一种非对称转座子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种非对称转座子及其对蛋白质基因进行随机位点的多密码子缺失 突变的应用。
【背景技术】
[0002] 现有的Mu转座子（Mutransposon)体外突变技术W包括可实现Ξ联核巧酸缺失 的MuDel转座子突变?、可实现Ξ联核巧酸替换的MuDel转座子突变?、可实现单一密码子 替换的转座子突变W、可实现多个密码子替换的转座子突变及通过组合Mu转座子突 变和多步酶切实现的多核巧酸替换技术W。本发明是Mu转座子（Mutransposon)体外突 变技术的一个分支技术，可实现对目的蛋白的编码基因进行随机位点的多个密码子缺失突 变。 阳00引参考文献：
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【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种非对称转座子及其应用，通过该非对称转座子，能实现 对蛋白质编码基因实现随机位点的多密码子缺失突变。
[0011] 为了达到上述目的，本发明提供了一种非对称转座子，其特征在于，其序列（命名 为MuCDM)为沈Q ID NO. 1。
[0012] 本发明还提供了上述的非对称转座子的应用方法，其特征在于，包括：
[0013] 步骤1.将目的基因克隆至转座子目标质粒得到含有目的基因的质粒；
[0014] 步骤2.将转座子、含有目的基因的质粒与转座酶在缓冲液中混合进行转座子反 应；将转座反应产物转化进大肠杆菌感受态细胞，用氨节青霉素/卡那霉素双抗性对读码 框内的转座子插入进行筛选；收集获得菌落，提取质粒DNA，此为转座子随机插入文库；
[0015] 步骤3.W转座子随机插入文库DNA为模板，根据要缺失密码子数目用相应引物进 行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化；
[0016] 步骤4.将纯化的PCR产物依次进行BsgI酶切和平末端处理，然后进行连接反应， 得到缺失突变文库。
[0017] 优选地，所述的含有目的基因的质粒的序列为（命名为ρΤΤ)为SEQIDNO. 2。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0019] a)本发明的转座子DNA，末端含有非对称核巧酸；
[0020] b)本发明可实现对蛋白质编码基因随机位点氨基酸的缺失；
[0021] C)本发明可实现对突变氨基酸读码框的控制，保证是读码框内密码子缺失。
[0022] d)本发明可实现1至5个氨基酸缺失。
[0023] 参考文献1、3、4、6中描述技术不具备a，b，Cd效果，参考文献2中描述技术不具 备曰，Cd效果，参考文献5中描述技术不具备曰，b，d效果。
【附图说明】
[0024] 图1为非对称转座子序列、转座子目标质粒序列W及读码框筛选的示意图。（A)转 座子比较。本发明的转座子的DNA与参考文献W中的Mini-Mu转座子和参考文献?中的 MuCSM转座子均不相同。其中双下划线部分为末端非对称核巧酸；单下划线部分为转座酶 识别位点；VMAI-C标记部分为读码框控制元件的C端区域；bla标记部分为β内酷胺酶基 因（氨节青霉素抗性）。度）目的基因所在的ρΤΤ质粒。其中tat标记部分为β内酷胺酶 发挥活性所需信号肤；VMAI-N标记部分为读码框控制元件的Ν端区域；G0I标记部分为目 的基因的克隆位点。（C)读码框控制原理。其中"non-化nctionalsequence"标记部分为 转座子读码框外插入所产生的非功能性DNA片段。
[0025] 图2为应用非对称转座子进行随机密码子缺失突变的流程图。
[0026] 图3为反向PCR(inversePCR)中所使用引物序列。通过组合不同的正向（名称中 含有FWD字样）及反向（名称中含有REV字样）的引物W实现对目的蛋白基因的1至5个 密码子缺失突变。小写表示为BsgI限制性内切酶的识别位点，斜体加黑为非对称核巧酸。 引物名称中的数字代表BsgI酶切后从目的基因移除的核巧酸数目。转座子插入目的基因 时会使插入位点附近5个核巧酸进行复制。例如，要产生2密码子缺失，需要组合使用引物 FWD8N及REV3N(移除8+3 = 11个核巧酸，其中包括因转座子插入引起的5核巧酸复制化及 目的基因中的6个核巧酸，即2个密码子）。
[0027] 图4为W1密码子缺失突变为例，详细的BsgI和Klenow酶切过程说明图。W移 除1个密码子（3个核巧酸）为例，如图所示，目的基因中的核巧酸6、7、8已经被移除。
[0028] 图5.为GFPw实施例的结果汇总。通过非对称转座子突变构建GFPW缺失突变文 库。总体正确率为92. 3 %，其中10. 6 %出现在读码框控制元件VMAI-N中，81. 7 %出现在目 的基因GFP。v中。错误率为7.7%，主要包括PCR、BsgI酶切等过程中引入的随机核巧酸增 减。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0030] 实施例