凝血与淋巴细胞分离液(购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作)按1:1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min,收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min,收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n，按使用说明操作)80mL充分混匀，然后分装于10mL的细胞培养瓶中，置于5%C02，37°C恒温箱中或者转瓶机中培养，经过4天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
[0032]3.单层淋巴细胞进行传代培养:首先将长成单层淋巴细胞层用pH7.0的0.35%的胰酶37°C短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗2_3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% C02，37°C恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
[0033]4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n,按使用说明操作)的维持液，同时加入浓度为120mg/L的植物血凝素,牛痕弱毒株900血凝单位每毫升进行诱导培养。经过2天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
[0034]5.上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态:3S/3S，300-400W，10 min)破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
[0035]6.过滤除菌，分装，4°C保存。
[0036]实施例5
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以脾脏为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1.选择健康无传染病羔羊，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质。尽可能保证组织干净。
[0037]2.脾细胞制备:上次碎组织加入4倍量的pH为7.5、浓度为0.34%的胰酶，放入37°C的水浴锅中消化20min，每5min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰酶液，加入预热维持液PH为7.2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液。
[0038]3.淋巴细胞培养:采用血球计数板计数，取滤液10ul，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DEME液稀释后的滤液分装于细胞培养瓶中，培养条件:5%C02、37°C恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养。
[0039]4.传代培养成当单层淋巴细胞后,更换成含8%犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n,按使用说明操作)的维持液，同时加入浓度为160mg/L的植物血凝素,小反刍兽疫弱毒株950血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
[0040]5.上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态:3S/3S，300-400W，10 min)破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
[0041]6.过滤除菌，分装，4°C保存。
[0042]实施例6
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以脾脏为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下:
1.选择健康无传染病羔羊，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质。尽可能保证组织干净。
[0043]2.脾细胞制备:上次碎组织加入4倍量的pH为7.3、浓度为0.33%的胰酶，放入37°C的水浴锅中消化20min，每5min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰酶液，加入预热维持液PH为7.2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液。
[0044]3.淋巴细胞培养:采用血球计数板计数，取滤液10ul，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DEME液稀释后的滤液分装于细胞培养瓶中，培养条件:5%C02、37°C恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养。
[0045]4.传代培养成当单层淋巴细胞后,更换成含8%犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporat1n,按使用说明操作)的维持液，同时加入浓度为140mg/L的植物血凝素,牛痕弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
[0046]5.上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态:3S/3S，300-400W，10 min)破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
[0047]6.过滤除菌，分装，4°C保存。
[0048]实验例动物保护试验
取90只断奶羔羊健康羊，随机分成对照、试验、空白三组，每组30只，在新环境中适应三天，自由采食，攻毒剂量为2.0^lO8CFU/只，攻毒后第三天试验组开始接种实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子，每只肌注0.5ml/只，每天一次，对照组注射生理盐，空白全程生理盐水，观察临床症状和死亡率作为指标反应本品的临床应用效果。结果显示:对照组发病率100%和死亡率100%，空白组没有变化，试验组发病率35%，而死亡率3%。
[0049]动物安全试验
取健康小白鼠120只，随机分成空白、注射组、口服三组，每组30只，空白口服和注射蒸馏水1ml/只，注射组注射实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子1ml/只，口服组灌服本品10 ml/只，观察小白鼠的变化。结果显示三组都无异常变化。说明本品安全，无不良反应。
[0050]皮肤刺激性试验
取30只小白兔，分成对照、皮下注射、皮内注射3组，采用脱毛剂对家兔脊柱两侧被毛脱去，保证皮肤的完整性，然后注射实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子I ml/只，对照组注射生理盐水，分成单次给药、多次给药观察皮肤的变化。结果显示，注射生理盐水的10只中，有6只发生红肿，一天消肿，试验组中各有2只发生，10小时内全部消肿。
[0051]通过以上实验例总结，我们可以得到本发明所提取的抗小反刍兽疫病毒转移因子不仅能安全高效的抑制小反刍兽疫，还能够保护正常机体细胞免受小反刍兽疫的感染，提高机体的免疫力。本品的体外制备方法是可行的，产品可以起到预防本病的作用，同时也可以预防牛瘟疾病的发生，在临床上应广泛推广。
【主权项】
1.一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于:以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下: 1)首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞； 2)淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用； 3)经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
2.根据权利要求1所述的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于:步骤I)中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
3.根据权利要求1所述的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于:步骤3)中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100-200mg/L。
【专利摘要】本发明涉及一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，利用体外淋巴细胞培养方式，经过小反刍兽疫的诱导制备抗小反刍兽疫病毒转移因子。本发明是以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素（PHA）和小反刍兽疫诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小反刍兽疫特异转移因子。这种发明方法不仅操作简便，减小工作强度，而且生产的天然纯生物活性物质可预防本疾病的发生，提高机体的免疫力。
【IPC分类】A61K35-14, A61P31-14, A61K35-26
【公开号】CN104523751
【申请号】CN201410744677
【发明人】徐进, 郭俊清
【申请人】郑州后羿制药有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月9日