构基因。
[0067] 利用primer5、primer6以灵芝的mRNA为模板进行RT-PCR，扩增到其对应的全 长cDNA(命名为GILac)，漆酶全长cDNA电泳图显示大约有1. 5kb左右大小的片段（如图1 所示）。将该片段回收并克隆到PMD18-T上，送上海博亚公司测序，测序结果得到漆酶全长 cDNA序列为 1566kb，如SeqID.No. 1 所示。
[0068] 2)毕赤酵母表达载体的构建与转化
[0069] 2. 1)表达载体的构建和鉴定：表达载体利用EcoRI和Xbal双酶切，割胶回收纯 化，具体为：将含有pMD18-T-GlLac的正确的转化子于含有氨苄青霉素的LB液体培养基 37°C，200rpm，振荡培养过夜，提取质粒DNA，并用EcoRI和Xbal双酶切，回收约1. 5kb的目 的片段。将Lac片段与载体pPICZαA片段用T4DNA连接酶（购自宝生物工程（大连）有限 公司）16°C过夜连接，转化大肠杆菌（E.coli)DH5a感受态细胞中，挑选阳性克隆进行质粒 的提取，将质粒用EcoRI和Xbal双酶切，得到大约1. 5kb和3. 5kb两条带，分别选取多个阳 性克隆进行DNA序列测定。序列正确的阳性共表达质粒命名为pPICZaA-GILac(如图2)， 并用于下一步试验。
[0070] 2. 2)毕赤酵母X33感受态细胞的制备：参照InvitrogenEasySelecteTMPichia ExpressionKit的使用指南制备酵母X33(购自Invitrogen公司）的感受态细胞。
[0071] 2. 3)酵母的转化：提取重组子质粒pPICZaA-GILac，将鉴定正确的 pPICZaA-GILac质粒以SacI线性化后割胶回收，具体为：取5~10μg线性化后的质粒电 转化毕赤酵母x33，经0.lOmg/mL平板初步筛选后，分别用96孔板连续转接培养至浓度趋于 一致，然后接种至分别含有0. 5mg/mL、1. 0mg/mL、2.Omg/mL博莱霉素（Zeocin)的YPD(Yeast PeptoneDextroseAgar)平板筛选高拷贝转化子；在Zeocin终浓度为1.Omg/mL的YPD平 板上筛选到10个转化子，在2.Omg/mLZeocin的抗性平板上未见转化子生长。
[0072] 2. 4)酵母转化菌的PCR鉴定，具体步骤包括：
[0073] ①酵母基因组的制备：挑斑接种3mLMD液体培养基中，培养过夜，采用煮-冻-煮 法提取酵母基因组DNA，具体为：将lmL菌液2500X g离心5min，弃上清，沉淀中加入 500μLPBS悬液沉淀，2500X g离心3min;弃上清，沉淀溶于100μLTE缓冲液中，沸水浴 10min，_80°C冷冻30min，再次沸水浴10min，1500X g离心5min，取上清作为模板PCR。
[0074] ②PCR鉴定，具体为：以酵母菌基因组为模板，使用载体通用引物Α0Χ检测重 组子的PCR反应体系为 50μL，PCR反应程序为：94°C3min，（94°Clmin，55°Clmin， 72°C2min)35cycles;72°C7min。反应结束后取5yL产物电泳检测。有特异片段扩增的菌 被视为阳性菌。
[0075]PCR鉴定的结果显示，从Zeocin终浓度为1.Omg/mL的YPD平板上筛选长势良好 的转化子，使用A0X13'和a-factor组合引物（引物序列略）做PCR鉴定，确认阳性重组 子，PCR检测结果如图3所示。转化子产生约1.5kb的条带，与目的基因相符。说明目的基 因已经通过同源重组整合进入毕赤酵母基因组。保存菌株，用以后续试验。
[0076] 3)灵芝漆酶基因GILac在毕赤酵母中的诱导表达
[0077] 3. 1)将鉴定为阳性的重组子活化后，挑选36#和37#重组子（转化子）分别接种 于BMGY(Bufferedminimalglycerol-complexmedium)培养液中增加其生物量，该培养基 每升含：1%酵母浸出物、2%蛋白胨、lOOmM磷酸钾pH6.0、1.34%YNB、4X10%~5%生物 素以及1%甘油；然后转接到BMMY(Bufferedmethanol-complexmedium)发酵培养液中继 续培养，该培养基每升含：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲液、pH6.0、1.34% 酵母氮源、4X 105%生物素以及0. 5%甲醇，使其0D_约达到2. 0。按高密度摇瓶方式在 28°C，甲醇终浓度为1. 0%，进行诱导表达。分别于24h、48h、72h、96h取诱导上清，经TCA沉 淀浓缩后进行SDS-PAGE检测，评估表达情况。
[0078] 取PCR检测为阳性的rGILac毕赤酵母菌株经甲醇诱导后，进行SDS-PAGE电泳， 考马斯亮兰R250染色不同诱导时间的蛋白表达结果见图4 ;图4表明，当诱导时间分别为 2处、4811、7211、9611时，均有分子质量约为571^&的一条特异的蛋白条带，与冗11^(3蛋白预期 大小一致。可以看出36#转化子随着诱导时间的增加，表达出的漆酶（57kD)的量也逐步增 加，箭头所示。说明漆酶基因在毕赤酵母X33中有一定的表达。
[0079] 3. 2)漆酶基因在毕赤酵母X33中的大量诱导表达及纯化：根据表达测试结果，选取 36#转化子，经活化后接种于BMGY诱导前培养基中，后转接入1. 5LBMMY诱导培养基中，诱 导表达96h。诱导后上清经冻干浓缩后重溶于tris-HCl缓冲液中。利用镍离子亲和层析 (Ni-IDA)纯化重组蛋白，纯化蛋白经过考马斯亮蓝法测定其表达量可达到260mg/L以上。
[0080] 上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同 的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所 限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
【主权项】
1. 一种灵芝漆酶基因GILac酵母工程菌株的构建，其特征在于，通过从灵芝中克隆出 漆酶基因GILac，经EcoRI和Xbal双酶切后克隆入毕赤酵母表达质粒并构建出表达载体，最 后将其电转化入毕赤酵母表达宿主菌中，经培养扩增和筛选后得到毕赤酵母工程菌； 所述的灵芝漆酶基因GILac的核苷酸序列如SeqID.No. 1所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的灵芝，采用灵芝（G.lucidum51562)、 灵芝（G.lucidum50044)、赤芝（G.lucidum00679)、紫芝（G.sinensi50817)。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的双酶切是指：将拟表达的灵芝漆酶基 因GILac的cDNA序列经EcoRI和Xbal双酶切。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的构建是指：将拟表达的灵芝Lac的 cDNA序列经EcoRI和Xbal双酶切后，克隆入同样经过Xbal和EcoRI双酶切的pPICZ α A-载 体，再将酶切回收产物连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的电转化是指：取5-10μL线性化的单 拷贝质粒分别加入80μL毕赤酵母&3感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上 放置5min，放入电转仪，电击，电压：1500V，电击时间5. 4ms，电击完成后，立即加入lmL、lM 预冷的山梨醇，混匀后转移到1. 5mL离心管中，28°C，静止1~2h，每200yL涂一块YPD平 板。28°C，培养3d，形成分散，饱满的单克隆，挑斑接种3mLYH)液体培养基中。6. -种根据上述任一权利要求中所述的重组毕赤酵母阳性菌株的应用，其特征在于， 将其用于制备灵芝漆酶rGILac。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述的制备是指：将所述重组毕赤酵母阳性 菌株接种后，在BMGY培养液中加入甲醇进行诱导，然后收集上清液并进行透析浓缩后重溶 于tris-HCl缓冲液中，最后利用镍离子亲和层析纯化重组蛋白。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的接种具体是指：将挑选的重组毕赤酵 母X33阳性菌株接种于含有BMMY培养液的摇瓶中，28°C下250rpm培养16-18h后，离心并 收集细胞；所述的BMMY培养液每升中含有：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲 液、pH6. 0、1. 34 %酵母氮源、4X10 5 %生物素以及0. 5 %甲醇。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的诱导是指：用BMGY培养液重悬接种 后的细胞进行诱导，每24h补加甲醇至终浓度为1% ;所述的BMGY培养液每升中含有：1% 酵母提取物、2 %蛋白胨、lOOmM磷酸钾缓冲液、pH6. 0、1. 34 %酵母氮源、4X105%生物素以 及1 %甘油。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述的透析浓缩是指：将诱导后的产物在 4000rpm、室温环境下离心5分钟，收集上清液，上清液装入透析袋中，与pH6. 0的磷酸缓冲 液中透析48h，每12h更换一次缓冲液，重复直至上清液浓缩到原体积的40%。11.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述的镍离子亲和层析是指：利用Ni-NTA 柱纯化；用20倍柱体积的Wash buffer洗柱，用以除去非目的蛋白；目的蛋白由Elution buffer洗脱出来，供SDS-PAGE电泳分析。
【专利摘要】一种灵芝漆酶毕赤酵母基因工程菌株的构建与应用，通过从灵芝中克隆出漆酶基因GlLac，经EcoRI和XbaI双酶切后克隆入毕赤酵母表达质粒并构建出表达载体，最后将其电转化入毕赤酵母表达宿主菌中，经培养扩增和筛选后得到毕赤酵母工程菌。本发明构建了灵芝漆酶(Lac)的酵母分泌型共表达载体pPICZαA-GlLac，并转化毕赤酵母(Pichia？pastoris)X33，通过挑选高博莱霉素(Zeocin)抗性的重组子作为毕赤酵母工程菌。毕赤酵母的胞外表达载体pPICZαA是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体，能表达高拷贝的基因。
【IPC分类】C12N9/02, C12N1/19, C12N15/81, C12R1/84, C12N15/53
【公开号】CN105349558
【申请号】CN201510876149
【发明人】周选围, 徐慧, 白晓慧, 郭梦圆, 高艳华
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月3日