用于控制蜂中的瓦螨的组合物的制作方法
【专利说明】用于控制蜂中的瓦聯的组合物 阳OOU 本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年10月14日，申请号为 201080056585. 9 (PCiyiL2010/000844)，发明名称为"用于控制蜂中的瓦蛾的组合物"。
[0002] 发巧领域巧背景 本发明设及用于控制蜂中的瓦蛾mite)侵染的组合物。
[0003] 蜜蜂，即意大利蜜蜂（Apismellifera)为农作物的有效授粉所必需，因此对世界 农业而言为关键性的。蜜蜂亦产生经济上重要的产物，包括蜂蜜和蜂蜡。蜜蜂易感染许多 寄生虫和病原体，包括外寄生蛾、狄斯瓦蛾（Varroadestructor)。
[0004] 蜜蜂的蜂群崩溃失调病（ColonyCollapseDisorder,CCD)对摧毁美国和世界农 业造成威胁。实际上，2006-2007年冬天在美国最近爆发的CCD中，估计240万蜜蜂蜂巢的 25%或更多因为CCD而消失。估计23%的美国养蜂运作在2006-2007年冬天受CCD所累，影 响了平均45%的养蜂人运作。在2007-2008年冬天，USDA-ARS的CCD行动小组估计，总计 来自商业运作的全部蜂巢的36%被CCD破坏。 阳0化]CCD通过自一群其成年蜂群体的迅速消失来表征，通常在距蜂群一定距离处发现 死亡的成年蜂。在崩溃末期，蜂王仅由少量新形成的成年蜂照料。崩溃的蜂群常常具有大 量封盖的幼蜂和食物储备。CCD现象首先在2006年报道；然而，养蜂人早在2004年就注意 到与CCD-致的独特的蜂群衰退。已假定多种因素作为原因，所述因素为例如蛾和传染剂、 天气模式、电磁（蜂窝天线）福射、杀虫剂、营养不良和应激。迄今为止，CCD的控制已集中 在瓦蛾控制、环境卫生和移除受影响的蜂巢，针对机会性感染（例如小抱子虫OVose皿)）进 行处理和改善营养。至今仍未开发有效的预防措施。
[0006] 瓦蛾寄生于蛹和成年蜂中并且在蛹的抚幼室中繁殖。蛾使用它们的嘴刺穿外 骨骼并且W蜂的血淋己为食。运些外骨骼中的伤口部位隐匿细菌感染，例如蜂房球菌 (Melissococ州Spluton)，其导致欧洲幼虫腐臭病巧uropeanfou化rood)。此外，因为它们 的寄生作用，怀疑瓦蛾充当许多蜜蜂病原体的载体，所述病原体包括羽翼崎形病毒（DWV)、 克什米尔蜜蜂病毒（邸V)、蜜蜂急性麻搏病毒（ABPV)和黑蜂王台病毒度QCV)，并且瓦蛾可 减弱其宿主的免疫系统，使得它们易受感染的攻击。如果不加W治疗，瓦蛾侵染典型地导致 群体水平的死亡率。
[0007] 治疗瓦蛾侵染的现行方法被证明无效，因为蛾形成对现有杀蛾剂的抗性。此外，使 用运类杀蛾剂可能将有害的化学品引入旨在用于人消费的蜂蜜中。 阳00引美国专利申请20090118214教导了dsRNA用于预防和治疗蜜蜂中的病毒感染中的 用途。
[0009] 发巧概沐 本发明某些实施方案的一个方面提供了一种分离的核酸剂，所述核酸剂包含减量调节 狄斯瓦蛾基因产物的表达的核酸序列。
[0010] 本发明某些实施方案的一个方面提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编 码本发明的分离的核酸剂的核酸序列。
[0011] 本发明某些实施方案的一个方面提供了一种蜂可摄取的组合物，所述组合物包含 至少一种核酸剂，所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦蛾基因产物的表达的核酸序列。
[0012] 本发明某些实施方案的一个方面提供了预防或治疗蜂巢的狄斯瓦蛾侵染的方法， 所述方法包括给蜂施用有效量的至少一种包含减量调节狄斯瓦蛾基因产物的表达的核酸 序列的核酸剂，从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦蛾侵染。
[0013]本发明某些实施方案的一个方面提供了预防或治疗蜂巢的狄斯瓦蛾侵染的方法， 所述方法包括给蜂施用有效量的本发明的核酸构建体，从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦蛾侵 染。
[0014] 本发明某些实施方案的一个方面提供了降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病（CCD)的易 感性的方法，所述方法包括给蜜蜂施用有效量的至少一种双链核糖核酸（dsRNA)，所述至少 一种dsRNA包含与狄斯瓦蛾mRNA的至少21个核巧酸互补且能够诱导狄斯瓦蛾特异性mRNA 降解的序列。
[0015] 根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列与狄斯瓦蛾特异性RNA的至少21个核 巧酸互补且能够诱导狄斯瓦蛾RNA降解。
[0016] 根据本发明的某些实施方案，所述核酸剂选自dsRNA、反义RNA和核酶。
[0017] 根据本发明的某些实施方案，dsRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。
[0018] 根据本发明的某些实施方案，所述基因产物为编码选自W下的多肤的mRNA:ATP 酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、调亡抑制剂（IAP)、FAS调亡抑制剂和α-微管蛋 白。
[0019]根据本发明的某些实施方案，所述至少一种核酸剂包含至少五种核酸剂，用于减 量调节ΑΤΡ酶亚基A、RNA聚合酶III、调亡抑制剂（ΙΑΡ)、FAS调亡抑制剂和α-微管蛋白， 所述至少五种核酸剂的每一种都祀定不同的基因。
[0020] 根据本发明的某些实施方案，所述至少一种核酸剂包含至少六种核酸剂，用于减 量调节ΑΤΡ酶亚基Α、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、调亡抑制剂（ΙΑΡ)、FAS调亡抑制剂和 α-微管蛋白，所述至少六种核酸剂的每一种都用于祀定不同的基因。
[0021] 根据本发明的某些实施方案，所述核酸剂如SEQIDNo: 1、13、27、30和39所述。
[0022] 根据本发明的某些实施方案，所述核酸剂如SEQIDNo: 1、4、7、10、13、16、19、22、 25、27、30、33、36和39所述。
[0023]根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列长度大于15个碱基对。
[0024] 根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列长度为19-25个碱基对。
[00巧]根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列长度大于30个碱基对。
[00%] 根据本发明的某些实施方案，所述组合物呈固体形式。
[0027] 根据本发明的某些实施方案，所述组合物呈液体形式。
[0028] 根据本发明的某些实施方案，所述组合物包含蛋白质。
[0029]根据本发明的某些实施方案，所述蛋白质呈花粉和/或大豆饼的形式。
[0030]根据本发明的某些实施方案，所述液体为薦糖溶液。
[0031]根据本发明的某些实施方案，所述液体为玉米糖浆溶液。
[0032] 根据本发明的某些实施方案，所述液体进一步包含碳水化合物或糖补充剂。
[0033] 根据本发明的某些实施方案，所述蜂为蜜蜂。
[0034]根据本发明的某些实施方案，所述蜜蜂为采集蜂。
[0035] 根据本发明的某些实施方案，所述蜜蜂为蜂巢蜂化ivebee)。
[0036] 根据本发明的某些实施方案，所述蜜蜂为蜂群的蜂，且其中所述施用降低蜂群体 对蜂群崩溃失调病的易感性。
[0037] 根据本发明的某些实施方案，所述施用通过饲喂来实现。
[0038] 根据本发明的某些实施方案，所述饲喂包括提供液体的蜂可摄取的组合物。
[0039] 根据本发明的某些实施方案，所述饲喂包括提供固体的蜂可摄取的组合物。 W40] 根据本发明的某些实施方案，狄斯瓦蛾mRNA编码选自W下的多肤：NADH脱氨酶亚 基2、ATP合成酶亚基8、ATP合成酶亚基6、钢通道和细胞色素氧化酶亚基I。
[0041] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的相同的意义。虽然与本文所述方法和材料类似或等同的方法 和材料可用于实践或测试本发明的实施方案，但示例性的方法和/或材料描述于下文。在 冲突的情况下，队本专利说明书（包括定义）为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说 明性的而不意图其为必要限制。
[0042] 附图简沐 仅作为实例参考附图在此描述本发明的某些实施方案。现在详细地具体参考附图，强 调的是，所示细节是作为实例并且W阐述性地讨论本发明的实施方案为目的。在运点上，带 有附图的描述使得本发明的实施方案可如何实施对本领域技术人员显而易见。 柳43] 在附图中： 图1为用于dsRNA转入瓦蛾的各种实验的时程的示意图。
[0044] 图2A-E为狭线印迹分析（Slotblotanalysis)已摄取的蜂（图2A)、通过成年蜂 喂养的幼虫（图2B)、蛹（图2C)和新形成蜂（图2D)中dsRNA-GFP存在情况的结果的照 片。dsRNA-GFP和来源于其的siRNA的存在情况通过RNA印迹来分析（图沈）。D=给蜂巢 施用dsRNA-GFP之后的天数。 W45] 图3为举例说明在顶行所示的天数（时间如图1所示）从瓦蛾提取的RNA的 RT-PCR分析结果的照片。绿色数字（顶行）表示已将其放置在已摄取dsRNA-GFP的蜂上的 瓦蛾个体，而黑色数字表示来自放置在对照蜂上的瓦蛾的RNA。+ =阳性对照（携带GFP的 质粒）。
[0046] 图4为举例说明使用针对调亡抑制剂蛋白（IAP;序列27)的引物的瓦蛾RNA的 RT-PCR的照片。Μ:大小标记。泳道1-3 :来自用序列27的dsRNA处理的蜂巢的瓦蛾的模板 RNA。泳道4:来自对照蜂巢的瓦蛾的模板RNA。泳道5:阳性对照（携带IAP的质粒）。泳 道6:阴性对照（无模板）。
[0047] 图5为举例说明在对照蜂巢中W及在用dsRNA混合物I(最小）和用dsRNA混合 物II(最大）处理的蜂巢中每只蜂（成年蜂加上封盖房内的幼虫）的瓦蛾计数的条形图。
[0048] 发巧连施方案描沐 本发明在其某些实施方案中，设及用于降低蜂对于瓦蛾侵染的易感性的方法和组合 物。
[0049] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明不必限于其在 W下描述中所述或通过实施例所例示的细节中的应用。本发明能够有其它实施方案或者W 多种方式实践或实施。
[0050] 蜂易感大量的病毒感染。通过减量调节特定的病毒基因产物来治疗运类感染已显 示在消除蜂中病毒诱导的感染方面成功（参见美国专利申请20090118214)。
[0051] 本发明人现提出通过减量调节特定的瓦蛾基因产物来治疗蜂中瓦蛾侵染。
[0052] 瓦蛾寄生于蛹和成年蜂中并在蛹的抚幼室中繁殖。蛾使用它们的嘴刺穿外骨骼并 且W蜂的血淋己为食。本发明人意外地发现，施用给蜂W治疗瓦蛾侵染的多核巧酸剂出现 在蜂的血淋己中，从而变为蛾可获取的。
[0053]本发明人已显示，可成功地将dsRNA转移至瓦蛾（图2A-E)，所述dsRNA可用来减 量调节瓦蛾中特定基因的表达（图4)和进一步地，针对减量调节祀定特定基因可引起瓦蛾 数量上的减少（图5)。
[0054] 因此，本发明的一个方面提供了预防或治疗蜂的狄斯瓦蛾侵染的方法，所述方法 包括给蜂施用有效量的包含减量调节狄斯瓦蛾基因产物的表达的核酸序列的核酸剂，从而 预防或治疗蜂的狄斯瓦蛾侵染。 阳化5] 本文所用的术语"蜂"是指成年蜂及其蛹单元二者。根据一个实施方案，所述蜂在 蜂桌中。
[0056] 成年蜂定义为膜翅目中蜜蜂总科的数种有翅、躯体多毛通常有刺的昆虫中的任一 种（包括独居种和群居种二者），W及通过用于收集花蜜和花粉的吸晚和巧嚼口器来表征。 示例性蜂种包括但不限于：蜜蜂属（Apis)、熊蜂属度ombus)、无刺蜂属（Trigona)、壁蜂属 (Osmia)等。在一个实施方案中