)至少一种污染物以增加所述多肽在组合物的纯度。“纯化步骤”可以 是部分或全部纯化过程(产生“均一的”组合物的过程)，此处所使用的均一的组合物是指 基于所述组合物的总重量至少包含按重量计算大约70 %的目的多肽，优选地按重量计算至 少大约80%。此处所使用的术语“游离钙离子浓度”是指被水分子包围的二价正钙离子(Ca2+) 的浓度。该术语不包括固体形式的钙离子，即以晶体结构或与蛋白例如FVII结合形式存在 的钙。此处所使用的术语“除锌离子和钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度”是 指被水分子包围的二价正离子的浓度，所述离子不是钙离子或锌离子。该术语不包括固体 形式的二价正离子，即以晶体结构或与蛋白结合形式存在的离子。在本发明的一个实施方案中，纯化步骤是色谱纯化步骤。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是疏水相互作用层析。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是大小排阻层析。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是阴离子交换层析。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是超滤。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是免疫亲和纯化。在本发明的一个实施方案中，至少有一个纯化步骤是渗滤。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.2mM。在本 发明的一个实施方案中，步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.3mM，例如高于1. 4mM、例如 高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如高于 2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、 例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、例如 高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高于 40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶液饱和状 态下的游离钙离子浓度。此处所使用的术语“溶液饱和状态下的游离钙离子浓度”是指当溶解的游离钙离 子与以固体形式存在的未溶解钙离子以平衡形式存在时游离钙离子的浓度。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中游离钙离子的浓度低于0. 10mM。在 本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中游离钙离子的浓度低于0.09、例如低于0.08、 例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于 0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外二价金属阳 离子的游离离子浓度高于0.025mM.。在本发明的一个实施方案中，所述二价金属阳离子选 自 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和 Uo2+。在本发明的一个实施方案中， 二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中除了 锌离子和钙离子外二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如 高于0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例 如高于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于1. OmM。在本发明的一个实施方案中，在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下于步骤 (iii)中纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下于步骤中纯化因子VII多肽。此处所使用的术语“二价金属离子螯合剂”是指任何除去或结合二价金属离子例如钙离子或锌离子的试剂或化合物。所述二价金属离子螯合剂可以是聚羧酸螯合剂、柠檬 酸、浴铜灵、红菲绕啉、DTPA,乙二胺四乙酸(EDTA)、EGTA、青霉胺、TETA, TPEN和其衍生物。在本发明的一个实施方案中，在pH低于7.5的情况下于步骤(iii)中纯化含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，pH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低 于7. 2、例如低于7. 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于 6. 2、例如低于6.0、例如5.5。在本发明的一个实施方案中，在pH高于8.6的情况下于步骤(iii)中纯化含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，pH高于8. 7、例如高于8. 8、例如高 于8. 9、例如高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于
9.8、例如高于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本发明的一个实施方案中，在pH低于7.5的情况下于步骤(iii)中纯化因子 VII多肽。在本发明的一个实施方案中，pH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如低 于 . 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低于 6. 0、例如 5. 5。在本发明的一个实施方案中，在pH高于8.6的情况下于步骤(iii)中纯化因子 VII多肽。在本发明的一个实施方案中，PH高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如高 于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高于
10.0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本发明的一个实施方案中，当pH在4. 5和6. 9之间时纯化含有GLA残基的丝 氨酸蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，当pH在4. 5和6. 9之间时纯化因子VII多肽。 在本发明的一个实施方案中，PH在4. 7到6. 8之间、例如在4. 9和6. 7之间、例如在5. 1和 6. 6之间、例如在5. 3和6. 5之间、例如在5. 5和6. 4之间、例如在5. 7和6. 3之间、例如在 5. 8禾Π 6. 2之间、例如在5. 9禾Π 6. 1之间、例如6. 0左右。在本发明的一个实施方案中，当pH在8. 6和10之间时纯化含有GLA残基的丝氨酸 蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，当PH在8. 6和10之间时纯化因子VII多肽。在本 发明的一个实施方案中，PH在8. 7到9. 9之间、例如在8. 8和9. 8之间、例如在8. 9和9. 7 之间、例如在9. 0和9. 6之间、例如在9. 1和9. 5之间、例如在8. 7和9. 8之间、例如在8. 7 禾口 9. 7之间、例如在8. 7和9. 6之间、例如在8. 8和9. 5之间、例如在8. 9和9. 4之间、例如 在9. 0和9. 2之间、例如9. 2左右。在本发明的一个实施方案中，在组氨酸存在的情况下纯化含有GLA残基的丝氨酸 蛋白酶。应当理解组氨酸可以用于将PH缓冲在5-7或8-10的范围。在本发明的一个实施方案中，在组氨酸存在的情况下纯化因子VII多肽。应当理 解组氨酸可为缓冲液提供5-7或8-10的pH范围。
在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是真核宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞。在本发明的一 个实施方案中，所述哺乳动物细胞选自HEK细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞和骨髓瘤细 胞例如SP2-0。在本发明的一个实施方案中，所述因子VII多肽是野生型人因子VII。在本发明的一个实施方案中，所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的 蛋白酶解活性(proteolytic activity)。在本发明的一个实施方案中，所述因子VII多肽是选自下列的因子VII相关多 肽L305V-FVII, L305V/M306D/ D309S-FVII,L305I-FVII, L305T-FVII， F374P-FVII， V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/ M298Q-FVII,K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII,L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII,K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII,K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII,K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII,S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII,K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16H/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16H/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16Q/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16Q/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/ V158D-
FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII,
F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII,F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII,F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII,F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子VII、S344A-因子VII、缺失Gla结构域的因子VIIa ；和PllQ/ K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G29IN-FVII、 R315N/V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序 列上具有添加、缺失或取代的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失 或取代的FVII。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比 (Ca2+ FVII多肽)高于20。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中钙离子与因子 VII多肽的摩尔比(Ca2+ FVII多肽)高于20、例如高于22、例如高于24、例如高于26、例 如高于28、例如高于30、例如高于34、例如高于38、例如高于42、例如高于45、例如高于50、 例如高于55、例如高于60、例如高于65、例如高于70、例如高于76、例如高于82、例如高于 90、例如高于95、例如高于100。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中钙离子与因子VII多肽的摩尔比 (Ca2+ FVII多肽)低于0.50。在本发明的一个实施方案中，在步骤(iii)中钙离子与因 子VII多肽的摩尔比(Ca2+ FVII多肽)低于0. 50、例如低于0. 45、例如低于0. 40、例如 低于0. 35、例如低于0. 30、例如低于0. 25、例如低于0. 20、例如低于0. 15、例如低于0. 10、 例如低于0. 05、例如0. 00。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中游离钙离子浓度高于1. 2mM。 在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中游离钙离子浓度高于1. 3mM、例如高于
1.4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如在 溶液饱和状态下的游离钙离子浓度。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中游离钙离子浓度低于 0. 10mM。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中游离钙离子浓度低于0.09、 例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于 0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中除了锌离子和钙离子外二价 金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM。在本发明的一个实施方案中，所述二价金属阳离 子选自 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。在本发明的一个实施方 案中，所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中除了锌离子和钙离子外二价 金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于 0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高 于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于 0. 5mM、例如高于1. OmM0在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中在另外的二价金属离子螯合 剂存在的情况下纯化因子VII多肽。 在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中在pH值低于7. 5时纯化因子 VII多肽。在本发明的一个实施方案中，pH值低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如 低于7. 1、例如低于7. 0、例如低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低 于6.0、例如5.5。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中在pH值高于8. 6时纯化因子 VII多肽。在本发明的一个实施方案中，PH值高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如 高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高 于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如高于10. 8、例如11. 0。在本发明的一个实施方案中，至少在一个纯化步骤中在组氨酸存在的情况下纯化 因子VII多肽。在本发明的一个实施方案中，获得的游离钙离子浓度高于1. 2mM。在本发明的一 个实施方案中，获得的游离钙离子浓度高于1. 3mM、例如高于1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如 高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如高于2. OmM、例如高于
2.ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、 例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、例如高于7. OmM、例如 高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高于40. OmM、例如高于 60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如在溶液饱和状态下的游离钙离 子浓度。
在本发明的一个实施方案中，获得的游离钙离子浓度低于0. 10mM。在本发明的一个实施方案中，获得的游离钙离子浓度低于0. 09、例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于
0.06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低 于 0. 00。在本发明的一个实施方案中，除了锌离子和钙离子外所获得的二价金属阳离子的 游离离子浓度高于0. 025mM。在本发明的一个实施方案中，所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、 Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和Uo2+。在本发明的一个实施方案中所述二价金属阳离子选自Mg2+、 Cu2+ 和 Mn2+。在本发明的一个实施方案中，除了锌离子和钙离子外所获得的二价金属阳离子的 游离离子浓度高于0. 025mM、例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高 于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高 于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于
1.OmM。在本发明的一个实施方案中，在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下稳定因 子VII多肽。在本发明的一个实施方案中，在pH低于7. 5时稳定因子VII多肽。在本发明的一 个实施方案中，PH低于7. 4、例如低于7. 3、例如低于7. 2、例如低于7. 1、例如低于7. 0、例如 低于6. 8、例如低于6. 6、例如低于6. 4、例如低于6. 2、例如低于6. 0、例如5. 5。在本发明的 一个实施方案中，在PH值高于8. 6时稳定因子VII多肽。在本发明的一个实施方案中，pH 值高于8. 7、例如高于8. 8、例如高于8. 9、例如高于9. 0、例如高于9. 1、例如高于9. 2、例如 高于9. 4、例如高于9. 6、例如高于9. 8、例如高于10. 0、例如高于10. 2、例如高于10. 4、例如 高于10. 8、例如11. 0。在本发明的一个实施方案中，在组氨酸存在的情况下稳定因子VII多肽。此处所使用的术语“因子IX多肽”是指人野生型因子IX和相对于野生型因子IX 表现出基本相同或提高的生物学活性的因子IX变体、因子IX相关的多肽以及因子IX衍生 物和因子IX缀合体。所述术语“因子IX”是指包括以其未切割(酶原)形式存在的因子 IX多肽以及已通过蛋白酶解处理产生其相应生物活性形式的多肽，所述生物活性形式的因 子IX多肽表示为因子IXa。相对于人因子IX，这类因子IX的变体可能表现出不同的性质， 包括稳定性、磷脂结合性、改变的特异性活性等。此处所使用的术语“因子VII多肽”是指野生型因子VII (例如具有公开于美国专 利号4，784，950的氨基酸序列的多肽)和相对于野生型因子VII表现出基本相同或提高的 生物学活性的因子VII变体、因子VII相关的多肽以及因子VII衍生物和因子VII缀合体。 所述术语“因子VII”是指包括以其未切割(酶原)形式存在的因子VII多肽以及已通过蛋 白酶解处理产生其相应生物活性形式的多肽，所述生物活性形式的因子VII多肽表示为因 子Vila。通常，通过在残基152和153之间切割因子VII来产生因子Vila。相对于人因子 VII，这类因子VII的变体可能表现出不同的性质，包括稳定性、磷脂结合性、改变的特异性 活性等。如此处所使用的“因子VII相关的多肽”包括多肽(包括变体)，在所述多肽中因子Vila的生物学活性相对于野生型因子Vila的活性已发生显著改变或减小。这些多肽包 括，但不限于已经引入特定氨基酸序列改变的因子VII或因子Vila，这些序列改变的引入 改变或破坏了所述多肽的生物活性。 此处所使用的术语“因子VII衍生物”是指野生型因子VII、相对于野生型因子VII 表现出基本相同或提高的生物学活性的因子VII的变体和因子VII相关多肽，其中一个或 更多个亲本肽上的氨基酸已经被化学修饰，例如通过烷基化、PEG化、酰化、酯化或酰胺化 等。这包括但不限于PEG化的人因子Vila、半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa和其变体。所述术语“PEG化的人因子Vila”是指具有缀合到人因子VIIa多肽上的PEG分子 的人因子Vila。应当理解PEG分子可附着到因子VIIa多肽的任何部分，包括所述因子VIIa 多肽的任何氨基酸残基或糖类部分。所述术语“半胱氨酸-PEG化的人因子Vila”是指具有 缀合到被引入到人因子VIIa中的半胱氨酸的巯基上的PEG的因子Vila。因子Vila在血液凝结中的生物学活性来源于其(i)结合组织因子(TF)的能力和 (ii)催化因子IX或因子X蛋白酶解断裂以产生被激活的因子IX或x(分别为因子IXa或 Xa)的能力。为了本发明目的，例如美国专利号5，997，864中所描述的，可通过使用因子VII 缺陷血浆和组织促凝血酶原激酶测量制剂提高血液凝结的能力来对因子VIIa生物活性进 行定量。在该测定中，生物学活性表示为相对于对照样品凝结时间的减少并且通过与含有 1单位/ml因子VII活性的混合人血清标准比较被转换成“因子VII单位”。可选择地，(i) 可通过测量因子VIIa在包含嵌入脂膜的TF和因子X的系统中产生因子Xa的能力对因子 VIIa 生物学活性进行定量(Persson 等人，J. Biol. Chem. 272 :19919_19924，1997) ； (ii)可 通过测量因子X在水系统中的水解对因子VIIa生物学活性进行定量；(iii)可通过使用基 于表面等离子共振的仪器测量其与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts. 413 =359-363, 1997)对因子Vila生物学活性进行定量和(iv)通过测量合成底物的水解对因子Vila生物 学活性进行定量。具有与野生型因子VIIa基本相同或提高的生物学活性的因子VII变体包括下列 多肽，当所述多肽在一个或更多个凝结测定、蛋白酶解测定或上述TF结合测定中被检测时 表现出至少大约25%、优选地至少大约50%、更优选地大约75%和更优选地至少大约90% 的由相同细胞类型产生的因子VIIa的特异性活性。相对于野生型因子VIIa具有显著减小 的生物学活性的因子VII变体是下列多肽，当所述多肽在一个或更多个凝结测定、蛋白酶 解测定或上述TF结合测定中被检测时表现出低于大约25%、优选地低于大约10%、更优选 地低于大约5%和最优选地低于大约的由相同细胞类型产生的因子VIIa的特异性活 性。相对于野生型因子VII具有显著改变的生物学活性的因子VII变体包括但不限于表现 TF非依赖性因子X蛋白酶解活性的因子VII变体和那些结合TF但不切割因子X的因子VII 变体。无论是表现与野生型因子VII基本相同或更好的生物活性、或相对于野生型因子 VII表现出显著改变或减少的生物学活性的因子VII变体包括但不限于，具有不同于野生 型因子VII氨基酸序列的多肽，所述序列的不同是通过一个或更多个氨基酸的插入、缺失 或取代获得的。具有与野生型因子VII基本相同的生物学活性的因子VII变体的非限定例子 包括 S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等人，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；如公开于美国专利号5，580，560的表现出增强的蛋白酶解稳定性的FVIIa变体；在残基 290和291之间或在残基315和316之间被蛋白酶解切割的因子Vila(Mollerup等人， Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；氧化形式的因子 Vila(Kornfelt 等人，Arch. Biochem. Biophys,363 :43_54，1999)；公开于 PCT/DK02/00189 的 FVII 变体；和公开于 WO 02/38162 (Scripps Research Institute)中的表现出增强的蛋白酶解稳定性的FVII变体； 公开于WO 99/20767 (University of Minnesota)的具有修饰的Gla结构域和表现出增强 的膜结合作用的FVII变体；和公开于WO 01/58935 (Maxygen ApS)中的FVII变体。相对于野生型因子VIIa具有增强生物学活性的VII变体的非限定例子包括 公开于 WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK 02/00635、丹麦专利申请 PA 200201423、丹麦专利申请PA200101627 ;W0 02/38162 (Scripps Research Institute)中的 FVII 变体；和公开于 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中的具有增强 活性的FVIIa变体。相对于野生型因子VII具有显著减少或改变的生物学活性的因子VI I 变体的非限定例子包括 R152E-FVIIa(ffiIdgoose 等人，Biochem 29 :3413_3420，1990)、 S344A-FVIIa(Kazama 等人，J. Biol. Chem. 270 :66_72，1995)、FFR-FVIIa(Hoist 等人，Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15 :515_520，1998)和缺少 Gla 结构域的因子 Vila(Nicolaisen 等 人，FEBS Letts. 317 =245-249,1993) 因子VII或因子VII相关多肽的例子包括但不限于 野生型因子VII，
L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/ M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E29V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/V305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/ K337A-FVII,L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII,L305V/K337A/E296V-FVII,L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII,L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII,K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII,K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII,
K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S3 14E/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII,K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16H/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16H/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K3 16Q/L305V/V158T/K337A/ M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K3 16Q/L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/ Κ337Α-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII,F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII,F374Y/L305V-FVII,F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII,F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII,F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII,F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII,F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/ S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/ V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/ V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII, S 60A_ 因子 VII ；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺少Gla结构域的因子VIIa ；和PllQ/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G29IN-FVII， R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 223Thr 到 240Asn 的氨基酸序 列中具有取代、添加或缺失的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加 或缺失的FVII。所使用的用于氨基酸取代的术语如下。第一个字母表示天然存在于人野生型FVII 位置上的氨基酸。紧跟其后的数字表示在人野生型FVII中的位置。第二个字母表示取代 (代替)所述天然氨基酸的不同氨基酸。例如M298Q，其中位于人野生型FVII 298位置的 甲硫氨酸被谷氨酰胺取代。另一个例子，V158T/M298Q，位于人野生型FVII 158位置的缬氨 酸被甲硫氨酸取代并且在同一个因子VII多肽中位于人野生型FVII 298位置的甲硫氨酸被谷氨酰胺取代。在本发明进一步的实施方案中，所述因子VII多肽是这样的多肽，其中所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约1.25。在一个实施方案中 所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约2.0。在进一步的 实施方案中所述因子VII多肽的活性与人野生型因子VIIa的活性之间的比率至少是大约 4. 0。在本发明进一步的实施方案中，所述因子VII多肽是这样的多肽，其中当进行因 子VIIa活性测定时所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大 约1. 25。在一个实施方案中当进行因子VIIa活性测定时所述因子VII多肽活性与人野生 型因子VIIa活性之间的比率至少是大约2. 0。在进一步实施方案中当进行因子VIIa活性 测定时所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约4.0。所述 因子VIIa的活性可通过描述于“测定”标题下的测定进行测量。在本发明进一步的实施方案中，所述因子VII多肽是这样的多肽，其中当进行“体 外水解测定”时所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约 1.25。在一个实施方案中当进行“体外水解测定”时所述因子VII多肽活性与人野生型因 子VIIa活性之间的比率至少是大约2. 0。在进一步实施方案中当进行“体外水解测定”时 所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约4. 0。在本发明进一步的实施方案中，所述因子VII多肽是这样的多肽，其中当进行“体 外蛋白酶解测定”时所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大 约1.25。在一个实施方案中当进行“体外蛋白酶解测定”时所述因子VII多肽活性与人野 生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约2.0。在进一步实施方案中当进行“体外蛋白酶 解测定”时所述因子VII多肽活性与人野生型因子VIIa活性之间的比率至少是大约4. 0。 在进一步实施方案中当进行“体外蛋白酶解测定”时所述因子VII多肽活性与人野生型因 子VIIa活性之间的比率至少是大约8. 0。本发明适合于与野生型相比具有增强活性的因子Vll/VIIa变体。可通过在如下 描述的合适的测定方法中进行检测以发现具有增强活性的因子Vll/VIIa变体。可将这些 测定当作体外检测中的简单预测定进行。因而，所述“测定”章节公开了用于本发明因子 VIIa变体活性测定的简单检测方法(冠以“体外水解测定”)。基于上面所述，特别感兴趣 的因子VIIa变体是这样的变体，其中当进行所述“体外水解测定”时所述变体活性和野生 型因子VII活性之间的比率大于1. 0，例如至少大约为1. 25，优选地至少大约为2. 0，例如至 少大约为3. 0或甚至更优选地至少大约为4. 0。也可通过使用合适浓度IOO-IOOOmM的生理学底物例如因子X( “体外蛋白酶解测 定”)(参见“测定”章节)对所述变体的活性进行测量，其中在加入合适的显色底物(例如 S-2765)后对产生的因子Xa进行测量。此外，所述活性测定可在生理学温度下进行。可在测定法中测量所述因子VIIa变体产生凝血酶的能力，所述测定法包括以生 理学浓度存在的相关凝血因子和抑制剂(当摸拟血友病A病症时除去因子VIII)以及活化 的血小板(如Monroe等人(1997) Brit. J. Haematol. 99，542-547的第543页所描述的，此 处引用作为参考)。此处描述的因子VII多肽可通过核酸重组技术产生。一般地，通过改造克隆的野生型因子VII核酸序列以编码想要的蛋白。然后将该改造过的序列插入表达载体，然后所述表达载体可被转化或转染到宿主细胞中。优选地以高等真核细胞特别是培养的哺乳动物 细胞作为宿主细胞。已知编码人因子VII的完整核酸和氨基酸序列(参见美国4，784，950， 其中描述了人重组因子VII的克隆和表达)。牛因子VII序列描述于Takeya等人，J. Biol. Chem. 263 14868-14872 (1988)中。可通过各种技术改变所述氨基酸的序列。可通过定点突变改变所述核酸序列。 用于定点突变的技术在本领域是众所周知的并且描述于例如Zoller和Smith(DNA 3 479-488,1984)或"Splicing byextension overlap “，Horton 等人，Gene 77，1989， pp. 61-68。因而，使用所述因子VII的核酸或氨基酸序列可引入所选择的改变。同样，使用 特异性引物进行聚合酶链式反应来制备DNA构建体的方法对本领域技术人员来说是非常 熟悉的(cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。编码本发明因子VII多肽的核酸构建体可以合适地来源于基因组或cDNA，例如根 据标准技术(cf. Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989),通过制备基因组或 cDNA文库并通过使用合成的寡核苷酸探针进行杂交筛选出编码完整或部分所述多肽的 DNA序列来获得。所述编码因子VII多肽的核酸构建体也可通过已建立的标准方法合成制备，例如 描述于 Beaucage 和 Caruthers，Tetrahedron Letters22 (1981)，1859-1869 中的磷酰胺方 法、或描述于Matthes等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805中的方法。根据磷酰胺方法， 合成(例如使用DNA自动合成仪)、纯化、退火、连接寡核苷酸并且将其克隆入合适的载体 上。此外，根据标准技术，所述核酸构建体可以是通过连接合成的、基因组或cDNA来 源的(如果合适)片段制备的合成的和基因组来源的混合物、合成的和cDNA来源的混合物 或基因组和cDNA来源的混合物，所述片段对应于所述整个核酸构建体的各个部分。所述核酸构建体优选地是DNA构建体。用于生产根据本发明的因子VII多肽的 DNA序列通常在因子VII的氨基端编码前原多肽(pre-pro polypeptide)以获得正确的翻 译后加工(例如谷氨酸残基的Y-羧化)和从宿主细胞中分泌。所述前原多肽可以是因子 VII或另外的维生素K依赖性血浆蛋白的前原多肽，例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C 或蛋白S。如本领域技术人员所知的，可以在所述因子VII多肽的氨基酸序列上进行另外的 修饰，在所述氨基酸序列上进行的上述修饰不会显著损害所述蛋白充当凝血剂的能力。例 如，也可以在激活切割位点上对所述因子VII多肽进行修饰以阻止酶原因子VII转化成其 活性双链形式，如通常描述于美国5，288，629中。用于表达因子VIIa变体的表达载体包括能够指导克隆的基因或cDNA转录的启 动子。优选的用于培养的哺乳动物细胞的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。病毒启 动子包括 SV40 启动子(Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1 :854_864，1981)和 CMV 启动子 (Boshart等人，Cell 41 =521-530,1985)。特别优选的病毒启动子是来自腺病毒2的主要 晚期启动子(Kaufman 和 Sharp, Mol. Cell. Biol. 2 :1304_1319，1982)。细胞启动子包括小 鼠的 K 基因启动子(Bergman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :7041_7045，1983)和小鼠 VH启动子(Loh等人，Cell 33 :85_93，1983)。特别优选的细胞启动子是小鼠金属硫蛋白_1启动子(Palmiter等人，Science 222 :809_814，1983)。表达载体也可包含一套RNA拼接位 点，所述拼接位点位于所述启动子的下游和用于因子VII自身序列的插入位点的上游。优 选的RNA拼接位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。表达载体也可在所述插入 位点的下游包含多聚腺苷酸化信号。特别优选的多聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期 或晚期多聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同上)、来自腺病毒5Elb区域的多聚腺苷酸 信号、人生长激素基因末端(DeNoto等人Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)或来自人因 子VII基因或牛因子VII基因的多聚腺苷酸化信号。所述表达载体也可包含非转录的病毒 前导序列，例如位于启动子和RNA拼接位点之间的腺病毒2的三重前导序列；和增强子序 列，例如SV40增强子。通过例如磷酸钙介导的转化(Wigler等人，Cell 14 =725-732,1978 ；Corsaro和 Pearson,Somatic Cell Genetics 7 :603_616,1981 ;Graham禾口Van der Eb,Virology 52d 456-467, 1973)或电穿孔(Neumann 等人，EMBO J. 1 :841_845，1982)将克隆的 DNA 序列导 入培养的哺乳动物细胞中。为鉴定和选择表达所述外源DNA的细胞，通常将赋予选择表型 (选择标记)的基因和目的基因或cDNA—起导入细胞中。优选的选择标记包括赋予对药 物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤抗性的基因。所述选择标记可以是可扩增的选择标记。 优选的可扩增的选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。Thilly对选择标记进行了综述 (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA，此处弓I用作为参 考)。本领域技术人员能够很容易地选择合适的选择标记。可以将位于分开质粒上的选择标记和目的基因同时导入细胞中或可将它们放入 相同质粒中导入细胞。如果在相同的质粒上，所述选择标记和目的基因可在不同或相同的 启动子控制之下，后一排列产生双顺反子信使。这种类型的构建体在本领域是熟知的(例 如，Levinson和Simonsen,U. S. 4，713，339)。向导入细胞的混合物中加入额外的DNA(称作 “载体DNA”)，也是有利的。在所述细胞已经吸收DNA后，将其培养在合适的培养基上，通常 1-2天，开始表达所述目的基因。用于培养所述细胞的培养基可以是任何用于培养所述宿 主细胞的常规培养基，例如基本培养基或含有合适补充物的复合培养基(complexmedia)。 合适的培养基可从商业提供者商业购得或可以根据公开的配方进行配制(例如在美国典 型培养物保藏中心的目录中)。通过使用本领域已知的方法制备所述培养基(参见，例如， references forbacteria and yeast ；Bennett, J. W.禾口 LaSure, L. , editors, MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press，CA，1991)。生长培养基通常包含碳源、氮源、必 需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。为了生产Y-羧化因子VII多肽， 所述培养基包含维生素K，优选地浓度为大约0. lmg/ml到大约5mg/ml。然后进行药物选择 以筛选出以稳定方式表达所述选择标记的培养细胞。对于已经转化了可扩增的选择标记的 细胞，可以增加药物浓度以选择增加的克隆序列拷贝数因此而增加了表达水平。然后筛选 表达想要的因子VII多肽的稳定转化的细胞克隆。优选的哺乳动物细胞系包括CHO(ATCC CCL 61)、C0S_1 (ATCC CRL1650)、幼小仓鼠 肾(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ；Graham等人，J. Gen. Virol. 36 :59_72，1977)细胞系。优选 的 BHK 细胞系是 tk-tsl3 BHK 细胞系(Waechter 和 Baserga，Proc. Natl. Acad. Sci. USA79 1106-1110，1982)，在后文中称作BHK 570细胞。所述BHK 570细胞系可从美国典型培养物 保藏中心，12301 Parklawn Dr. ,Rockvilie,MD 20852商业购得，ATCC保藏号为CRL 10314。tk-tsl3BHK细胞系也可按ATCC保藏号CRL 1632商业购得。此外，可使用许多其它细胞 系，包括 Rat Hep I (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、RatH印 II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、 TCMK (ATCC CCL 139)、Humanlung (ATCC HB 8065) ,NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)禾口 DUKX 细胞 (Urlaub 和 Chasin，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220，1980)。也可应用转基因动物技术生产本发明的因子VII多肽。优选地在雌性哺乳动物宿 主的乳腺中生产所述蛋白。在乳腺中表达并随后将目的蛋白分泌到奶中克服了从许多其它 来源中分离蛋白时遇到的困难。奶易于收集、可大量获得并且可很好地鉴定生化特征。此 夕卜，主要的奶蛋白以高浓度存在于奶中(通常从大约1到15g/l)。从商业的角度看，很清楚优选地使用大量产奶的品种作为宿主。尽管可以使用较小的动物例如小鼠和大鼠(并且优选地用于原理阶段的验证)，但优选地使用牲畜哺乳动 物，包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。绵羊是特别优选的，这是因为考虑到该物种之前的转 基因历史、奶产量、成本以及易于获得的用于收集绵羊奶的设备等因素(参见，例如，对影 响宿主物种选择因素进行比较的WO 88/00239)。通常想要的是选择已经用于奶产品用途而 饲养的宿主动物品种，例如EastFriesland绵羊，或在将来通过培养转基因系引入产奶牲 畜。无论在什么情况下，所用动物都应当使用熟知的、具有良好健康状况的动物。为了能在乳腺中获得表达，使用来自奶蛋白基因的转录启动子。奶蛋白基因包括 那些编码酪蛋白(参见美国5，304，489)、β乳球蛋白、乳清蛋白和乳清酸性蛋白的基因。 所述β乳球蛋白(BLG)启动子是优选的。在绵羊β乳球蛋白基因的情况下，通常使用非 常靠近所述基因5’侧翼序列的至少406bp的区域，尽管高达大约5kbp的更大部分所述5’ 侧翼序列是优选的，例如包含β乳球蛋白基因的非编码部分和5’侧翼启动子的约4. 25kbp DNA片段(参见Whitelaw等人，Biochem. J. 286 :3139 (1992))。类似的来自其它物种的启 动子DNA片段也是合适的。只要所述基因的基因组区域可以表达，也可以将β乳球蛋白基因的其它区域整 合到构建体中。本领域普便接受例如，缺少内含子的构建体与那些包含这类DNA序列的 构建体相比表达较弱(参见 Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 836840 (1988)； Palmiter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 478482 (1991) ；Whitelaw 等人，Transgenic Res. 1 =313(1991) ；WO 89/01343 ；和WO 91/02318，每篇文献在此引用作为参考)。在这个方 面，如果可能，使用包括编码目的蛋白或多肽的基因的全部或部分天然内含子的基因组序 列通常是优选的，因此进一步包含至少部分来自例如β乳球蛋白基因的内含子是优选的。 一个这样的区域是来自绵羊β乳球蛋白基因3’非编码区域并且提供内含子拼接和RNA多 聚腺苷酸化的DNA片段。当替代基因的天然3’非编码序列后，该绵羊β乳球蛋白片段可 增强和稳定所述目的蛋白或多肽的表达水平。在其它实施方案中，用来自奶特异性蛋白基 因相应的序列替代存在于所述因子VII变体序列起始ATG周围的区域。这种替代提供假定 的组织特异性起始环境以增强表达。用那些例如BLG基因的相应序列取代因子VII变体的 整个前原和5’非编码序列是很方便，尽管可取代更小的区域。为了在转基因动物中表达因子VII多肽，将编码因子VII变体有效地连接到额外 的其表达以产生表达单位所需的DNA片段上。这种额外的片段包括上述启动子和提供mRNA 转录终止和多聚腺苷酸化的序列。所述表达单位进一步包括有效地连接到编码改造过的 因子VII的片段上的编码分泌信号的序列。所述分泌信号序列可以是天然的因子VII分泌信号序列或可以是其它蛋白例如奶蛋白(参见，例如，vonHeijne，Nucl. Acids Res. 14: 46834690(1986)；和Meade等人，U. S. 4，873，316，此处引用作为参考)的分泌信号序列。尽管本质上可通过连接任何序列构建所述表达单位，但通过向包含所述额外DNA片段的质粒或噬菌体载体中插入因子VII变体序列可很方便地进行用于转基因动物中 的表达单位的构建。提供含有编码奶蛋白的DNA片段的载体和用因子VII变体多肽取 代编码所述奶蛋白的序列尤其方便；因此产生了包括奶蛋白基因表达调控序列的融合基 因。在任何情况下，在质粒或其它载体中的所述表达单位的克隆有利于所述因子VII变 体序列的扩增。在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中可很容易地进行扩增，因此所述载 体通常包含在细菌宿主细胞中具有功能的复制起点和选择标记。然后将所述表达单位导 入所选择的宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)中。异源DNA的导入可通过几条途径中 的一条进行，包括显微注射(例如美国专利号4，873，191)、逆转录病毒感染(Jaenisch， Science 240 =14681474(1988))或使用胚胎干(ES)细胞进行的定点整合(Bradley等 人的综述，Bio/TechnologylO =534539 (1992)) 0然后将所述卵植入假孕雌性的输卵管 或子宫中并且允许发育至分娩。携带有所述导入其生殖细胞系中的DNA的后代可将所 述DNA以正常的、孟德尔遗传方式传递给其后代，允许转基因畜群的发展。用于生产转 基因动物的普通方法在本领域是熟知的(参见，例如，Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,1986 ；Simons 等 A, Bio/Technology 6 179183 (1988) ；Wall 等人，Biol. R印rod. 32 :645651 (1985)； Buhler 等人，Bio/Technology 8 140143 (1990) ;Ebert 等人，Bio/Technology 9 835838(1991) ；Krimpenfort 等人，Bio/Technology 9:844847(1991) ；Wall 等人，J. Cell. Biochem. 49 113120 (1992) ；U. S. 4, 873, 191 ；U. S. 4, 873, 316 ；WO 88/00239, WO 90/05188， WO 92/11757 JPGB 87/00458)。用于将外源DNA序列导入哺乳动物和其生殖细胞的 技术最初是在小鼠上发展起来的(参见，例如，Gordon等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 73807384(1980) ；Gordon 和 Ruddle, Science 214 12441246 (1981) ；Palmiter 和 Brinster，Cell 41 343345 (1985) ；Brinster 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 44384442(1985)；和Hogan等人(同上))。随后这些技术被采纳用于更大型的动物，包括 家畜品种(参见，例如，WO 88/00239, WO 90/05188，和 WO 92/11757 ；和 Simons 等人，Bio/ Technology 6:179183(1988))。简而言之，在目前所使用的用于产生转基因小鼠或家畜 的最有效的途径中，根据已建立的技术将数百个线性目的DNA分子注射到一个受精卵前核 中。也可将DNA注射到受精卵的细胞质中。也可在转基因植物中进行生产。表达可以是系统性的或局限在特定器官中，例如 块茎(参见，Hiatt, Nature 344 469479 (1990) ；Edelbaum 等人，J. Interferon Res. 12 449453(1992) ；Si jmons 等人，Bio/Technology 8:217221(1990)；和 EP 0255378)。从细胞培养基或奶中回收本发明的因子VII多肽。可通过各种本领域已知的方法 纯化本发明的因子VII多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层 析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦(IEF)、分级溶解(例如，硫酸铵沉 淀)或萃取(参见，例如，Protein Purification^. -C. Janson和 Lars Ryden，editors，VCH Publishers, New York, 1989)。优选地，通过在抗因子VII抗体柱上进行亲和层析可纯化其。 钙依赖性单克隆抗体的使用描述于Wakabayashi等人，J. Biol. Chem. 261 :11097_11108，(1986)和 Thim 等人，Biochemistry 27:7785-7793，(1988)。通过常规的化学纯化方法 例如高效液相色谱可获得进一步的纯化。其它纯化方法包括柠檬酸钡沉淀法在本领域是 熟知的，并且可用于纯化此处描述的新的因子VII多肽(参见，例如，Scopes, R.，Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. ,1982)。为了治疗目的，优选地本发明的因子VII多肽要足够纯。因而，在本发明优选的实 施方案中本发明的因子VII多肽要纯化至至少达到大约90到95%的均一性，优选地达到至 少大约98%的均一性。可通过例如凝胶电泳和氨基端氨基酸测序估计纯度。将所述因子VII多肽在其激活位点切断以将其转化成其双链形式。可 根据本 领域已知的方法进行激活，例如根据那些公开于Osterud，等人的，Biochemistry 11 2853-2857 (1972) ；Thomas, U. S. PatentNo.4,456,591 ；Hedner 禾口 Kisiel， J.Cl in. Invest.71 1836-1841 (1983)；或 Kisiel 禾口 Fujikawa， Behring Inst.Mitt. 73 29-42(1983)的方法。可选择地，如 Bjoern 等人(Research Disclosure, 269 September 1986，pp. 564-565)所描述的，可通过将因子VII通过离子交换层析柱例如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等进行激活。然后可将所得的被激活的因子VII多肽按如 下所描述的进行配制和施用。测定体外水解测定对野生型(天然)因子VIIa和因子VIIa变体(两者在后文中称为“因子Vila”) 进行平行测定以直接比较其特异性活性。在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc, Denmark)上进 行所述测定。向存在于50mM H印es溶液(含有0. IM NaCl、5mM CaCl2和lmg/ml牛血清 白蛋白，PH 7.4)中的因子VIIa(终浓度IOOnM)中加入显色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基 苯胺(S-2288，Chromogenix, Sweden)至终浓度为 ImM。在Spec t raMax 340 板读数计 (Molecular Devices, USA)上连续测量405nm的吸光率。将20分钟温育过程中产生的减 去不含酶空白孔的吸光率后的吸光率用来计算变体和野生型因子VIIa活性的比率比率=(因子VIIa变体的A405nm) / (野生型因子VIIa的A405nm)。体外蛋白酶解的测定对野生型(天然)因子VIIa和因子VIIa变体(两者在后文中称为“因子Vila”) 进行平行测定以直接比较其特异性活性。在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行 所述测定。将存在于100微升50mM Hepes溶液(含有0. IM NaCl、5mM CaCl2和lmg/ml牛 血清白蛋白，PH 7.4)中的因子VIIa(IOnM)和因子X(0. 8 μ M)温育15分钟。然后通过加入 50μΙ^々50πιΜ H 印 es (含有 0. IM NaCl、20mM EDTA和 lmg/ml 牛血清白蛋白，pH 7. 4)停止对 因子X的切割。通过加入显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix， Swe-den)至终浓度为0. 5mM以测量所产生的因子Xa的量。在Spec t raMax 340板读数 计(Molecular Devices, USA)上连续测量405nm的吸光率。将10分钟内产生的减去不含 FVIIa的空白孔中的吸光率后的吸光率用来计算变体和野生型因子VIIa蛋白酶解活性的 比率比率=(因子VIIa变体的A405nm)/(野生型因子VIIa的A405nm)。⑶-FVIIa形成速率的测定⑶-FVIIa (GLA结构域缺失的FVIIa，39-406片段)形成速率被确定为在给定的一段时间内GD-FVIIa含量的相对增加量。将要确定GD-FVIIa形成速率的FVIIa溶液分两个 时间点取样。一个起始样品和一个在要考察的条件下(PH、浓度、温度等)温育后的样品。在 所述样品被取样后立即将其用样品缓冲液煮沸以在分析期间终止任何进一步的降解。通过 非还原性SDS-PAGE对所述两个样品进行分析并且测量⑶-FVIIa带相对于FVIIa的面积。 然后可将从初始样品到最终样品的温育期间GD-FVIIa含量的增加量除以温育时间以给出 ⑶-FVIIa形成速率。对具有大约lmg/ml浓度的FVIIa的样品进行SDS-PAGE，将所述样品 与等量的上样缓冲液混合并煮沸5分钟。将所述样品转移至含有12% NuPAGE Bis-Tris的 MOPS电泳缓冲液中的上样孔内。加载电场直至所述样品的前沿已迁移至凝胶的底部。将胶 盒打开，取出凝胶并转移至固定液、考马斯染色溶液中并最后在凝胶干燥前转移至脱色液 中。 存在于缓冲液(由125μΜ CaCl2, 75mM NaCl，IOmM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6组成)中 的1. 3mg/ml FVIIa溶液具有10%的初始⑶-FVIIa含量，温育24小时后，⑶-FVIIa含量已 增至70%。因此形成速率确定为60%⑶-FVIIa/24小时。在24小时期间，含有2. 5mM浓度 CaCl2的类似样品展现出⑶-FVIIa的含量从6. 8%增加至8. 2%，产生1. 6%⑶-FVIIa/24 小时的⑶-FVIIa形成速率。此处描述和要求权利保护的发明并受限于此处公开的特定实施方案的范围，因为 这些实施方案是用来说明本发明的几个方面的例子。任何等同的实施方案属于该发明的范 围。事实上，从前面的描述可看出除了此处显示和描述的，本发明的各种改变对于本领域技 术人员来说是显而易见的。这类改变也落在所附权利要求的范围内。在遇到冲突的情况下， 以包含定义的本公开内容为准。通过下列实施例对本发明进一步描述，所述实施例不应当被解释为限制本发明的 范围。附图简述

图1.缺失GLA结构域(⑶-FVIIa)的FVIIa的形成。该图显示FVIIa对Ca2+的摩 尔比与GD-FVIIa形成的速率(钙的当量=FVIIa Ca2+)。条件是1.3mg/ml FVIIa,75mM NaCl，IOmM甘氨酰甘氨酸，pH 8. 5。
实施例在下列的实施例中应当理解，所述方法可用于根据本发明的任何FVII多肽。还应 该理解在实施例2到实施例9中进行的步骤可以任意顺序组合使用以获得一定纯度的FVII 多肽。实施例1通过将Cu2+调节到200 μ M以稳定细胞培养收获物将500ml具有浓度为20mg/l的FVIIa类似物的BHK-21细胞培养上清液通过死端 式0. 45微米过滤器过滤。通过加入硝酸铜(II)溶液至Cu2+浓度为200 μ M以进一步稳定 所述含有浓度为2mM的游离Ca2+的收获物。在进一步加工前将所述经稳定的培养上清液贮 存在5°C下。实施例2在Cu2+存在的情况下通过HIC纯化FVII多肽并在低pH条件下进行洗脱。
在填充有Toyopearl MD-G Butyl树脂的柱子(内径IcmX长度7cm = 5.5ml)上 进行疏水相互作用层析(HIC)。所述柱子用IOCV的35mMCaCl2、0. ImM Cu (NO3)2^H2OU. 5M NaClUOmM tris(pH7. 5)进行平衡。平衡后，将42ml含有0. lmg/ml FVIIa的溶液加入柱 中。加载后，用IOCV的平衡缓冲液洗涤柱子。用20mM EDTA、50mM组氨酸、pH6. O洗脱所述 结合的FVII (a)。实施例3在Cu2+存在的情况下进行大小排阻层析将3ml存在于pH 6. O的组氨酸缓冲溶液中的极度活跃的FVIIa类似物样品(lmg/ ml)进行大小排阻层析。在将所述样品应用到用缓冲液(由50mM NaCl,0. ImM硝酸铜(II)、 IOmM 组氨酸组成,pH 为 6. 0)平衡的 Toyopearl HW-55F(内径 IcmX 长度 IOOcm = 79ml CV) 之前将所述样品通过1微米死端式过滤器进行过滤。上样缓冲液与平衡缓冲液相同。所有 纯化环节皆在5°C下以12cm/小时的流速进行。实施例4通过将pH调至6以稳定细胞培养收获物通过加入组氨酸至浓度为20mM接着调节pH至6. O以稳定500ml具有浓度为20mg/ 1的FVIIa类似物的CHO Kl细胞培养上清液。将所述经稳定的培养上清液通过死端式0. 45 微米过滤器进行过滤并在进一步加工前贮存于5°C下。实施例5在pH6的条件下进行阴离子交换层析在填充有 Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow 的柱子(内径 IcmX 长度 IOcm = 7.85柱体积(CV))上进行阴离子交换层析，所述柱子用5CV含有5mM EDTA、IOmM组氨酸、 PH6.0的溶液进行平衡。用40CV的含有lmg/ml FVIIa类似物的过滤溶液上样，接着用5CV 的50mM NaClUOmM组氨酸(pH6. 0)进行洗涤。用40CV pH6. 0、IOmM组氨酸缓冲液配制的 从50mM NaCl到750mM NaCl的NaCl梯度溶液进行洗脱。在5°C下以20CV/小时的流速进 行整个纯化过程。实施例6在pH9进行阴离子交换层析在填充有 Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow 的柱子(内径 IcmX 长度 IOcm = 7.85柱体积(CV))上进行阴离子交换层析，所述柱子用5CV含有5mM EDTA、IOmM组氨酸、 PH9.0的溶液进行平衡。加载40CV含有lmg/ml FVIIa类似物的过滤溶液，接着用5CV 50mM NaClUOmM组氨酸、pH9. 0的溶液进行洗涤。用40CV pH9. OUOmM组氨酸缓冲液配制的从 50mM NaCl到750mM NaCl的NaCl梯度溶液进行洗脱。在5°C下以20CV/小时的流速进行 整个纯化。实施例7在pH6下进行大小排阻层析将1.5ml存在于pH6.0的组氨酸缓冲溶液中的极度活跃的FVIIa类似物样品 (lmg/ml)进行大小排阻层析。在将所述样品应用到用缓冲液(由50mM NaClUOmM CaCl2, IOmM 组氨酸组成，pH 6. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(内径 IcmX 长度 60cm = 47ml CV)上之前，将所述样品通过0.45微米死端式过滤器进行过滤。上样缓冲液与平衡缓冲液相同。在5°C下以0. 3CV/小时的流速进行所有纯化环节。实施例8在pH9下进行大小排阻层析将1.5ml存在于pH9. 0的组氨酸缓冲溶液中的极度活跃的FVIIa类似物样品(lmg/ml)进行大小排阻层析。在将所述样品应用到用缓冲液(由50mM NaClUOmM CaCl2, IOmM 组氨酸组成，pH 9. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(内径 IcmX 长度 60cm = 47ml CV)之前，将所述样品通过0. 45微米死端式过滤器进行过滤。上样缓冲液与平衡缓冲 液相同。在5°C下以0. 3CV/小时的流速进行所有纯化环节。实施例9在pH6下进行超滤使用 50cm2 30kDa Biomax 过滤盒在 Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系统上对含有过度活跃的FVIIa类似物的HEK293培养上清液进行超滤。 加入组氨酸至浓度为20mM并将pH调节至6. 0以稳定通过死端式过滤的收获物。将500克 死端过滤和经稳定的收获物在2巴的跨膜压(TMP)下进行超滤直至获得质量接近0. 25克 的终保留物，相当于将极度活跃的FVIIa类似物浓缩20倍。在环境温度(20°C)下进行整 个过程。实施例10在pH6下进行免疫亲和纯化在1500ml HEK293培养上清液中加入钙至Ca2+浓度为IOmM和加入组氨酸缓冲液 至浓度为10mM、用HCl将pH调至6. 0并且将其通过0. 45微米死端式过滤器进行过滤以稳 定HEK293培养上清液。将所述经稳定的培养上清液加载到用固定在Pharmacia Sepharose 4B上的Ca2+依赖性抗FVIIa单克隆抗体填充的柱子(内径1. 6cmX长度IOcm = 20ml CV) 上。加载前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM组氨酸、pH 6. 0的溶液平衡所述柱子。加载后，用 IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2、IOmM 组氨酸、pH 6. 0 的溶液洗涤柱子。用 10CV，s 30mM EDTA, 50mM组氨酸、pH6. 0的溶液洗脱结合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小时的流速进行整个纯 化过程。实施例11 在pH9下进行免疫亲和纯化在1500ml HEK293培养上清液中加入钙至Ca2+浓度为IOmM和加入组氨酸缓冲液 至浓度为10mM、用HCl将pH调至9. 0并且将其通过0. 45微米死端式过滤器进行过滤以稳 定HEK293培养上清液。将所述经稳定的培养上清液加载到用固定在Pharmacia Sepharose 4B上的Ca2+依赖性抗FVIIa单克隆抗体填充的柱子(内径1. 6cmX长度IOcm = 20ml CV) 上。加载前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM组氨酸、pH9. 0的溶液平衡柱子。加载后，用IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2、IOmM 组氨酸、pH9. 0 的溶液洗涤柱子。用 IOCV 的 30mM EDTA、50mM 组氨酸、pH9. 0的溶液洗脱结合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小时的流速进行整个纯化过 程。实施例12通过调节Ca2+浓度至IOmM以稳定细胞培养收获物通过向450ml含有浓度为50mg/ml的FVIIa类似物和浓度大约为2mM的钙离子的HEK293细胞培养上清液中加入CaCl2溶液至Ca2+终浓度为IOmM以稳定HEK293细胞培养上 清液。将所述溶液通过0. 45微米死端式过滤器进行过滤并在进一步处理前贮存于5°C下。 实施例I3在20mMCa2+存在的情况下进行超滤和渗滤使用 50cm2 30kDa Biomax 过滤盒在 Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系统上对含有过度活跃的FVIIa类似物进行超滤。通过加入钙溶液至Ca2+ 浓度为20mM、加入组氨酸至浓度为IOmM并将pH调至6. O以稳定FVIIa类似物洗脱液。将 400克经稳定的FVIIa类似物在2巴的跨膜压(TMP)下进行超滤直至获得质量大约为0. 25 克的终保留物，相当于浓缩16倍。超滤后接着用3倍体积的20mM CaCl2、IOmM组氨酸、pH6. O 的缓冲液进行颠倒渗滤(turnoverdiafiltration)。在环境温度(20°C )下进行整个过程。实施例14在20mMCa2+存在的情况下进行免疫亲和纯化将1000ml BHK-21培养上清液通过0. 45微米死端式过滤器进行过滤，所述BHK-21 培养上清液已通过加入钙至Ca2+离子浓度为IOmM和加入tris缓冲液至浓度为IOmM以及 接着用HCl将pH调节至8得以稳定。将经稳定的培养上清液加载到用固定在Pharmacia Sepharose4B上的Ca2+-依赖性抗FVIIa单克隆抗体填充的柱子(内径1. 6cmX长度IOcm =20ml CV)上。在加载前，用5C的IOmM CaCl2UOmM tris、pH8的溶液平衡所述柱子。力口 载后，用 IOCV 的 2M NaClUOmM CaCl2UOmM tris、pH8 的溶液洗涤柱子。用 IOCV 的 30mM EDTA、50mM tris、pH8的溶液洗脱结合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小时的流速进行整个 纯化过程。通过加入氯化钙至终浓度为50mM立即对所述洗脱液进行稳定。实施例I5通过在20mMCa2+存在的情况下进行加样和洗涤接着于pH6下洗脱来进行免疫亲和纯化。通过在800ml CHO Kl培养上清液中加入钙至Ca2+浓度为IOmM来稳定CHO Kl培养 上清液。接着，加入tris缓冲液至浓度为10mM，用HCl将pH调至7. 5并且通过0. 45微米 死端式过滤器进行过滤。将经稳定的培养上清液加载到用固定在Pharmacia Sepharose 4B 上的Ca2+-依赖性抗FVIIa单克隆抗体填充的柱子(内径1. 6cmX长度2cm = 4ml CV)上。 在加载前，用5CV的IOmM CaCl2UOmM tris、pH7. 5的溶液平衡所述柱子。加载后，用IOCV 的2M NaClUOmM CaCl2UOmM tris、ρΗ7· 5的溶液洗涤柱子，接着用IOCV的含有2Μ NaCl、 IOmM CaCl2UOmM组氨酸、pH6. 0的溶液进行第二次洗涤。用IOCV的30mM EDTA、50mM组氨 酸、PH6.0的溶液洗脱结合的FVII (a)。在5°C下以12CV/小时的流速进行整个纯化过程。实施例I6在Ca2+存在的情况下进行大小排阻层析将5ml存在于pH6. 0的组氨酸缓冲溶液中的极度活跃的FVIIa类似物样品(lmg/ ml)进行大小排阻层析。在将所述样品应用到用缓冲液(由50mM NaCl、35mM CaCl2UOmM组 氨酸组成，pH6. 0)平衡的 Pharmacia superdex 200 柱(内径 IcmX 长度 8Ocm = 63ml CV) 之前，将所述样品通过1微米死端式过滤器进行过滤。上样缓冲液与平衡缓冲液相同。在 5°C下以15cm/小时的流速进行整个纯化过程。实施例Π
在pH6和高Ca2+浓度的条件下进行超滤和渗滤ji M 50cm2 30kDa Biomax ii ^ ^ Millipore lab scaleTangential Flow Filtration(TFF)系统上对含有过度活跃的FVIIa的HEK293培养上清液进行超滤。通过 加入组氨酸至浓度为20mM并将pH调至6. O以稳定所述通过死端式过滤的收获物。向500 克死端式过滤的和经稳定的收获物中加入钙至钙浓度为35mM，并在2巴的跨膜压(TMP)下 进行超滤直至获得质量大约为0. 25克的终保留物，相当于将极度活跃的FVIIa类似物浓缩 20倍。超滤后接着用3倍体积的缓冲液(35mM CaCl2、IOmM组氨酸、pH 6.0)进行颠倒渗滤 (turnoverdiafiltration)。在两个操作中使用相同的TMP。在环境温度(20°C )下进行整 个过程。
实施例18通过将pH调至6和添加Cu2+以稳定收获物将500ml含有浓度为50mg/l的FVIIa类似物的CH0-K1细胞培养上清液通过0. 45 微米死端式过滤器进行过滤。向所述含有2mM Ca2+的收获物中加入组氨酸至浓度为10mM， 接着用HCl将pH调至6. 0。通过加入硝酸铜(II)溶液至Cu2+浓度为200 μ M以进一步稳 定所述收获物。在进一步处理前将所述经稳定的培养上清液贮存在5°C下。实施例19通过将pH调节至6和添加Ca2+以稳定收获物向IOOOml含有浓度为50mg/ml的FVIIa类似物和浓度大约为2mM的钙离子的 HEK293细胞培养上清液中加入CaCl2溶液至Ca2+终浓度为IOmM以稳定HEK293细胞培养上 清液。加入组氨酸至浓度为10mM，接着用HCl将pH调节至6.0。将所述溶液通过0. 45微 米死端式过滤器进行过滤并且在进一步处理前贮存于5°C下。实施例2O通过实验检测Cu2+对FVII多肽稳定性的影响，在所述实验中在各种浓度Cu2+存在 的情况下纯化的FVII多肽被吸附在Q-S印harose FF基质上。在1. 5ml试管中用800 μ 1 溶有 50 μ 1 Q-Sepharose FF 的缓冲液(IOmM Tris、50mM NaCl、2mM CaCl2 和各种浓度的硝 酸铜(II))温育500 μ g FVII多肽。在1小时和2小时后通过离心将所述基质沉淀并移走 上清液。加800 μ 1 IOmM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl2、pH8. 0的缓冲液并且在混合和离心 后收回上清液样品并通过SDS-PAGE进行分析。实施例2I通过下列4个层析步骤对FVII多肽进行纯化和激活步骤1:通过稀释将含有FVII多肽的细胞培养基调整到离子强度低于lOmS/cm并应用到 用缓冲液A (IOmM三羟基甲胺甲烷(Tris)、150mMNaCl、pH8)预平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同缓冲液中的NaCl溶液洗涤后，用缓冲液B(10mM Tris, 150mM NaCl、25mM CaCl2 pH8)洗脱 FVII 多肽。步骤2 将含有104mg/l FVII多肽的洗脱溶液调整至终组合物(IOmMTrisUM NaCl、25mM (Μη2、70μΜ硝酸铜(II)pH 7. 5)并且应用到固定有抗FVII单克隆抗体的S印harose柱子 上。
所述抗体柱子用缓冲液C(10mM TrisUOOmM NaCl、20mM CaCl2、70 μ M 硝酸铜 (II)，ρΗ7. 5)预平衡。然后用 IOmM Tris、2M NaCl、20mMCaCl2、70 μ M 硝酸铜(ΙΙ)ρΗ7. 5 的 溶液洗涤柱子，接着用缓冲液C洗涤。之后用缓冲液(75mM扑化、30福柠檬酸三钠、7(^1 硝酸铜(II)，PH7. 5)洗脱FVII多肽。
步骤3 所述洗脱物立即应用于用缓冲液(IOmM Tris ； 150mM NaCl ；70 μ M硝酸铜(ΙΙ)ρΗ 8. 6)预平衡的Q-S印harose柱子上。用相同缓冲液洗涤所述柱子并且用缓冲液A到缓冲液D (IOmMTris ；500mM NaCl ； 70 μ M硝酸铜(II)PH 8.6)的线性梯度洗脱FVII多肽。步骤4 通过稀释将含有FVII多肽的级分调整至离子强度低于lOmS/cm并立即应用 于用缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaClJOyM硝酸铜(II)pH 8.6)预平衡的 Q-Sepharose 柱子上。在用缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl ；70 μ M硝酸铜(II)ρΗ 8. 6)和缓冲 液E(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ；70 μ M硝酸铜(II)，ρΗ 8.6)洗涤后，用缓冲液E到 缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 ；70 μ M硝酸铜(II),ρΗ 8. 6)的线性 梯度洗脱FVII多肽。流速为1体积/小时。实施例22通过下列4个层析步骤对FVII多肽进行纯化和激活步骤1 通过稀释将含有FVII多肽的细胞培养基调整到离子强度低于lOmS/cm并应用到 用缓冲液A (IOmM三羟基甲胺甲烷(Tris)、150mMNaCl、pH8)预平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同缓冲液中的NaCl溶液洗涤后，用缓冲液B(10mM Tris ； 150mM NaCl ；25mM CaCl2 pH8)洗脱 FVII 多肽。步骤2 将含有104mg/l FVII多肽的洗脱溶液调整至终组合物(IOmMTrisUM NaCl、25mM (Μη2、70μΜ硝酸铜(ΙΙ)ρΗ7. 5)并且应用于固定有抗FVII单克隆抗体的S印harose柱子 上。所述抗体柱子用缓冲液C(IOmMTrisUOOmM NaCl、20mM CaCl2、70 μ M硝酸铜(II) ρΗ 7. 5)预平衡。然后用 IOmM Tris ；2Μ NaCl ；20mMCaCl2 ；70 μ M硝酸铜(ΙΙ)ρΗ7· 5 的溶液 洗涤柱子，接着用缓冲液C洗涤。之后用缓冲液(75mM 1^8、30福柠檬酸三钠、7(^1硝酸 铜(II)pH7. 5)洗脱FVII多肽。步骤3:将所述洗脱物立即应用于用缓冲液(IOmM Tris ； 150mM NaCl ；70 μ M硝酸铜(II) ρΗ 8. 6)预平衡的Q-S印harose柱子上。用相同缓冲液洗涤柱子并且用缓冲液A到缓冲液D(10mM Tris ；500mM NaCl ； 70 μ M硝酸铜(II)PH 8.6)的线性梯度洗脱FVII多肽。步骤4 通过稀释将含有FVII多肽的级分调整至浓度为2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)并且离子强度低于lOmS/cm，并立即应用于用缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl pH 8.6) 预平衡的Q-S印harose柱子上。在用缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl ；pH 8. 6)和缓冲液E (IOmM甘氨酰 甘氨酸；IOOmM NaCl pH 8. 6)洗涤后，用缓冲液E到缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 pH 8. 6)的线性梯度洗脱FVII多肽。流速为1体积/小时。 实施例23通过下列4个层析步骤对FVII多肽进行纯化和激活步骤1 通过稀释将含有FVII多肽的细胞培养基调整至离子强度低于lOmS/cm并应用到 用缓冲液A (IOmM三羟基甲胺甲烷(Tris)、150mMNaCl、pH8)预平衡的Q-S印harose柱子上。在用175mM溶解于相同缓冲液中的NaCl溶液洗涤后，用缓冲液B(10mM Tris ； 150mM NaCl ；25mM CaCl2 pH 8)洗脱 FVII 多肽。步骤2 将含有104mg/l FVII多肽的洗脱溶液调整至终组合物(IOmMTris ；IM NaCl ；25mM CaCl2 ；70 μ M硝酸铜(ΙΙ)ρΗ7. 5)并且应用于固定有抗FVII单克隆抗体的S印harose柱子 上。所述抗体柱子用缓冲液C(IOmM Tris ； IOOmM NaCl ；20mM CaCl2 ；70 μ M硝酸铜(II) pH 7. 5)预平衡。然后用 IOmM Tris ；2Μ NaCl ；20mMCaCl2 ；70 μ M硝酸铜(ΙΙ)ρΗ7· 5 的溶液 洗涤柱子，接着用缓冲液C洗涤。之后用缓冲液(75mM Tris ；30mM柠檬酸三钠；70 μ M硝酸 铜(ΙΙ)ρΗ7. 5)洗脱FVII多肽。步骤3 将所述洗脱物调整至浓度为2mM的EDTA并立即应用于用缓冲液(IOmM Tris ； 150mM NaCl pH 8.6)预平衡的 Q-S印harose 柱子上。用相同缓冲液洗涤所述柱子并且用缓冲液A到缓冲液D (IOmMTris ；500mM NaCl PH 8.6)的线性梯度洗脱FVII多肽。 步骤4 通过稀释将含有FVII多肽的级分调整至离子强度低于lOmS/cm，并立即应用于用 缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl pH 8.6)预平衡的Q-S印harose柱子上。在用缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl pH 8. 6)和缓冲液E (IOmM甘氨酰甘 氨酸；IOOmM NaCl pH 8. 6)洗涤后，用缓冲液E到缓冲液(IOmM甘氨酰甘氨酸；IOOmM NaCl ； 15mM CaCl2 pH 8. 6)的线性梯度洗脱FVII多肽。流速为1体积/小时。实施例24因子VII多肽的超滤和渗滤收获130升含有因子VII多肽的CHO细胞培养上清液。通过加入组氨酸至10mM、将pH调至6. 0以稳定所述收获物并加入ImM CaCl2。将 所述上清液通过包括3. 0 μ m、l. 0 μ m和0. 3 μ mMillipore clarigard过滤器的一排过滤器 (filter train)中进行过滤。将所述经过滤的上清液通过0. 2m2的Millipore Biomax 50 膜进行超滤直至体积减小10倍。使用32psi的TMP调定点和600ml/分钟的交叉流调定点 进行超滤。达到想要的保留体积后，进行3倍体积的颠倒渗滤。所述渗滤缓冲液由5mM组氨酸，20mM NaCl, ImM CaCl2,0. 07g/l Tween 80, ρΗ 6· 0 组成。Wt-FVIIa的超滤和渗滤收获100升含有人野生型VIIa的CHO细胞培养上清液并且通过加入组氨酸至浓 度为10mM、将ρΗ调节至6. O和加入ImM CaCl2予以稳定。将所述上清液过滤并通过0. 2m2 的Millipore Biomax 50膜进行超滤直至体积减小10倍。当达到想要的保留体积后，进行 3倍体积的颠倒渗滤。所述渗滤缓冲液由5mM组氨酸，20mM NaCl, ImM CaCl2,0. 07g/l Tween 80，ρΗ 6. O 组成 。
权利要求
用于生产经纯化的含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括(i)在适合于表达所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的条件下在培养基中培养表达所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的宿主细胞；(ii)回收包含所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的所有或部分培养基；并且(iii)从培养基中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶；其中在步骤(iii)中pH具有在4.5和6.9之间的值或具有在8.6和10之间的值。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度高于1.2mM。
3.权利要求2的方法，其中在步骤(iii)中所述游离钙离子浓度高于1.3mM，例如高于 1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶 液饱和状态下的游离钙离子浓度。
4.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)中游离钙离子浓度低于0.10mM。
5.权利要求4的方法，其中在步骤(iii)中所述游离钙离子浓度低于0.09，例如低于 0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低 于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二 价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM.。
7.权利要求6的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
8.权利要求7的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
9.权利要求6到8中任一项的方法，其中在步骤(iii)中除了锌离子和钙离子外的二 价金属阳离子的所述游离离子浓度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例 如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、 例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如 高于0. 5mM、例如高于1. OmM。
10.权利要求1到9中任一项的方法，其中在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下 于步骤(iii)中纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
11.权利要求1到10中任一项的方法，其中pH在4.5和6. 9之间于步骤(iii)中纯化 所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
12.权利要求11的方法，其中pH在4.7到6. 8之间、例如在4. 9和6. 7之间、例如在 5. 1和6. 6之间、例如在5. 3和6. 5之间、例如在5. 5和6. 4之间、例如在5. 7和6. 3之间、 例如在5. 8和6. 2之间、例如在5. 9和6. 1之间、例如6. 0左右。
13.权利要求1到10中任一项的方法，其中pH在8.6和10之间于步骤(iii)中纯化 所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
14.权利要求13的方法，其中pH在8.7到9. 9之间、例如在8. 8和9. 8之间、例如在 8. 9和9. 7之间、例如在9. 0和9. 6之间、例如在9. 1和9. 5之间、例如在8. 7和9. 8之间、例如在8. 7和9. 7之间、例如在8. 7和9. 6之间、例如在8. 8和9. 5之间、例如在8. 9和9. 4 之间、例如在9. O和9. 2之间、例如9. 2左右。
15.权利要求11到14中任一项的方法，其中在组氨酸存在的情况下纯化所述含有GLA 残基的丝氨酸蛋白酶。
16.权利要求1到15中任一项的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物细胞选自HEK细胞、BHK细胞、CHO细胞、 COS细胞和骨髓瘤细胞例如SP2-0。
19.权利要求1到18中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因子 IX多肽。
20.权利要求1到18中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因子 VII多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
22.权利要求20的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
23.权利要求20的方法，其中所述因子VII多肽是选自下列的因子VII相关多肽 L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII,L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V58D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII， L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314EE/305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E96V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V58D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374YE296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII， L305V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/E296V/S314E-FVII, L305V/M298Q/S314E-FVII, K337A/S314E/V158T-FVII, K337A/S314E/E296V-FVII, K337A/V158T/M298Q-FVII, K337A/M298Q/E296V-FVII， K337A/E296V/V158D-FVII, V158D/S314E/E296V-FVII, V158T/S314E/E296V-FVII, V158T/M298Q/E296V-FVII,F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, /L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T；S314E-FVII,F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/V158D/ L305V/ L305V/ 'L305V/ 'L305V/ 'L305V/ 'L305V/ 'L305V/ 'L305V/'E296V/ 'V158D/ 'E296V/ 'E296V/ 'E296V/ 'M298Q/ 'V158D/ 'V158D/ 'V158D/'M298Q/ 'E296V/ 'M298Q/ 'M298Q/ 'K337A/ 'K337A/ 'E296V/ 'E296V/ 'M298Q/'K337A/ 'M298Q/ 'V158T/ 'K337A/ 'V158T/ 'V158T/ 'M298Q/ 'K337A/ 'K337A/S314E-FVII S314E-FVII S314E-FVII V158T-FVII S314E-FVII S314E-FVII K337A-FVII S314E-FVII S314E-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 结构域的因子 Vila ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
24.用于纯化含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，其中含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶 的溶液要经过多个纯化步骤，其中在至少一个纯化步骤中PH具有在4. 5和6. 9之间的值或 具有在8. 6和10之间的值。
25.权利要求24的方法，其中在至少一个纯化步骤中游离钙离子的浓度高于1.2mM。
26.权利要求25的方法，其中在至少一个纯化步骤中所述游离钙离子的浓度高于 1. 3mM，例如高于1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、 例如高于1. 9mM、例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如 高于2. 4mM、例如高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高 于5. OmM、例如高于6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于 10. OmM、例如高于20mM、例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于 0. 1M、例如高于1M、例如溶液饱和状态下的游离钙离子浓度。
27.权利要求24的方法，其中在至少一个纯化步骤中所述游离钙离子的浓度低于 0.10mM。
28.权利要求27的方法，其中在至少一个纯化步骤中所述游离钙离子的浓度低于 0. 09，例如低于0. 08、例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低 于0. 03、例如低于0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
29.权利要求24到28中任一项的方法，其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和钙离 子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM。
30.权利要求29的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、CU2+、Mn2+、C02+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
31.权利要求30的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
32.权利要求29到31中任一项的方法，其中在至少一个纯化步骤中除了锌离子和 钙离子外的二价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM,例如高于0. 03mM、例如高于 0. 035mM、例如高于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高 于0. 06mM、例如高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于 0. 3mM、例如高于0. 5mM、例如高于1. OmM。
33.权利要求24到32中任一项的方法，其中在至少一个纯化步骤中在另外的二价金属 离子螯合剂存在的情况下纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
34.权利要求24到33中任一项的方法，其中pH在4.5和6. 9之间于步骤(iii)中纯 化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
35.权利要求34的方法，其中pH在4.7到6. 8之间、例如在4. 9和6. 7之间、例如在’5. 1和6. 6之间、例如在5. 3和6. 5之间、例如在5. 5和6. 4之间、例如在5. 7和6. 3之间、 例如在5. 8和6. 2之间、例如在5. 9和6. 1之间、例如6. 0左右。
36.权利要求24到33中任一项的方法，其中pH在8.6和10之间于步骤(iii)中纯化 所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
37.权利要求36的方法，其中pH在8.7到9. 9之间、例如在8. 8和9. 8之间、例如在 8. 9和9. 7之间、例如在9. 0和9. 6之间、例如在9. 1和9. 5之间、例如在8. 7和9. 8之间、 例如在8. 7和9. 7之间、例如在8. 7和9. 6之间、例如在8. 8和9. 5之间、例如在8. 9和9. 4 之间、例如在9. 0和9. 2之间、例如9. 2左右。
38.权利要求34到37中任一项的方法，其中在至少一个纯化步骤中在组氨酸存在的情 况下纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
39.权利要求24到38中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
40.权利要求24到38中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因 子VII多肽。
41.权利要求40的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
42.权利要求40的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
43.权利要求40的方法，其中所述因子VII多肽是选自下列的因子VII相关多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L30V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V58D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII， F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374YV158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII,F374Y/V158D/E296V-FVII, V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII， L305V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/E296V/S314E-FVII, L305V/M298Q/S314E-FVII, K337A/S314E/V158T-FVII, K337A/S314E/E296V-FVII, K337A/V158T/M298Q-FVII, K337A/M298Q/E296V-FVII， K337A/E296V/V158D-FVII, V158D/S314E/E296V-FVII, V158T/S314E/E296V-FVII, V158T/M298Q/E296V-FVII,F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVIIF374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, /L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/ F374Y/V158D/ L305V/ L305V/ L305V/ L305V/ L305V/ L305V/'E296V/ 'V158D/ 'E296V/ 'E296V/ 'E296V/ 'M298Q/ 'V158D/'M298Q/ 'E296V/ 'M298Q/ 'M298Q/ 'K337A/ 'K337A/ 'E296V/'K337A/ 'M298Q/ 'V158T/ 'K337A/ 'V158T/ 'V158T/ 'M298Q/S314E-FVII S314E-FVII S314E-FVII V158T-FVII S314E-FVII S314E-FVII K337A-FVIIF374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 结构域的因子 Vila ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
44.用于在溶液中稳定含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法，所述溶液包含含有GLA残 基的丝氨酸蛋白酶，其中所述包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液要经过下列步骤 加入钙以获得高于1.2mM或低于0. 10mM的游离钙离子浓度；和/或加入除锌离子和钙离子 外的二价金属离子以获得高于0. 025mM的钙离子和锌离子之外的游离二价金属阳离子浓 度；和/或将包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的溶液的pH值调节在4. 5和6. 9之间或在 8. 6和10之间。
45.权利要求44的方法，其中所获得的游离钙离子浓度高于1.2mM。
46.权利要求45的方法，其中所获得的游离钙离子浓度高于1.3mM，例如高于1.4mM、 例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、例如 高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如高于 2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于6. OmM、 例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、例如高 于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶液饱和 状态下的游离钙离子浓度。
47.权利要求44的方法，其中所获得的游离钙离子浓度低于0.10mM。
48.权利要求47的方法，其中所获得的游离钙离子浓度低于0.09，例如低于0. 08、例如 低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于0. 02、 例如低于0. 01、例如低于0. 00。
49.权利要求44到48中任一项的方法，其中所获得的除了锌离子和钙离子外的二价金 属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM。
50.权利要求49的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、CU2+、Mn2+、C02+、Fe2+、Sm2+、 Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
51.权利要求50的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
52.权利要求49到51中任一项的方法，其中所获得的除了锌离子和钙离子外的二价 金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高于 0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如高 于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于 0. 5mM、例如高于1. OmM。
53.权利要求44到52中任一项的方法，其中在另外的二价金属离子螯合剂存在的情况下稳定所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
54.权利要求44到53中任一项的方法，其中pH在4.5和6. 9之间于步骤(iii)中纯 化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
55.权利要求54的方法，其中pH在4.7到6. 8之间、例如在4. 9和6. 7之间、例如在 5. 1和6. 6之间、例如在5. 3和6. 5之间、例如在5. 5和6. 4之间、例如在5. 7和6. 3之间、 例如在5. 8和6. 2之间、例如在5. 9和6. 1之间、例如6. O左右。
56.权利要求44到53中任一项的方法，其中pH在8.6和10之间于步骤(iii)中纯化 所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
57.权利要求56的方法，其中pH在8.7到9. 9之间、例如在8. 8和9. 8之间、例如在 8. 9和9. 7之间、例如在9. 0和9. 6之间、例如在9. 1和9. 5之间、例如在8. 7和9. 8之间、 例如在8. 7和9. 7之间、例如在8. 7和9. 6之间、例如在8. 8和9. 5之间、例如在8. 9和9. 4 之间、例如在9. 0和9. 2之间、例如9. 2左右。
58.权利要求54到57中任一项的方法，其中在组氨酸存在的情况下稳定所述含有GLA 残基的丝氨酸蛋白酶。
59.权利要求44到58中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
60.权利要求44到58中任一项的方法，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因 子VII多肽。
61.权利要求60的方法，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
62.权利要求60的方法，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人因子FVIIa的蛋白 酶解活性。
63.权利要求60的方法，其中所述因子VII多肽是选自下列的因子VII相关多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, Vl58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII,L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F374Y/ V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVIIF374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVIIF374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 结构域的因子 VIIa ；和 P11Q/K33E-FVII、 T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
64.包含含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶溶液的组合物，所述溶液的pH具有在4.5和6. 9 之间的值或具有在8. 6和10之间的值。
65.权利要求64的组合物，其中所获得的游离钙离子的浓度高于1.2mM。
66.权利要求65的组合物，其中所获得的所述游离钙离子的浓度高于1.3mM，例如高于 1. 4mM、例如高于1. 5mM、例如高于1. 6mM、例如高于1. 7mM、例如高于1. 8mM、例如高于1. 9mM、 例如高于2. OmM、例如高于2. ImM、例如高于2. 2mM、例如高于2. 3mM、例如高于2. 4mM、例如 高于2. 5mM、例如高于2. 6mM、例如高于3. OmM、例如高于4. OmM、例如高于5. OmM、例如高于 6. OmM、例如高于7. OmM、例如高于8. OmM、例如高于9. OmM、例如高于10. OmM、例如高于20mM、 例如高于40. OmM、例如高于60. OmM、例如高于80. OmM、例如高于0. 1M、例如高于1M、例如溶 液饱和状态下的游离钙离子浓度。
67.权利要求64的组合物，其中所获得的游离钙离子的浓度低于0.10mM。
68.权利要求67的组合物，其中所获得的游离钙离子的浓度低于0.09，例如低于0. 08、 例如低于0. 07、例如低于0. 06、例如低于0. 05、例如低于0. 04、例如低于0. 03、例如低于 0. 02、例如低于0. 01、例如低于0. 00。
69.权利要求64到68中任一项的组合物，其中所获得的除了锌离子和钙离子外的二价 金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM。
70.权利要求69的组合物，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、 Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+ 和 Uo2+。
71.权利要求70的方法，其中所述二价金属阳离子选自Mg2+、Cu2+和Mn2+。
72.权利要求69到71中任一项的组合物，其中所获得的除了锌离子和钙离子外的二 价金属阳离子的游离离子浓度高于0. 025mM，例如高于0. 03mM、例如高于0. 035mM、例如高 于0. 04mM、例如高于0. 045mM、例如高于0. 05mM、例如高于0. 055mM、例如高于0. 06mM、例如 高于0. ImM、例如高于0. 15mM、例如高于0. 2mM、例如高于0. 25mM、例如高于0. 3mM、例如高于 0. 5mM、例如高于1. OmM0
73.权利要求64到72中任一项的组合物，其中在另外的二价金属离子螯合剂存在的情 况下稳定所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
74.权利要求64到73中任一项的组合物，其中pH在4.5和6. 9之间于步骤(iii)中 纯化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
75.权利要求74的组合物，其中pH在4.7到6. 8之间、例如在4. 9和6. 7之间、例如在 5. 1和6. 6之间、例如在5. 3和6. 5之间、例如在5. 5和6. 4之间、例如在5. 7和6. 3之间、 例如在5. 8和6. 2之间、例如在5. 9和6. 1之间、例如6. O左右。
76.权利要求64到73中任一项的组合物，其中pH在8.6和10之间于步骤(iii)中纯 化所述含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
77.权利要求66的组合物，其中pH在8.7到9. 9之间、例如在8. 8和9. 8之间、例如 在8. 9和9. 7之间、例如在9. 0和9. 6之间、例如在9. 1和9. 5之间、例如在8. 7和9. 8之 间、例如在8. 7和9. 7之间、例如在8. 7和9. 6之间、例如在8. 8和9. 5之间、例如在8. 9禾口 9. 4之间、例如在9. 0和9. 2之间、例如9. 2左右。
78.权利要求74到77中任一项的组合物，其中在组氨酸存在的情况下稳定所述含有 GLA残基的丝氨酸蛋白酶。
79.权利要求64到78中一项的组合物，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是因 子IX多肽。
80.权利要求64到78中任一项的组合物，其中所述含有GLA-残基的丝氨酸蛋白酶是 因子VII多肽。
81.权利要求80的组合物，其中所述因子VII多肽是野生型人因子VII。
82.权利要求80的组合物，其中所述因子VII多肽具有高于野生型人FVIIa的蛋白酶 解活性。
83.权利要求80的组合物，其中所述因子VII多肽是选自下列的因子VII相关多肽 L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII, Vl58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/ K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/ M298Q-FVII,V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII， L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII， K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V58D-FVII， F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII， F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII， F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII， F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314 E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII， F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII， F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII， F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII， F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S31 4E-FVII,S52A-因子 VII、S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII、S344A-因子 VII、缺失 Gla 结构域的因子 VIIa ；和 P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/ V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ；和在从 233Thr 到 240Asn 的氨基酸序列上具 有添加、缺失或取代的FVII、在从304Arg到329Cys的氨基酸序列上具有添加、缺失或取代 的 FVII。
全文摘要
本发明涉及用于蛋白酶纯化的方法。特别是，本发明涉及生产含有GLA残基的丝氨酸蛋白酶的方法。
文档编号A61K38/00GK101818137SQ20091020839
公开日2010年9月1日 申请日期2004年3月18日 优先权日2003年3月18日
发明者E·佩森, J·克拉鲁普 申请人:诺和诺德医疗保健公司