施例1制备的慢病毒颗粒，M0I= 1，7化后检测慢病毒颗粒的转染效 率，然后分别适用qPCR及Western-blot分析PDK2的表达。其中转染效率结果如图2和图 3所示，结果显示慢病毒颗粒均能成功转染RAW264. 7细胞。
[0038] 一、Western-blot分析PDK2 的表达
[0039] 1)小鼠巨隧细胞RAW264. 7细胞蛋白质的提取：
[0040] (1)去除培养基，W 1ml PBS洗两次； 阳0川 似加入由900μ1RIPA和100μ1蛋白酶抑制剂组成的蛋白裂解液；
[0042] (3)每孔加入100μ1蛋白裂解液，用移液器吹打几下，使裂解液和细胞充分接触； 阳0创 （4)轻轻摇匀5-lOmin后置于冰上静置裂解比；
[0044] 巧）1400巧m、4°C离屯、15min，上清为蛋白质样品。 W45]。蛋白定量：
[0046] (1) W0. 8ml蛋白标准品稀释液稀释蛋白标准品（20mg BSA)，使之终浓度为25mg/ ml；
[0047] 似取10μ1的25mg/ml蛋白标准品用490μ1PBS稀释至终浓度为0. 5mg/ml; W4引 做配置BCA工作液：取5mlBCA试剂A加100μ1BCA试剂B巧0:1)，充分混匀；
[0049] (4)将0.5mg/ml的标准品按0μl，lμl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl依 次加入到96孔板的标准品孔中，用PBS补足体积至20μ1;
[0050] 妨将4μ1样品到96孔板的样品孔中，用PBS补足体积至20μ1 ;
[0051] (6)每孔加入200μ1BCA工作液，37 °C放置20-30分钟；
[0052] (7)用酶标仪在A562波长测定0D值，利用标准曲线求出样品的蛋白浓度。
[0053] 结果显示，蛋白质浓度为50mg/ml。可应用于western-blot的研究。
[0054] 3)SDS-PAGE电泳 阳05引 （1)取100μ1蛋白质样品加入25μ1的5XSDS上样缓冲液混匀，煮沸6min，冷却 至室溫；
[0056] 似加样：按15 μ g的蛋白上样，同时加6 μ 1的预染蛋白Marker ;
[0057] (3)在电泳槽中加入200ml的电泳缓冲液，100V电压电泳，待漠酪蓝到达底部时结 束；
[0058] (4)转膜（本实验用半干转法）：电泳结束后，将胶切角标记，浸泡在转膜缓冲液 中，在室溫平衡15min;W100 %甲醇活化PVDF膜30s，转入纯水中浸润3min，最后置于转膜 缓冲液中平衡15min;组装转膜Ξ明治：从下到上依次放入2层滤纸、膜、凝胶、2层滤纸（膜 的面积要小于滤纸，大于胶）；按膜面积的80%设置电流，恒流转移蛋白60min;
[0059] (5)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，TBS洗2次，每次5min，加入5 %脱脂奶粉，室 溫平缓摇动化（背景高则4°C封闭过夜）；
[0060](6)抗体的解育：封闭结束后，WTBST清洗PVDF膜（慢速），每次lOmin，共3次； 然后加入一抗工作液：用5%封闭奶粉适当稀释一抗？01(2，1:500稀释，4°(：过夜，第二天^ TBST清洗PVDF膜，每次lOmin，共3次；加入二抗工作液：用TBST1:10000或1:20000稀释 二抗（大鼠抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记），解育比后，WTBST清洗PVDF膜（快速）， 每次lOmin，共3次；
[0061] (7)加入E化显色试剂，在凝胶成像仪上进行显色。结果如图4所示，结果显示 PDK2蛋白的分子量为分子量为50Kd，特异性好，并且转染慢病毒颗粒的RAW264. 7细胞 PDK2蛋白表达量显著低于未转染慢病毒颗粒的细胞，表明本发明合成的PDK2RNAi-l和 PDK2RNAi-2能够抑制PDK2的表达，并且PDK2RNAi-2的抑制效率高于PDK2RNAi-l。
[0062] 二、qPCR法检测RNAi对PDK2基因的抑制效果 W63] 1)总RNA抽提
[0064] (1)细胞培养皿中细胞样品用1冲BS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase化ee EP管中使细胞充分裂解， 室溫静置5min ; W65] 似加入200μ1氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室溫静置 3-5min；
[0066] (3) 4°C下，14,OOOg离屯、15min，可见分为Ξ层，RNA在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP管；
[0067] (4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），室溫静置 lOmin；
[0068] 巧)4°C下，14,OOOg离屯、lOmin，收集RNA沉淀，去上清；
[0069](6)用75 %乙醇洗涂两次（12,OOOg离屯、5min)，超净台风干；沉淀不能过干或过 湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
[0070] (7)视沉淀量加入适量DEPC水（至少15μ1)溶解沉淀。
[0071] 将提取的总RNA取1μ1RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定0D值，结 果显示0D260/0D280的比值大于1. 8,说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染；再取RNA样品 1μ1，1%琼脂糖凝胶电泳80VX20min，邸染色lOmin，用凝胶成像系统观察并拍照，结果显 示，提取的总RNA5SrRNA，18srRNA和28srRNA条带Ξ条条带完整，可W用于检测。 阳0巧 如逆转录 阳〇7引 （1)在RNase化ee的PCR管中配置下列溶液；
[0074]似将上述溶液吹打均匀，置85°C保溫5min，使RNA变性，随后立即冰上制冷，W防 止RNA复性； 阳〇7引 做在该PCR管中加入下列试剂（Promega)
[0076]
W77] (4)将上述20μ1反应溶液30°C保溫lOmin;然后42°C保溫50min;再85°C保溫 lOmin;最后-20°C保存。 阳〇7引 4)定量PCR检测
[0079] 然后W逆转录获得的cDNA为模板，W小鼠PDK2分子特异性引物P1 :5'-acagggag tgctggagtacaagg-3'(沈QIDNO. 7)及P2:5'-tg阱gatgcggctgaggtagaa-3'(沈QIDNO. 8) 为引物进行巧光定量PCR,同时WActin-β基因作为内参，内参引物为Pl:5'-tgctgtccct gtatgcctct-3'（沈QIDNO. 9) ;P2:5'-ttgatgtcacgcacgaattc-3'（沈QIDNO. 10)，并根据 使用所获得的CT值，采用2 进行相对量计算，结果如图5所示。结果显示，转染慢病毒 颗粒的RAW264. 7细胞PDK2基因表达量显著低于未转染慢病毒颗粒的细胞，表明本发明合 成的表明本发明合成的PDK2RNAi-l和PDK2RNAi-2能够抑制PDK2的表达，并且PDK2RNAi-2 的抑制效率高于PDK2RNAi-l。
[0080] 实施例3、沉默RAW264. 7细胞PDK2表达后对细胞功能影响的分析及验证
[0081] 经PDK2RNAi-2处理稳定抑制PDK2表达的小鼠巨隧细胞系RAW264. 7细胞（在此 称为RAW264. 7-PDK2RNAi-2)及其对照细胞（在此称为RAW264. 7-RNAi-control)培养于6 孔板内，待细胞70 %长满孔底：
[0082] 一、LI^刺激
[0083] 使用浓度为2μg/ml的脂多糖LPS(Sigma公司产品，货号：L2630)分别刺激细胞， 于0、15及60分钟后收集细胞进行活性氧的流式细胞术（FACs)分析。
[0084] 二、流式细胞术（FACs)分析
[0085] 取培养的小鼠巨隧细胞系RAW264. 7细胞，采用流式细胞术（FACs)分析，结果如图 6所示。结果显示，抑制PDK2表达可促进RAW264.7细胞线粒体活性氧（mtRO巧的分泌，表 明抑制PDK2表达可W表达PDK2基因的细胞，如巨隧细胞，提高免疫力，对于肿瘤治疗具有 重要意义。
[0086] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种有效抑制小鼠roK2表达的RNA干扰序列，其特征在于：所述RNA干扰序列如SEQ IDNO. 3的第5~52位所示或如SEQIDNO. 5的第5~52位所示。2. 含有权利要求1所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体。3. 根据权利要求2所述的慢病毒表达载体，其特征在于：所述慢病毒载体由SEQID NO. 3 与SEQIDNO. 4,或SEQIDNO. 5 与SEQIDNO. 6 退火形成双链，然后经EcoRI和PacI 酶切位点连入GV115慢病毒表达质粒而得。4. 权利要求1所述RNA干扰序列的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQID NO. 3 与SEQIDNO. 4,或SEQIDNO. 5 与SEQIDNO. 6 退火形成双链，然后经EcoRI和PacI 酶切位点连入GV115慢病毒表达质粒，包装，转染，获得慢病毒颗粒，然后将慢病毒颗粒转 染至宿主细胞中表达获得RNA干扰序列。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为巨噬细胞。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为小鼠巨噬细胞 RAW264. 7〇7. 权利要求1所述RNA干扰序列或权利要求2或3所述慢病毒载体在抑制小鼠TOK2 表达中的应用。8. 权利要求1所述RNA干扰序列或权利要求2或3所述慢病毒载体在促进表达TOK2 细胞的线粒体活性氧分泌中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述表达TOK2细胞为巨噬细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序列及其应用，RNA干扰序列如SEQ？ID？NO.3的第5～52位所示或如SEQ？ID？NO.5的第5～52位所示，该序列能够显著抑制小鼠PDK2表达，抑制表达后能够促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌，活化细胞，为肿瘤、I型糖尿病及肝炎等疾病的治疗提供了新的思路。
【IPC分类】C12N15/113, A61P3/10, C12N15/867, A61P35/00, A61P1/16
【公开号】CN105368839
【申请号】CN201510975321
【发明人】陈永文, 吴玉章, 杨承英
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月22日