i-Ti质粒为pB7WG2. 0-P35S: :bar-Tnos-Pubi::mZmDEP(反 义）-Tnos)的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中28°C下震荡培养，震荡速 率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌 体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100μπι〇1/1乙酰丁香酮的1/2MS 液体培养基悬浮，稀释至0D_0. 2~0. 4用于转化。
[0064] 4)玉米无菌苗转化
[0065] 将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使无菌苗裸露茎尖生长锥浸 泡在菌液中，在0. 5X105Pa大气压下感染8~12分钟。浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌 发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22~24°C。然后将无菌苗 放在散射光下培养2天。将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中， 并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22~28°C，夜温15~21°C， 隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
[0066] 5)转化植株筛选与定植
[0067] 转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale"(HoechstScheringAgrEvoGmbH，含 有除草剂草铵膦glufosinateammonium)水溶液，浓度为9. 6ml~10. 8mlFinakVVL,以植 株掉液滴为宜。未转化受体自交系植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植 株在喷洒后，一些个体变化与受体自交系植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待 存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。
[0068] 6)转基因植株后代分析
[0069] T1代植株长到3叶期用10. 8mlFinaV/L.水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个 体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株 移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，继续采用PCR技术检测外源基因，阳 性株系进行Southernblotting验证，并采用RT-PCR技术检查玉米GRMZM2G001660基因、 GRMZM2G172320基因和GRMZM2G028726基因的表达强度的变化，选择生长发育正常且靶基 因表达水平下降的株系进行抗逆性测定和产量测定。
[0070] 7)转基因植株后代的耐盐性检测
[0071] 由于玉米对盐胁迫的敏感期是种子萌发期和小苗期，5叶期以后植株耐盐性相对 较强。玉米耐盐性测定重点是在苗期和萌发期。
[0072] 对T2代植株进行耐盐性测定和农艺性状选择。首先取T2代种子，每果穗60粒 (分3次重复，每次20粒），分别用70%乙醇灭菌5分钟、0. 1 %氯化汞溶液灭菌6分钟，再 用无菌水洗涤3~4遍，以3厘米间隔放在0. 8%NaCl水溶液浸泡的滤纸板上，后者置于 带盖的搪瓷盘中，然后用〇. 8%NaCl盐水浸泡的纱布（4层）覆盖，以受体自交系种子为对 照。盖好搪瓷盘后，放入25°C下萌发。3天后逐天观测种子萌发状况，一般持续一周。统计 萌发率、胚芽鞘和种根长度，根据萌发率和发芽势来判断株系耐盐性，选出耐盐性显著优于 受体自交系的株系。入选株系应萌发率高于受体自交系，胚芽鞘生长较快，根系发育较好。
[0073] 将入选株系种子分别播在直径12厘米的砂盆中，每盆8粒种子，三次重复。同一 重复的花盆随机排列，规则摆放。用于盐选的花盆大小一致、统一规格的排水孔，装填的沙 子质地均匀，无泥土，浇水后渗漏速率基本一致。播种后浇灌〇. 7%或0. 8%NaCl水溶液， 以受体自交系种子为对照。不同株系在盐水浇灌下表现出不同的萌发率和长势及存活率， 其中一些株系表现出比受体自交系明显提高的耐盐性。在T2代株系中，耐盐株系的5叶期 植株成活率一般在75 %以上，而受体自交系出苗率只有30 %~50 %，并且植株出苗后下部 叶片很快变枯，3叶期前后死亡，5叶期成活率不到1/8。将耐盐性优异的植株移栽到大田 套袋自交，收获种子。然后种子播种在土壤含盐量为〇. 3 %~0. 5 %的土地中，统计出苗率 (出苗数/播种种子数X100% )、成苗率（7叶期植株数/出苗数X100% )、生育期和株 高、单株产量及果穗性状（穗长、穗行数、行粒数、穗粒重）、小区产量，进行耐盐性筛选和利 用价值的评估，将这些指标显著优于同条件下受体自交系的株系确定为耐盐性好且有利用 价值的育种材料。
[0074] 8)转基因植株的抗旱性测定
[0075] 对于入选的耐盐性有明显提高的转基因株系，以受体自交系为对照，测定植株在 正常栽培条件下和干旱胁迫条件下的叶片净光合速率、3-7叶期小苗生长速率和生物量、单 株产量、小区产量等。选出优良的转基因抗旱株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状 的观测和比较，选择抗旱高产株系进入玉米育种实验。具体程序参见实例1。
[0076] 8)转基因植株的应用
[0077] 对入选的耐盐抗旱转基因株系进行配合力测定，以非耐盐自交系为另一亲本配制 杂交组合，F1种子播种到土壤含盐量为0. 3%~0. 5%的土地和非盐碱地中，记载植株生长 发育期和主要农艺性状，测定单株和小区产量，小区面积〇. 01亩，设4次重复，种植密度为 4500~5000株/亩。通过耐盐抗旱性、抗病性、抗倒性、产量指标等综合性状的观察和产量 测定，选出玉米耐盐抗旱高产杂交种。
[0078] 实施例3 :转入ZmDEPRNAi结构创造玉米耐盐抗旱自交系
[0079] 1)ZmDEPRNAi结构的构建
[0080] 采用PCR方法扩增出mZmDEP序列中从开放读码框的150位核苷酸到628bp核苷 酸的片段，通过2次重组将该片段插入到质粒pFGC5941为基础的经过改造的植物表达载 体pFGC5941-mbar-P35S: :MCS-CHASintron-MCS-0CSPolyA(该质粒T-DNA区插入融合基因 PCaMV: :mbar-TgluB5,其中MCS为多克隆位点或限制酶切位点、P35S为花椰菜花叶病毒35S RNA启动子、mbar用玉米偏倚的密码子代换的草丁膦抗性基因bar、TgluB5为水稻GluB5蛋 白基因终止区）的多克隆位点处，产生ZmDEPRNAi结构。RNAi结构的两臂为互补的长度相 等的ZmDEP基因片段（478bp)。
[0081] 2)玉米遗传转化和转基因植株及其后代的选择及利用
[0082] 实施方法参见实施例1和2。
【主权项】
1. 一种玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米mZmDEP基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述玉米mZmDEP基因的表达抑 制结构是指SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的反义表达结构和SEQ ID No. 1所示核苷酸序列 的RNAi结构，其中所述RNAi结构是由SEQ ID No. 1的前628个核苷酸区域中的片段构建 而成；所述玉米抗逆是指玉米的耐旱性和耐盐性。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构 在玉米抗逆育种中应用的方法是：在植物表达载体中分别插入mZmDEP基因过表达结构、 mZmDEP基因反义表达结构、ZmDEP RNAi结构，利用转基因技术将它们分别导入玉米细胞并 再生植株，从其后代筛选出抗逆高产转基因玉米株系，创制出具有耐旱性和耐盐性的玉米 新品种。
【专利摘要】本发明公开一种玉米mZmDEP基因和其表达抑制结构在玉米抗逆育种中的应用，其中所述玉米mZmDEP基因的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示；所述玉米mZmDEP基因的表达抑制结构是指SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的反义表达结构和SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的RNAi结构，其中所述RNAi结构是由SEQ？ID？No.1的前628个核苷酸区域中的片段构建而成；所述玉米抗逆是指玉米的耐旱性和耐盐性。实验证实，利用本发明获得的转基因株系表现出显著提高了抗旱性和耐盐性，提高了玉米植株对环境的适应性和在常规栽培条件下的玉米产量，在玉米育种中有很好的应用价值。
【IPC分类】C12N15/82, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105349551
【申请号】CN201510916723
【发明人】张举仁, 李朝霞, 解光宁
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月10日