预测传染病状态的方法和试剂盒的制作方法

专利名称：预测传染病状态的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及医药领域，并且更具体地涉及预测受试者传染病状态的方法。
背景技术：
在所有年龄的人中都发生鼻咽的病原体菌落形成并且经常伴随或后接病原体引发的疾病(Smart等，(1987)Epidem.Infect.，98203-209)。病原体包括细胞性，病毒性，和真核的病原体。这些疾病包括呼吸道感染如肺炎(包括非典型性肺炎)、支气管炎、窦炎，和流行性感冒或流感样疾病，以及不限于呼吸道的疾病，包括中耳感染(如中耳炎)和结膜炎。由病原体引发的疾病(例如，呼吸性感染)也能够与主要不是由传染性生物引发的疾病(例如，慢性阻塞性肺病，或COPD)共有症状，经常需要诊断差别以便医生推荐适合的疗法。
另外具有鼻咽病原体菌落的健康人一般比形成了菌落并患有由相同病原体引发的病症的个体具有更少的病原性细菌计数。关于个体鼻咽中病原体的水平需要至少半定量的信息，允许医生将携带者(健康的，但有菌落形成的个体)与还患有由问题病原体引发的疾病的有菌落形成的个体区别开来。当疾病以高发病率或以流行性水平发生时，或者在病原体广泛分布但并非全部携带者都发病的情形(例如，在实际上幼儿全部被能够引发急性中耳炎的病原体形成菌落的日托中心或幼儿园里，或在许多居住者可以被引发肺炎的病原体形成菌落的养老院或护理院里)，这种信息特别重要。当由一种病原体引发的疾病的症状与不是由该病原体引发的疾病的症状相同或相似时这种信息也是有价值的，例如，将细菌性呼吸感染与病毒性呼吸感染或与并非由任何病原体引发的呼吸疾病区别开来。对于医生来说需要能够快速地和准确地将可能被病原体形成菌落的健康个体与患有由该病原体引发的疾病的个体区别开来，以便正确地开出必要治疗的处方(例如，适当的抗生素或抗生物素(antibiologic))对于引发呼吸道感染的病原体或据信在鼻咽形成菌落(colonize)的病原体进行培养，随后通过显微的或生化的标准进行鉴定，仍然是确证病原体是否存在的“黄金标准”。不过，培养耗费时间(一般费时从大约3到大约7天)，并且培养和随后的显微或生化鉴定测试都需要高度熟练的人员。培养是一种灵敏的检测方法，在一些情况下能够检测单一的病原体细胞，但是非常易于污染。例如，培养物可以被目标病原体之外的物种，例如，被作为正常鼻咽菌群的部分的细菌污染，其可以生长超过培养物并使结果不明确。其它的检测方法依赖于核酸扩增。尽管一般比培养更快，核酸扩增方法也是高度灵敏的(能够检测单一拷贝的特定核酸序列)，因而易受污染。当受试者是“携带者”或被问题病原体形成菌落但是健康的个体，也就是说，没有由该病原体引发的疾病症状时，培养或核酸检测的灵敏性能够导致“假阳性”。培养和核酸扩增方法都需要特定的装备和受过训练的技术人员。培养和核酸扩增方法都不是进行快速的，护理点(point-of-care)诊断的合适技术，如能够在医生的办公室或在患者床边实施的测试。
在医生的调查中鉴定出诊断的不确定性是抗生素处方的主导因素(1998 Massachusetts Physician Survey，Alliance for the Prudent Use ofAntibiotics，可在www.tufts.edu/med/apua/Research/physicianSurveyl-01/physicianSurvey.Htm上获得)。虽然被调查的相同医生引述他们对于抗生素抗性的关注作为不开出使用抗生素的处方的最重要动机，但诊断的不确定性仍然是他们决定开出广谱而非狭谱抗生素的处方(典型的抗生素使用不当)的主要原因(″Antibiotic ResistanceSynthesisof Recommendation by Expert Policy Groups″，Avorn等.(编辑)，Alliance for the Prudent Use of Antibiotics and the World HealthOrganization，2001，155pp.)。因而，急需方法以高度确定性来预测患者是否需要抗生素治疗，或是否必需的抗生素治疗应为狭谱的而非广谱的。
本发明提供了满足对于快速和准确方法的需要的方法，所述方法将可能被病原体形成菌落的健康个体与患有由该病原体引发的疾病的个体区别开来。所述方法可以用于确定受试者是否应当用抗生素或抗生物素进行治疗，和用于确定抗生素或抗生物素的适当类型。这种方法优选是便宜的，技术上简单的，并且优选是护理点式的诊断，其允许医生即刻作出治疗决定。
发明描述除非另外限定，本文所用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含意。一般，本文所用的命名和下面描述的制造或实验室操作是公知的并在本领域普遍采用。对于这些操作使用传统的方法，如那些现有技术和各种通用参考书中提供的方法。当术语以单数提供时，发明人还考虑该术语的复数形式。本文所用的命名和下面描述的实验室操作是公知的命名和操作，并在本领域普遍采用。当并入作为参考的参考文献中采用的术语和定义有差异时，本申请所用的术语将具有本文所给出的定义。本文所用的其它技术术语具有它们被使用领域的其普通含义，如多种技术词典中所例示的(例如，Chambers Dictionary of Science and Technology，Peter M.B.Walker(编辑)，Chambers Harrap Publishers，Ltd.，Edinburgh，UK，1999，1325pp.)。发明人并不想要受限于一种作用机制或模式。其中参考文献只是为说明的目的而提供的。
本发明包括快速确定受试者疾病状态的方法，其中所述疾病由传染性生物所引发，包括下列步骤(a)提供来自所述受试者的鼻咽来源的样品；(b)将结合剂直接与样品接触，其中所述结合剂能够特异性结合源自所述传染性生物的表位；(c)允许所述结合剂与源自存在于样品中的所述传染性生物的表位特异性结合并形成复合体；和(d)检测所述复合体，其中如果样品中传染性生物的浓度大于或等于参考浓度则检测是阳性的，而如果样品中传染性生物的浓度小于参考浓度则检测是阴性的。
本发明的方法可以应用于任何被怀疑患有由传染性生物引发的疾病的患者，其中所述传染性生物至少可以在病人，或具有疾病症状的人的鼻咽区被潜在性地发现，对于所述症状而言诊断差别是必需的以便进行适当的治疗。这些受试者优选是人受试者，包括婴儿，幼儿，和任何年龄的成年人。
本发明的方法可以应用于任何由传染性生物引发的疾病，其中所述传染性生物至少可以在病人的鼻咽区被潜在性地发现。特别相关的疾病包括呼吸道感染(如，但不限于，流感样疾病，肺炎，支气管炎和窦炎)，以及非呼吸道传染病(如，但不限于，急性中耳炎和结膜炎)。所述传染性生物可以是任何潜在地发生于鼻咽区并且能够引发目标传染病，或者能够引发疾病症状的传染性生物，对于所述症状而言诊断差别是必需的以便进行适当的治疗。目标传染性生物包括致病性细菌(包括支原体)，致病性病毒，和真核病原体(包括真菌和原生动物)。普遍存在于健康人的鼻咽和口咽中，并且至少是潜在致病性的传染性生物，包括细菌如不动杆菌属(Acinetobacter)物种，绿色链球菌(viridans streptococci)，β-溶血性链球菌(包括A类β-溶血链球菌如生脓链球菌(Streptococcuspyogenes))，非溶血性链球菌，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，葡萄球菌(包括凝固酶阴性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))，微球菌，棒状杆菌属(Corynebacterium)物种(包括白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae))，奈瑟菌属(Neisseria)物种(包括脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae))，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，支原体(Mycoplasma)物种，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，副流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)，粘膜炎莫拉菌(Moraxella (Branhamella)catarrhalis)，肠杆菌(enterobacteria)，乳杆菌属(Lactobacillus)物种，韦荣球菌属(Veillottella)物种，分支杆菌属(Mycobacterium)物种，假单胞菌属(Pseudomonas)物种，克雷白菌属(Klebsiella)物种(包括克雷白杆菌(Klebsiella ozaenae)或肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumoniae))，啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)，拟杆菌属(Bacteroides)物种，消化链球菌属(Peptostreptococcus)物种，放线菌属(Actinomyces)物种，和螺旋菌；真菌，如白色念珠菌(Candida albicans)和丝状真菌；以及病毒，如单纯疱疹病毒(″Bailey and Scott′s Diagnostic Microbiology″，第9版，Baron等(编辑)，Mosby，St.Louis，MO，1994，pp.220ff.)。
所述方法的一个步骤包括提供来自所述受试者的鼻咽来源的样品。可以使用任何适合的鼻咽来源的样品。优选的鼻咽来源的样品包括，但不限于，鼻咽拭子，鼻咽洗出液，鼻咽流出物，鼻咽吸出物，鼻部拭子，鼻部洗出液，鼻部流出物，鼻部吸出物，及其组合。为了用于本发明的方法中，适合的鼻咽来源的样品可能需要最小的制品(例如，收集入合适的容器中)，或更广泛的制品(如，但不限于，不需要的物质，如污染物，不需要的细胞或细胞物质，或内生酶的去除，灭活，或阻抑；用缓冲液或化学试剂处理；过滤，离心，大小选择，或亲和性纯化；细胞固定，渗透，或裂解；和浓缩或稀释)。在一个非限制性的实施例中，目标表位是通过用裂解剂(例如，包含去垢剂或表面活性剂的缓冲液)处理由肺炎链球菌释放的可溶性糖类。
所述方法的另一个步骤包括将结合剂直接与样品接触，其中所述结合剂能够特异性结合源自所述传染性生物的表位。所述源自传染性生物的表位可以是任何合适的表位，包括，但不限于，肽，多肽，蛋白质，糖蛋白，糖类，脂类，糖脂类，脂蛋白，核酸，抗原，酶，受体，细胞壁组分，传染性生物的全细胞，传染性生物的片段，由传染性生物分泌的物质(如毒素，酶，和外聚合物)，及其组合。所述表位可以任选地进行修饰，例如，通过物理的或化学的修饰；所述结合剂可能能够特异性结合经修饰的表位。表位的修饰可以包括任何合适的修饰，包括，但不限于，用化学试剂或酶处理，氧化或还原，用可检测的标记物进行标记，以及将表位共价或非共价地附于单独的部分(moiety)、分子、分子结构或表面上。所述结合剂可以能够特异性结合模拟表位(mimotope)，如模拟天然源自传染性生物的表位的肽(见，例如，Kieber-Emmons(1998)Immunol.Res.，1795-108；Shin等(2001)Infect.Immun.，693335-3342；Beenhouwer等(2002)J.Immunol.，1696992-6999；Hou and Gu(2003)J.Immunol.，1704373-4379；和Tang等(2003)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，101078-1084，在此将它们的全部内容并入作为参考)。将结合剂直接与样品接触，其可以预先进行最小的或更加广泛的制备(minimal or more extemsive preparation)，但是其未曾进行过传染性生物的培养或核酸扩增。
实际上结合剂可以是任何能够识别和结合所述表位的分子或分子的组合。这些结合剂可以包括，而不限于，肽，多肽，抗体，Fab片段，融合蛋白，嵌合分子，核酸，核酸模拟物(例如肽核酸)，细胞表面抗原，糖，或其组合。在一个优选的实施方案中，所述结合剂包括抗体(单克隆的或多克隆的，天然的，经修饰的，或重组的)或抗体片段(如Fab片段或单链抗体可变区片段)；制备，修饰，和利用这些抗体或抗体片段的方法是本领域已知的(见，例如，″AntibodiesALaboratory Manual″，E.Harlow and D.Lane，编辑，Cold SpringHarbor Laboratory，1988，726pp；″Monoclonal AntibodiesA PracticalApproach″，P.Shepherd and C.Dean，编辑，Oxford University Press，2000，479pp.；and″Chicken Egg Yolk Antibodies，Production andApplicationIgY-Technology(Springer Lab Manual)″，R Schade等，编辑，Springer-Verlag，2001，255pp.，在此将它们的全部内容并入作为参考)。所述结合剂可以包括抗原，如能够特异性结合识别源自所述传染性生物的表位的抗体的抗原。在其它的实施方案中，所述结合剂可以包括结合诸如肽或小分子的靶的核酸或核酸模拟适体，或结合配体的受体，或结合受体的配体。
任选地所述结合剂可以包括官能团(如化学活性部分或交联部分)或可检测的标记物；导入这些官能团或可检测标记物的方法是本领域已知的(见，例如，R.P.Haugland，″Handbook of FluorescentProbes and Research Products″，第9版，J.Gregory(编辑)，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，966pp.；Seitz and Kohler(2001)，Chemistry，73911-3925；Pierce Technical Handbook，PierceBiotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL；和Pierce 2003-2004 ApplicationsHandbook and Catalog，Pierce Biotechnology，Inc.，2003，Rockford，IL，在此将它们的全部内容并入作为参考)。所述结合剂在溶液中可以是游离的，或者可以暂时或永久地附于单独的部分，分子，分子结构或表面。在一个非限制性的实施例中，所述结合剂可以通过干燥到表面上而进行暂时固定，其中添加一种流体可以引发结合剂变为可移动的。在另一个非限制性的实施例中，所述结合剂可以通过共价或非共价附着于表面，如附着于膜，微板孔，试管，芯片或载玻片上而进行永久固定。
在一个优选的实施方案中，所述结合剂单价地结合到目标表位上。在另一个优选的实施方案，所述结合剂多价地，例如双价地和任选地双特异性地结合到目标表位(或模拟表位)上。所述结合剂能够以多于一种形式或类型使用，例如，其中所述结合剂是抗体或抗体片段并且用于夹心测定法，所述夹心测定法包括固定表位的结合剂和结合相同表位的可检测地标记的结合剂。
通过本领域已知的方法，例如，通过基于淘洗法选择肽序列，可以提高所述结合剂特异性结合源自传染性生物的表位的能力(见，例如，Coomber(2001)Methods Mol.Biol.，178133-145；Zhou等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，995241-5246；Fehrsen and du Plessis(1999)Immunotechnology，4175-184；Deng等(1994)J.Biol.Chem.，2699533-9538；Burioni等(1998)Res.Virol.，149327-330；Boel等(1998)Infect.Immun.，6683-88；和Parsons等(1996)Protein Eng.，91043-1049，在此将它们的全部内容并入作为参考)。
提高所述结合剂结合源自传染性生物的表位(或模拟所述表位的模拟表位)的能力可以利用本领域已知的展示法，包括在多肽(Kamb，等，美国专利6,025,485；Christmann等，1999，Protein Eng.，12797；Abedi等，1998，Nucleic Acids Res.，26623；Peelle等，2001，J ProteinChem.，20507)，噬菌体(He，1999，J.Immunol.Methods，231105；Smith，1985，Scienee，2281315)，核糖体(Schaffitzel等，1999，J.Immunol.Methods，231119；Roberts，1999，Curr.Opin.Chem.Biol，3268)，an mRNA(Wilson等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，983750)，或酵母细胞表面(Yeung and Wittrup，2002，Biotechnol.Prog，18212；Shusta等，1999，J.Mol.Biol.，292949)，细菌细胞表面(Leenhouts等，1999，Antonie Van Leeuwenhoek，76367；Christmann等，2001，J.ImmunolMethods，257163)，或细菌孢子表面(Wittrup，2001，Curr.Opin.Biotechnol.，12395；Boder and Wittrup，1998，Biotechnol.Prog.，1455)上进行展示。将此段中引用的全部参考文献并入本文作为参考。
所述方法的另一个步骤包括允许所述结合剂与源自存在于样品中的所述传染性生物的表位特异性结合并形成复合体。所述结合剂与表位的结合可以通过任何合适的方式，包括，但不限于，共价结合，非共价结合，抗体-抗原识别，受体-配体结合，适体核酸结合，物理吸附，静电力，离子相互作用，氢链，亲水-疏水作用，范德华力，磁力，及其组合。优选地，所述结合剂以足够的特异性结合所述表位以给出所述结合剂和表位之间最小的或没有非特异性或交叉反应性结合，所述表位源自除了目标传染性生物之外的来源(如来自人受试者的细胞或组织，或来自其它传染性或非传染性物种)。优选地所述结合剂与表位的特异性结合导致具有足够稳定性的复合体以便被检测。
所述方法的另一个步骤包括检测所述复合体，其中如果样品中传染性生物的浓度大于或等于参考浓度则检测是阳性的，而如果样品中传染性生物的浓度小于参考浓度则检测是阴性的。复合体的检测可以是直接的，例如通过检测结合剂上的标记物。或者，复合体的检测可以是间接的，可通过任何合适的方法，包括，但不限于，利用二抗，如具有可检测标记的二抗。有用的可检测标记包括，但不限于，荧光团，发光体，共振能量转移对的成员，镧系，染料，颜料，放射性同位素，磁性标记，自旋标记，重原子，金属，微粒(如金微粒或磁性微粒)，和酶。
如果源自鼻咽的样品中传染性生物的浓度大于或等于参考浓度则检测是阳性的。相反，如果源自鼻咽的样品中传染性生物的浓度小于参考浓度则检测是阴性的。对于给定传染性生物所选择的参考浓度取决于几种因素，包括，但不限于，结合剂和源自传染性生物的表位的性质，源自鼻咽的样品类型，以及受试者的类型(例如成人或儿童)。参考浓度可以通过常规测试确定。检测可以是线性的(如通过分光光度计测量酶反应的产物形成)或非线性的(如金标记物的目测)。任选地检测是至少半定量的，例如，判定大于或等于，或小于，参考值。任选地检测是定量的，其中阳性检测信号可以与一定范围的传染性生物浓度相关。
受试者可以是传染性生物的鼻咽“携带者”，也就是说，仍然是健康的但一般由传染性生物以相对较低的浓度在鼻咽形成菌落，其中相对较高浓度的传染性生物与由该生物引发的疾病症状相关联。在这种情况下，所需的参考浓度是这样一种浓度，即在它以下来自受试者的源自鼻咽的样品给出阴性的检测结果，所述受试者既可以未由问题传染性生物形成菌落，也可以由传染性生物形成菌落但仍然是健康的。这种相同的参考浓度优选是这样一种浓度，即在这种浓度或其之上来自受试者的源自鼻咽的样品给出阳性的检测结果，所述受试者由传染性生物形成菌落并且致病。
因而，在本发明的一个实施方案中，阳性检测结果表示受试者至少由目标传染性生物形成菌落，或由该生物形成菌落并致病。在本发明的一个备选的实施方案中，阴性检测结果优选表示受试者并未由目标传染性生物在与由该传染性生物引发的疾病相关联的水平上形成菌落。
优选地所需的参考浓度产生至少大约80％的阳性预测值(也就是说，具有阳性检测结果的受试者由所述传染性生物致病的可能性)，更优选是至少大约90％，最优选是至少大约95％。优选地所需的参考浓度产生至少大约80％的阴性预测值(也就是说，具有阴性检测结果的受试者未由所述传染性生物致病的可能性)，更优选是至少大约90％，最优选是至少大约95％。
本发明的方法可以通过合适的测定法来实施。用来实施该方法的合适测定法的非限制性例子包括纤维素试纸(dipstick)或测试条测定法，快速导流测定法(flow-through assays)，层析测定法，亲和分离测定法，侧流测定法，乳胶凝集测定法，放射性免疫测定法，酶联免疫吸附测定法，荧光测定法和发光测定法。能够以任何合适的形式实施测定法，包括，但不限于，膜，过滤器，微量滴定板，试管，芯片，载玻片，和快速导流室。优选地，所述测定法是快速的，最优选是足够快速的以便在相对短的时间内产生结果，如医生或其它健康护理工作者对受试者会诊的时间。
根据所用的测定法，可以设计试剂盒以方便实施该方法。除了实施该测定法的工具之外，试剂盒还可以包括收集和适当处理源自鼻咽的样品的工具(如拭子，吸取样品的工具，洗涤溶液或缓冲液，化学或酶学试剂，滤器，离心管等等)。试剂盒可以包括有助于安全操作可能有危险的样品的材料(如手套和其它个人安全装备，生物危险品处理容器，或净化材料)。试剂盒可以包括该试剂盒的使用说明书，例如，手册、传单、单行本、小册子或视听材料形式的说明书。
本发明的方法和实施该方法的试剂盒的非限制性实施例如下。这个实施例包括快速确定受试者是否未患传染性病症的方法，如由肺炎链球菌引发的急性中耳炎，包括以下步骤(a)提供来自所述受试者的鼻咽来源的样品(如鼻咽拭子或鼻咽冲洗物或鼻冲洗物)；(b)接触包括能够特异性结合一种表位的抗体的结合剂，所述表位由存在于肺炎链球菌全部临床菌株上的可溶性细胞壁多糖抗原组成；(c)容许结合剂(抗体)结合所述表位(肺炎链球菌抗原)并形成复合体；(d)检测所述复合体，其中当肺炎链球菌的浓度大于或等于1×104集落形成单位/ml的参考浓度并表现为看得见的有色信号时，出现阳性检测，而当肺炎链球菌的浓度小于1×104集落形成单位/ml的参考浓度并表现为不存在看得见的有色信号时，出现阴性检测。
申请人的受让人，Binax，Inc.，于1999年将其NOW免疫层析(″ICT″)快速诊断测试试剂盒引入市场，所述试剂盒用于检测肺炎链球菌的全部血清群共同的细胞壁多糖抗原。这种测试已被美国食品与药品管理局批准用于检测尿样中的抗原，并且描述于美国专利号5,877,028，美国专利申请号09/156,486，和美国专利申请号09/518,165中，并且描述于美国专利申请号09/397,110中，其公开了所述测试在检测除了尿之外的其它人体液样品的靶抗原中的效力(在此将所有这些专利和专利申请的全部内容并入作为参考)。所述测试具有检测大于1×104菌落形成单位(CFU)/ml样品(尿或其它液体)的肺炎链球菌浓度的能力。任何能够阅读并理解所售测试试剂盒提供的简单说明的人都能在15分钟内实施它。所述测试不需要特殊装备并且能够在任何患者场所实施，如在医生的诊所或患者床边，因而是进行护理点健康服务的适当测试。
申请人的受让者和其它人(Faden等(2002)，Pediatr.Infect.Dis.J.，21791-792)已经发现被肺炎链球菌在鼻咽中形成菌落的儿童以相对高的速率分泌细胞壁多糖抗原，并且仍然健康但形成了菌落的儿童趋于给出与用来自形成了菌落并且致病的儿童的尿获得的相同阳性尿测试结果。正在审批中的，共同转让的美国专利申请10/083,476，描述了改进所述测试以消除由健康携带者儿童所获得的假阳性发生率的方法，在此将所述专利申请的全部内容并入作为参考。
急性中耳炎(AOM)，一种普遍的儿童期疾病，最常由中耳的细菌感染所引发(见，例如，Del Beccaro等(1992)，J.Pediatrics，12081-84；Harper，M.B.(1999)，Pediatr.Infect.Dis.J.，181120-1124；和Klein，J.O.(1994)Clin.Infect.Dis.，19823-833，在此将其全部内容并入作为参考)。在发达国家如美国，引起大多数细菌性AOM的三种病原体是肺炎链球菌，非典型性流感嗜血菌，和粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)，其全部也都是呼吸性病原体。来自鼻咽和来自中耳的同时培养物已经显示为强烈相关的(见，例如，Howie and Ploussard(1971)Pediatr.Dig，31-35；Kamme等(1971)Scand.J.Infect.Dis.，3217-225；Schwartz等(1979)J.Am.Med.Assoc.，2412170-2173；和Faden等(1990)Pediatr.Infect.Dis.J.，9623-626，在此将其全部内容并入作为参考)。
已经显示与儿童健康期相比，在急性中耳炎发作期间肺炎链球菌，非典型性流感嗜血菌，和粘膜炎莫拉菌的携带(carriage)和数量都增加了。同时，鼻咽的非病原性菌群的携带减少，提示在急性中耳炎疾病期间呼吸性病原体在鼻咽环境中变得相对更加重要了(Faden等(1990)Pediatr.Infect.Dis.J.，9623-6260)。形成了菌落的发病儿童比类似形成了菌落但仍然健康的儿童(携带者)具有更高的肺炎链球菌的鼻咽浓度。当使用NOWICT Test测试来自形成了菌落但健康的儿童(携带者)以及来自形成了菌落的发病儿童的液体鼻咽样品时，在测试结果中观察到半定量的和临床上有用的差异。所述NOWICT Test具有超过培养和核酸扩增方法的优点，运行快速并且在技术上简单，因而适合作护理点诊断。
根据本发明，可以将NOW肺炎链球菌ICT Test用于来源于鼻咽的样品以便把由肺炎链球菌形成菌落但仍然健康的受试者与由肺炎链球菌形成菌落并致病的受试者区别开来。用目前市售的NOW肺炎链球菌ICT Test进行的来自许多来源的重复测试结果已经显示，通过培养其鼻咽样品为阳性，但在NOWICT Test中产生阴性结果的形成菌落的儿童，并未发生由肺炎链球菌引发的疾病。因而，对于鼻咽样品实施的NOW肺炎链球菌ICT Test是好的阴性预测值的可靠指示，即，从其中获得样品的受试者没有由肺炎链球菌引发的疾病，所以不需要针对肺炎链球菌感染的抗生素治疗。
据报道肺炎链球菌的阳性鼻咽培养物对于中耳中肺炎链球菌的存在具有少许阳性预测值(Faden等(1990)Pediatr.In fect.Dis.J.，9623-626和Gehanno等(1996)Pediatr.Infect.Disease J.，15329-332)。不过，已经显示鼻咽培养物对于在发达国家造成大多数急性中耳炎的三种病原体的缺失具有高的(大于95％)阴性预测值(Gehanno等(1996)Pediatr.Infect.Disease J.，15329-332，在此将其全部内容并入作为参考)。可以适用本发明的方法来对源自鼻咽的样品测试其它两种主要的AOM病原体，粘膜炎莫拉菌和非典型性流感嗜血菌的超出参考浓度的存在。关于发达世界中的AOM临床诊断，非常需要将一组快速确定受试者是否健康(尽管可能形成了菌落)或由主要目标病原体(肺炎链球菌，粘膜炎莫拉菌和非典型性流感嗜血菌)致病的测定法组合入单一的，方便的测试装置中。
关于其它的传染性呼吸或非呼吸性疾病，其中引发性传染性生物至少可以在病人的鼻咽区中可能被发现，也非常需要将一组快速确定受试者是否健康(尽管可能形成了菌落)或由引发该疾病的传染性生物致病的测定法组合入单一的测试装置中。因而，本发明包括单独或组合地测试病原体的测定法和试剂盒，所述病原体引发肺炎、流感和流感样疾病、支气管炎、窦炎，和结膜炎。此外，本发明包括确定病原体存在的测定法和试剂盒，所述病原体能够经发目标传染性疾病，或能够引发疾病症状，对于所述症状必须有诊断性差别(例如，与非病原体相关的慢性阻塞性肺病的差别)以进行适当治疗。
实施例实施例1鼻咽样品中传染性生物的快速检测本实施例描述了检测鼻咽样品中肺炎球菌抗原的疾病预测值。利用快速肺炎球菌抗原测试来检测具有或没有急性中耳炎的儿童的鼻咽样品中肺炎链球菌的存在或缺失。
肺炎链球菌是儿童中呼吸性感染，并且特别是急性中耳炎(AOM)的主要细菌性原因(Peter and Klein(1997)in″Principles and Practiceof Pediatric Infectious Diseases″，Long等(编辑)，Churchill Livingstone，New York，N.Y.，pp.828-835)。在高比例的病例中，来自AOM患者的鼻咽和中耳样品的同时培养物显示相同的病原体(见，例如Dickinson等(1988)J.Infect.Dis.，158205-208；Faden等(1990)Pediatr.Infect.Dis.J.，9623-626；Gehanno等(1996)Pediatr.Infect.Dis.J，15329-332；Howie等(1971)Pediatr.Digest，1331-35；Loos等(1989)Infect.Immun.，572751-2757；和Schwartz等(1979)J.Am.Med.Assoc.，2412170-2173，在此将其全部内容并入作为参考)。
一种体外快速免疫层析测定法(用于肺炎链球菌的NOWICTTest，Binax，Inc.，Portland，ME)获得联邦批准用于检测来自具有肺炎症状的患者的尿样中的肺炎球菌可溶性抗原。用于NOWICT Test中的结合剂是能够特异性结合源自传染性生物的表位(存在于所有肺炎链球菌临床菌株上的单一细胞壁多糖)的抗体(见Miller等(1990)Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.，116335-336；和Palv andLehtinen(1987)Int.J Pediatr.Otorhinolaryngol.，14123-128，在此将其全部内容并入作为参考)。因而所述NOWICT Test能够检测肺炎链球菌的所有分离株，不像其它商业上现有的基于免疫化学的试剂盒，其利用反向电流免疫电泳或者乳胶凝集并且它们的检测限于更普遍的肺炎链球菌类型。所述NOWICT Test比聚合酶链式反应(PCR)检测法更加便宜并且在技术上更加简单，并且不需要经过特殊训练的技术人员或高级装备。所述NOWICT Test试剂盒收入兔抗肺炎链球菌抗体作为结合剂，吸附到硝酸纤维素膜上。如果肺炎球菌抗原在样品中，15分钟内在膜上出现易于辨别的粉红色到紫色的线条。包括对照以确定测试的有效性。对于由脑脊液组成的样品，当存在的肺炎链球菌浓度大于或等于1×104集落形成单位/ml的参考浓度时，所述NOWICT Test给出阳性结果，在测试的有效期当存在的肺炎链球菌浓度大于或等于5×104集落形成单位/ml的参考浓度时为100％的总体检测率(NOW肺炎链球菌测试产品说明书，Binax，Inc.，Portland，ME，在此将其全部内容并入作为参考)。
在获得知情同意后于三个地点招收了138位受试者。所述受试者是15岁以下的儿童，他们既可以是健康的也可以是临床上患有急性中耳炎的。不考虑性别或种族招收所述受试者。如果儿童已在上一个月内用抗生素进行过治疗则将他们排除在研究之外。
采用NOWICT Test用于测试来自儿童的鼻咽样品中的肺炎球菌抗原(Faden等(2002)J.Clin.Microbiol.，404748-4749.)。用拭子(Mini-tip Culturettes，Becton Dickinson，Sparks，Md.)获取鼻咽样品。使用相同的拭子收集鼻咽样品进行NOWICT Test的抗原测试并且进行培养以确证所述鼻咽样品中肺炎链球菌的存在或缺失。对于用NOWICT Test进行的抗原测试，根据试剂盒中的说明来测试鼻咽拭子样品。
肺炎链球菌的NOWICT Test提供一种免疫层析膜测定装置(见美国专利5,877,028和美国专利申请号09/156,486，美国专利申请号09/397,110，和美国专利申请号09/518,165，在此将其全部内容并入作为参考)，其包括通过吸附作用永久固定的包含兔抗肺炎球菌抗原抗体的硝酸纤维素膜作为第一条(″样品线″)和通过吸附作用永久固定的对照抗体作为第二条(″对照线″)。该装置还包括含有兔抗肺炎球菌抗原抗体和抗物种抗体的缀合物垫(惰性纤维支持物)，两种抗体都缀合到肉眼观察的金粒上并通过干燥到所述缀合物垫上而进行临时固定。将所述缀合物垫和条状硝酸纤维素膜组合入测试条中，所述测试条置于加装铰链的书形装置一侧，所述装置在测试条的对侧还包含容纳拭子样品的孔。
简言之，将鼻咽拭子样品插入测试装置的孔中。从滴瓶中向孔内加入含有去垢剂和叠氮钠的缓冲液，闭合所述装置，将样品与测试条接触。存在于样品中的肺炎球菌抗原被金缀合的兔抗肺炎球菌抗原抗体特异性结合以形成复合体。当形成足够的复合体时，得到的复合体被固定在测试条样品线中的兔抗肺炎球菌抗原抗体捕获以形成肉眼检测的信号(粉红色到紫色的着色线)。金缀合的抗物种抗体被测试条对照线中固定的对照抗体捕获也给出肉眼检测的着色线。如果在15分钟或更短的时间内在样品线上出现粉红色到紫色的着色线则测试结果是阳性的，如果在15分钟里在样品线上未出现粉红色到紫色的着色线则测试结果是阴性的。为了所述测定有效，对照线应当是看得见的。
对于培养来说，将鼻咽拭子样品在收集的12小时内培养于绵羊血琼脂和巧克力琼脂上。将平板于36℃在二氧化碳环境中温育18-24小时。通过菌落形态，革兰氏染色特性，奥普托欣敏感性，和胆汁溶解性来鉴定肺炎链球菌。通过在巧克力琼脂上的生长，菌落形态，革兰氏染色特性，对X和V因子的生长需要，以及不与典型抗血清(typingantisera)凝集来鉴定非典型性流感嗜血菌。通过菌落形态，革兰氏染色特性和阳性丁酸酯酶测试来鉴定粘膜炎莫拉菌。
所述138位受试者的年龄在4-168个月，中间值22.5个月。72位受试者是男性，66位是女性。53位儿童被分类为健康的，85位被分类为患有急性中耳炎(AOM)。从每位受试者收集鼻咽样培养物。从37％的儿童中回收到肺炎链球菌。健康儿童比患AOM的儿童形成菌落的比率少(45.3％对87.1％，P＜0.001)。从20.8％的健康儿童中回收到肺炎链球菌，从47.1％的患急性中耳炎的儿童中回收到肺炎链球菌(P＜0.01)。
计算整个群体，以及健康的和AOM亚群体的NOWICT Test敏感性，特异性，阳性预测值和阴性预测值。通过卡方分析评估组之间的差异。NOWICT Test结果对于35.5％的样品是阳性的，对于64.5％的样品是阴性的。NOWICT Test分别具有92.2，97.7，95.9，和95.5％的敏感性，特异性，阳性预测值和阴性预测值。对于健康和AOM亚群体的结果是相似的。因而，来自鼻咽样品的阴性NOWICT肺炎链球菌Test结果表明样品中不存在肺炎链球菌，所以可靠地预测出受试者体内不存在由肺炎链球菌引发的急性中耳炎。
实施例2参考浓度在实施例1中，通过培养从其中回收到肺炎链球菌的20.8％的健康受试者可以是携带者，也就是说，健康但由肺炎链球菌形成了菌落。在阴性预测值方面这种携带者可以给出“假阳性”结果。通过提高鼻咽拭子样品的肺炎链球菌参考浓度可以降低这种“假阳性”的发生率，优选从大约1×104集落形成单位/ml到大约5×104集落形成单位/ml；或从5×104集落形成单位/ml到大约5×105集落形成单位/ml；或从大约5×105集落形成单位/ml到大约5×106集落形成单位/ml，或从大约5×106集落形成单位/ml到大约5×107集落形成单位/ml，或从大约5×107集落形成单位/ml到大约5×108集落形成单位/ml。通过如实施例1中所述的方法，例如，通过利用具有适当调节的试剂量，如结合剂的量的相同快速免疫层析装置，可以轻易地确定可接受的参考浓度。
每种传染性生物的参考浓度，鼻咽样品的类型，测定格式，以及检测方法必须通过测试进行确立。这些参考浓度可以是适于对目标疾病状态产生可接受的阳性预测值，阴性预测值，或二者的任何范围。目标传染性生物包括，但不限于(1)能够引发急性中耳炎的病原体(如实施例1中所示，除了肺炎链球菌之外，非典型性流感嗜血菌和粘膜炎莫拉菌)；(2)能够引发流感样疾病的病原体(见，例如，Centers for DiseaseControl(2001)Morbidity Mortality Weekly Report，50(44)984-986，在此将其全部内容并入作为参考)，如病毒(包括，但不限于，流感病毒，鼻病毒，呼吸道合胞体病毒，腺病毒，副流感病毒，冠状病毒和间质肺病毒(metapneumovirus))和细菌(包括，但不限于，肺炎链球菌，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)，和肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae))；(3)能够引发细菌性肺炎(包括，但不限于A类肺炎链球菌，生脓链球菌，肺炎链球菌，肺炎克雷白菌，葡萄球菌属物种，流感嗜血菌，肺炎衣原体，肺炎支原体和假单胞菌属物种)，病毒性肺炎(包括，但不限于流感病毒，鼻病毒，呼吸道合胞体病毒，腺病毒，副流感病毒，冠状病毒，汉滩病毒，巨细胞病毒和间质肺病毒)，或真菌性肺炎(包括，但不限于，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)，念珠菌属(Candida)物种，曲霉属(Aspergillus)物种，毛霉菌属(Mucor)物种，新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)，和卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii))的病原体(见，例如，Richards等(1994)Arch.Dis.Child.，71254-255，在此将其全部内容并入作为参考)；(4)能够引发支气管炎的病原体，如细菌(包括，但不限于，支原体物种如肺炎支原体，肺炎衣原体，Bordatellapertussis，A类链球菌，生脓链球菌，粘膜炎莫拉菌，流感嗜血菌，副流感嗜血菌，和金黄色葡萄球菌)和病毒(包括，但不限于，流感病毒，鼻病毒，呼吸道合胞体病毒，腺病毒，副流感病毒，冠状病毒，汉滩病毒，巨细胞病毒和间质肺病毒)；(5)引发窦炎的病原体，如细菌(包括，但不限于，链球菌属物种如肺炎链球菌，流感嗜血菌，葡萄球菌属物种如金黄色葡萄球菌，和奈瑟菌属物种)或真菌；和(6)能够引发结膜炎的病原体，如细菌(包括，但不限于，A类肺炎链球菌，生脓链球菌，肺炎链球菌，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，嗜血杆菌属(Haemophilus)物种，流感嗜血菌，奈瑟菌属物种如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)，和衣原体物种)或病毒。
全部标题都是为了方便读者并且不应被用于限制所述标题后正文的意思，除非是这样限定的。可以对本发明作各种改变和变更而不背离其精神和范围。因此，本发明并不意欲受说明书中具体描述的或附图
中显示的内容所限制，但只受权利要求书中所给出的内容限制。
权利要求
1.一种快速确定受试者疾病状态的方法，其中所述疾病由传染性生物引发，所述方法包括以下步骤(a)提供来自所述受试者的鼻咽来源的样品；(b)将结合剂直接与所述样品接触，其中所述结合剂能够特异性结合源自所述传染性生物的表位；(c)允许所述结合剂与源自存在于所述样品中的所述传染性生物的所述表位特异性结合并形成复合体；和(d)检测所述复合体，其中如果所述样品中所述传染性生物的浓度大于或等于参考浓度，则所述检测是阳性的，而如果所述样品中所述传染性生物的浓度小于所述参考浓度，则所述检测是阴性的。
2.权利要求1的方法，其中阳性检测表明所述受试者有疾病。
3.权利要求1的方法，其中阴性检测表明所述受试者没有疾病。
4.权利要求2的方法，其中所述阳性检测任选地是定量的。
5.权利要求1的方法，其中所述传染性生物选自病理细菌，病理病毒和病理真核生物。
6.权利要求的方法1，其中所述疾病是急性中耳炎。
7.权利要求6的方法，其中所述传染性生物是非典型性流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。
8.权利要求6的方法，其中所述传染性生物是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
9.权利要求6的方法，其中所述传染性生物是粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。
10.权利要求6的方法，其中所述传染性生物是A类链球菌(Streptococcus)。
11.权利要求10的方法，其中所述A类链球菌是生脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
12.权利要求1的方法，其中所述疾病是呼吸道感染。
13.权利要求12的方法，其中所述呼吸道感染是流感样疾病。
14.权利要求13的方法，其中所述传染性生物是病毒。
15.权利要求14的方法，其中所述病毒是流感病毒。
16.权利要求14的方法，其中所述病毒是鼻病毒。
17.权利要求14的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒。
18.权利要求14的方法，其中所述病毒是腺病毒。
19.权利要求14的方法，其中所述病毒是副流感病毒。
20.权利要求14的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
21.权利要求14的方法，其中所述病毒是间质肺病毒。
22.权利要求13的方法，其中所述传染性生物是细菌。
23.权利要求22的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
24.权利要求22的方法，其中所述细菌是肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)。
25.权利要求22的方法，其中所述细菌是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
26.权利要求12的方法，其中所述呼吸道感染是肺炎。
27.权利要求26的方法，其中所述肺炎是细菌性肺炎。
28.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是A类肺炎链球菌(Group A Streptococcus pneumoniae)。
29.权利要求28的方法，其中所述A类链球菌是生脓链球菌。
30.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是肺炎链球菌。
31.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumoniae)。
32.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是葡萄球菌属(Staphylococcus)物种。
33.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。
34.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)。
35.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
36.权利要求27的方法，其中所述传染性生物是假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
37.权利要求26的方法，其中所述肺炎是病毒性肺炎。
38.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是呼吸道合胞体病毒。
39.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是鼻病毒。
40.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是腺病毒。
41.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是流感病毒。
42.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是副流感病毒。
43.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是冠状病毒。
44.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是汉滩病毒。
45.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是巨细胞病毒。
46.权利要求37的方法，其中所述传染性生物是间质肺病毒。
47.权利要求26的方法，其中所述肺炎是真菌性肺炎。
48.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是英膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
49.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是粗球孢子菌(Coccidioides immitis)。
50.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)。
51.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)。
52.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是念珠菌属(Candida)物种。
53.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是曲霉属(Aspergillus)物种。
54.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是毛霉菌属(Mucor)物种。
55.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)。
56.权利要求47的方法，其中所述传染性生物是卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)。
57.权利要求12的方法，其中所述呼吸道感染是支气管炎。
58.权利要求57的方法，其中所述传染性生物是细菌。
59.权利要求58的方法，其中所述细菌是支原体(Mycoplasma)物种。
60.权利要求58的方法，其中所述细菌是肺炎支原体。
61.权利要求58的方法，其中所述细菌是肺炎衣原体。
62.权利要求58的方法，其中所述细菌是Brodatella pertussis。
63.权利要求58的方法，其中所述细菌是A类链球菌。
64.权利要求63的方法，其中所述A类链球菌是生脓链球菌。
65.权利要求58的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌。
66.权利要求58的方法，其中所述细菌是粘膜炎莫拉菌。
67.权利要求58的方法，其中所述细菌是流感嗜血菌。
68.权利要求58的方法，其中所述细菌是副流感嗜血菌。
69.权利要求58的方法，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
70.权利要求57的方法，其中所述传染性生物是病毒。
71.权利要求70的方法，其中所述病毒是流感病毒。
72.权利要求70的方法，其中所述病毒是副流感病毒。
73.权利要求70的方法，其中所述病毒是腺病毒。
74.权利要求70的方法，其中所述病毒是鼻病毒。
75.权利要求70的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒。
76.权利要求70的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
77.权利要求70的方法，其中所述病毒是汉滩病毒。
78.权利要求70的方法，其中所述病毒是间质肺病毒。
79.权利要求12的方法，其中所述呼吸道感染是窦炎。
80.权利要求79的方法，其中所述传染性生物是细菌。
81.权利要求80的方法，其中所述细菌是链球菌物种。
82.权利要求80的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌。
83.权利要求80的方法，其中所述细菌是流感嗜血菌。
84.权利要求80的方法，其中所述细菌是葡萄球菌属物种。
85.权利要求80的方法，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌。
86.权利要求80的方法，其中所述细菌是奈瑟菌属物种。
87.权利要求79的方法，其中所述传染性生物是真菌。
88.权利要求1的方法，其中所述疾病是结膜炎。
89.权利要求88的方法，其中所述传染性生物是细菌。
90.权利要求89的方法，其中所述细菌是A类链球菌。
91.权利要求90的方法，其中所述A类链球菌是生脓链球菌。
92.权利要求89的方法，其中所述细菌是肺炎链球菌。
93.权利要求89的方法，其中所述细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
94.权利要求89的方法，其中所述细菌是嗜血杆菌属(Haemophilus)物种。
95.权利要求89的方法，其中所述细菌是流感嗜血菌。
96.权利要求89的方法，其中所述细菌是脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)。
97.权利要求89的方法，其中所述细菌是淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)。
98.权利要求89的方法，其中所述细菌是腔隙莫拉氏菌(Moraxellalacunata)。
99.权利要求89的方法，其中所述细菌是衣原体物种。
100.权利要求88的方法，其中所述传染性生物是病毒。
101.权利要求1的方法，其中所述鼻咽来源的样品选自鼻咽拭子，鼻咽洗出液，鼻咽流出物，鼻咽吸出物，鼻部拭子，鼻部洗出液，鼻部流出物，鼻部吸出物，及其组合。
102.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括同时或并行检测一种以上的传染性生物。
103.权利要求1的方法，其中所述表位被修饰。
104.权利要求1的方法，其中所述结合剂包含抗体或抗体片段。
105.权利要求1的方法，其中所述结合剂包含官能团或可检测的标记。
106.权利要求1的方法，其中以一种以上的形式使用所述结合剂。
107.权利要求1的方法，其中所述结合剂还能够结合模拟源自所述传染性生物的所述表位的模拟表位。
108.一种实施权利要求1的方法的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了预测受试者传染病状态的方法。该方法快速、简单，并且不需要培养致病性感染因子。
文档编号A61K39/145GK1942577SQ200380110715
公开日2007年4月4日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者罗杰·皮亚西奥, 霍华德·法登 申请人:比纳克斯公司