重组腺病毒及其用图_3

外，我们证明，这些载体（i)在人类群体中具有极度地且出人意料地低 的血清阳性率，并且（ii)在小鼠中表现出有效的免疫原性。低基线抗载体免疫力和有效免 疫原性的这种组合表明，这些新型腺病毒疫苗可以用于生成针对疾病如癌症以及感染物所 引起的疾病的疫苗。
[0076] 本发明的多核苷酸
[0077] 作为第一方面，本发明提供与这三种新型sAd(sAd4287、sAd4310A和sAd4312) 相关的多核苷酸序列。分离多核苷酸可以包括与野生型sAd4287(SEQIDN0:1)、 sAd4310A(SEQIDN0:2)或sAd4312(SEQIDN0:3)中任一个的全部或一部分，或其互补序 列至少90%-致（例如，至少91%、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少 96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的核苷酸序列。本发明的分离多核苷酸可以包 括SEQIDN0s:l-3 的至少 5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、 20000、25000、30000、35000或更多个连续或非连续的核苷酸。
[0078] 在一些实施例中，本发明的多核苷酸可以用作引物，引物的长度介于10-100个 核苷酸之间，更具体地长度介于10-30个核苷酸之间（例如，长度为10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸），并且可以与SEQID NOs: 52-123中任一个至少90 % -致（例如，至少91 %、92 %、93 %或94% -致）、至少95 % 一致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致。
[0079] 在一些实施例中，本发明的多核苷酸包括编码野生型sAd4287、sAd4310A和/ 或sAd4312的纤维蛋白-1、纤维蛋白-2和/或六邻体蛋白的核苷酸序列的全部或一部 分。在一些实施例中，编码纤维蛋白-1的全部或一部分的核苷酸序列可以与编码野生型 sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-1的核苷酸序列（分别对应于SEQIDN0:4、5 和6)至少90%-致（例如，至少91 %、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至 少 96%、97%、98%或 99%-致）或 100%-致。野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312 的 纤维蛋白-1的核苷酸序列分别对应于SEQIDN0s:19、20和21。在一些实施例中，编码纤 维蛋白-2的全部或一部分的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312 的纤维蛋白-2的核苷酸序列（分别对应于SEQIDNO:7、8和9)至少90%-致（例如，至 少91%、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99% - 致）或100%-致。野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-2的核苷酸序列分 别对应于SEQIDN0s:22、23和24。在一些实施例中，编码六邻体蛋白的全部或一部分的 核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的六邻体蛋白的核苷酸序列 (分别对应于SEQIDN0:10、11和12)至少90%-致（例如，至少91 %、92%、93%或94% 一致）、至少95 %-致（例如，至少96 %、97 %、98 %或99 %-致）或100 %-致。野生型 sAd4287、sAd4310A或sAd4312的六邻体蛋白的核苷酸序列分别对应于SEQIDN0s:25、26 和27〇
[0080] 在一些实施例中，本发明的多核苷酸包括编码野生型sAd4287、sAd4310A和/或 sAd4312的纤维蛋白-1的knob结构域的核苷酸序列的全部或一部分。在一些实施例中，编 码纤维蛋白-1的knob结构域的全部或一部分的核苷酸序列可以与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-1的knob结构域的核苷酸序列（分别对应于SEQID NO: 13、14 或 15)至少 90 %-致（例如，至少 91 %、92 %、93%或 94%-致）、至少 95 % - 致（例如，至少 96%、97%、98%或 99%-致）或 100%-致。野生型sAd4287、sAd4310A 或sAd4312的纤维蛋白-1的knob结构域的核苷酸序列分别对应于SEQIDNOs: 28、29和 30。在一些实施例中，编码纤维蛋白-2的knob结构域的全部或一部分的核苷酸序列可以 与编码野生型sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-2的knob结构域的核苷酸序列 (分别对应于SEQIDNO: 16、17和18)至少90%-致（例如，至少91 %、92%、93%或94% 一致）、至少95 %-致（例如，至少96 %、97 %、98 %或99 %-致）或100 %-致。野生型 sAd4287、sAd4310A或sAd4312的纤维蛋白-2的knob结构域的核苷酸序列分别对应于SEQ IDN0s:31、32 和 33。
[0081] 在其他实施例中，本发明的多核苷酸包括编码sAd4287、sAd4310A和/或sAd4312 的纤维蛋白-1、纤维蛋白-2、六邻体蛋白、纤维蛋白-lknob蛋白和/或纤维蛋白-2knob蛋 白的一个或多个核苷酸序列的全部或一部分，以及来自定向用于生成嵌合腺病毒载体的一 种或多种腺病毒载体（包括Adll、Adl5、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50 和 / 或 Pan9(也称作AdC68))的核苷酸序列，如以下所讨论。在其他实施例中，本发明的多核苷酸 包括编码sAd4287、sAd4310A和/或sAd4312的纤维蛋白-1、纤维蛋白-2、六邻体蛋白、纤维 蛋白-lknob和/或纤维蛋白-2knob的一个或多个核苷酸序列的全部或一部分，以及可以 与来自一种或多种腺病毒载体（包括Adll、Adl5、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50 和/或？&119(也称作4(^68))的核苷酸序列至少90%-致（例如，至少91%、92%、93%或 94%-致）、至少95%-致（例如，至少96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的核苷 酸序列。在其他实施例中，本发明的多核苷酸包括来自一种或多种腺病毒载体（包括Adll、 Adl5、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49、Ad50 和 / 或Pan9 (也称作AdC68))的核苷酸序 列，以及可以与编码sAd4287、sAd4310A和/或sAd4312的纤维蛋白-1、纤维蛋白-2、六邻 体蛋白、纤维蛋白-lknob和/或纤维蛋白-2knob的一个或多个核苷酸序列的全部或一部 分至少90%-致（例如，至少91%、92%、93%或94%-致）、至少95%-致（例如，至少 96%、97%、98%或99%-致）或100%-致的一个或多个核苷酸序列的全部或一部分。
[0082] 本发明的载体
[0083] 本发明的特征还在于包括上述任意一个或多个多核苷酸的重组载体。在一些实 施例中，本发明的一个载体可以与本发明的一个或多个载体（例如，1、2、3或更多个载体） 结合使用作为一个载体系统，该载体系统可用于生成本发明的复制缺陷型sAd(rdsAd)或 可复制型sAd(rcsAd)。因此，本发明的特征在于针对在此所述的三种新型sAd(sAd4287、 sAd4310A和sAd4312)中每一个的新型腺病毒载体系统。用于生成复制缺陷型腺病毒的此 类载体系统在本领域中是已知的，并且已被应用来生成基于例如Ad5、Adll、Ad35和Ad49 的无可复制型腺病毒批次（参见，例如W0 97/00326 ;W0 00/70071 ;W0 02/40665;美国公 开号2005/0232900,全部通过引用结合在此）。然而，应用于sAds sAd4287、sAd4310A和 sAd4312的本发明的载体和载体系统是新型的。
[0084] 在一些实施例中，出于产生可复制型sAcKrcsAd)的目的，本发明的载体可以包含 特定sAd(例如，sAd4287、sAd4310A和sAd4312 的E1 区（例如，sAd4287(SEQIDNO: 1)的 nt474 至nt3085;sAd4310A(SEQIDN0:2)的nt474 至nt3088;以及sAd4312(SEQID NO:3)的nt487至nt3100)。此类载体例示于例如本发明的.Elbtg.Empty载体中（参见， 例如图7、14和21，其示出本发明的三种新型腺病毒中每一个的.Elbtg.Empty载体）。
[0085] 在一些实施例中，本发明的载体可以包含左端sAd序列以及表达/转基因盒（参 见，例如图3,其示出pBr/sAd4287.pIX-pV载体，该载体包括sAd4287基因组的从约pIX至 PV的左边部分）。在一些实施例中，载体的表达盒置换或破坏特定腺病毒的E1区。在优 选实施例中，表达盒包括刺激转基因表达的启动子（例如，CMV启动子，例如，CMVlong启动 子），和任选的多腺苷酸化信号（例如，编码感兴趣的抗原性基因产物例如细菌、病毒、寄生 虫、真菌、或治疗性蛋白或其片段的异源核苷酸序列）（参见，例如图2、9和16,其示出本发 明的三种新型腺病毒中每一个的.Empty载体）。通过一个或多个突变，可使E1区缺失（部 分地或完全地）、破坏或失活。
[0086] 在一些实施例中，本发明的载体可以包含sAd序列的左边部分（参见例如，图3， 其示出pBr/sAd4287.pIX-pV载体，该载体包括sAd4287基因组的从约pIX至pV的左边部 分），这包括sAd的五邻体基底和52K编码区域（参见，例如图3、10和17,其示出本发明的 三种新型腺病毒中每一个的.pIX-pV载体）。
[0087] 在一些实施例中，本发明的载体可以包含sAd序列的右边部分（参见例如，图 4,其示出ppBr/sAd4287.Psil.rITR载体，该载体包括sAd4287基因组的从约pVII至右 ITR(rlTR)的右边部分）（参见，例如图4、11和18,其示出本发明的三种新型腺病毒中每一 个的.pV-rITR载体）。在一些实施例中，这些载体可以进一步具有缺失的、破坏的或突变的 E3 区（例如sAd4287(SEQIDN0:1)的nt25973 至nt28596;sAd4310A(SEQIDN0:2)的 nt25915 至nt28496;sAd4312(SEQIDN0:3)的nt25947 至nt28561);参见图 5、12 和 19， 其示出本发明的三种新型腺病毒中每一个的.dE3载体）和/或E4区（例如，sAd4287(SEQ IDN0:1)的nt31852 至nt34752;sAd4310A(SEQIDNO:2)的nt3175〇 至nt34048; 8八(14312(5￡〇10勵:3)的1^31818至1^34116) ;参见图6、13和20，其示出本发明的三种 新型腺病毒中每一个的.dE3.dE4载体），这些区并非腺病毒颗粒的复制和包装所需要的。 如果大的转基因序列将要被结合到载体中，E3区的缺失通常是优选的，因为可包装到功能 颗粒中的基因组大小被限制到约野生型大小的105%。虽然未在此应用，应理解在腺病毒基 因组中可引入其他修饰，如E2A区的缺失，或整个E4区的大部分（如果不是全部的话）的 缺失。在一些实施例中，用本发明的载体转染的细胞可以通过递送缺少区域的功能性而弥 补这些缺陷。E2A区可以通过例如温度敏感的E2A突变或通过递送E4功能来提供。可以 用于弥补本发明的载体的腺病毒基因缺陷（例如，E1、E3和/或E4缺失）的细胞包括例如 PER. 55K、pER.C6K和293细胞。所有这类系统在本领域是已知的并且腺病毒基因组的这类 修饰在本发明的范围内，本发明主要涉及三种新型sAd4287、sAd4310A和sAd4312基因组序 列及其用途。如上所述，本发明的任一种载体可以与本发明的一种或多种其他载体结合使 用。在一些实施例中，使用编码sAd基因组的左侧和右侧以便生成本发明的给定sAd的载 体。
[0088] 本发明的特征还在于用于生成嵌合腺病毒的载体，该载体包括sAd4287、sAd4310A 或sAd4312基因组的一部分以及一种或多种其他病毒的基因组的一部分。在一些实施例 中，本发明的嵌合病毒可以包括六邻体和/或纤维蛋白的全部或一部分的取代。在一些实 施例中，六邻体蛋白的被另一种病毒取代的部分是六邻体蛋白高变区（HVR)中的一个或多 个，例如，sAd4287 六邻体蛋白（SEQIDN0:10)的HVRl(nt403 至nt489)、HVR2(nt520 至 nt537)、HVR3(nt592 至nt618)、HVR4(nt706 至nt744)、HVR5 (nt763 至 786)、HVR6(nt 856 至nt874)和 / 或HVR7(nt1201 至nt1296) ;sAd4310A六邻体蛋白（SEQIDNO:ll) 的HVR1(nt403 至nt477)、HVR2(nt505 至nt516)、HVR3(nt571 至nt591)、HVR4(nt 679 至nt690)、HVR5(nt709 至 735)、HVR6(nt805 至nt816)和 / 或HVR7 (ntll44 至nt 1236);或sAd4312 六邻体蛋白（SEQIDNO:12)的HVRl(nt403 至nt474)、HVR2(nt505 至 nt522)、HVR3(nt577至nt597)、HVR4(nt685 至nt726)、HVR5(nt748至 777)、HVR6(nt 847至nt864)和/或HVR7(nt1192至nt1284)。在一些实施例中，纤维蛋白被另一种病 毒取代的部分是纤维蛋白knob结构域。在一些实施例中，取代的区域被来源于相比Ad5具 有更低的血清阳性率的腺病毒，如亚组B(Adll、Ad34、Ad35和Ad50)和亚组D(Adl5、Ad24、 Ad26、Ad48和Ad49)腺病毒以及猿猴腺病毒（例如，Pan9,也称作AdC68)的区域置换。在 一些实施例中，Ad5、Adll、Adl5、Ad24、Ad26、Ad34、Ad48、Ad49、Ad50 或Pan9/AdC68 的腺病 毒载体骨架包括sAd4287、sAd4310A和/或sAd4312的以上六邻体HVR中的一个或多个的 全部或一部分的取代。
[0089] 本发明的腺病毒
[0090] 如上所讨论，本发明的至少部分地来源于sAd4287、sAd4310A和/或sAd4312的重 组腺病毒可以使用本发明的上述载体来生成。这些腺病毒可以是rcsAd或rdsAd。rdsAd 将包括El区的缺失、破坏或突变失活，并且可以进一步包括E2、E3和/或E4区的缺失、破 坏或突变失活。在一些实施例中，本发明的腺病毒可以包括抗原性或治疗性基因产物或其 片段，包括细菌、病毒、寄生虫或真菌蛋白，或其片段。在一个优选实施例中，当在宿主或宿 主细胞中表达时，抗原性基因产物或其片段能够引发强烈的免疫反应。在一些实施例中，细 菌蛋白或其片段可以来源于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、微小分枝杆菌、麻 风分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、金黄 色葡萄球菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼠疫杆菌、白喉杆菌、 脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌或炭疽杆菌。在一些实施例中，病毒蛋白或其 片段可以来源于选自下组的病毒科的病毒，该组由以下各项组成：逆转录病毒科、黄病毒 科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、纤丝病毒科、披膜病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒 科、冠状病毒科、弹状病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、 乳头瘤病毒科、细小病毒科、星状病毒科、多瘤病毒科、杯状病毒科以及呼肠孤病毒科。在 一些实施例中，病毒是人免疫缺陷病毒（HIV)、人乳头瘤病毒（HPV)、甲型肝炎病毒（HepA)、 乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、大天花、小天花、猴痘病毒、麻疹病毒、风疹病 毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒（VZV)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、日本脑炎病毒、单 纯疱疹病毒（HSV)、巨细胞病毒（CMV)、轮状病毒、流感、埃博拉病毒、黄热病毒或马尔堡病 毒。在一些实施例中，寄生虫蛋白或其片段来自刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵 形疟原虫、三日疟原虫、锥体虫属或军团菌属。在一些实施例中，真菌蛋白或其片段来自曲 霉属、皮炎芽生菌、假丝酵母属、粗球孢子菌、新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌荚膜变种、巴 西副球孢子菌、申克孢子丝菌、接合菌属、伞枝梨头霉、微小根毛霉或少根根霉。在一些实 施例中，治疗性基因产物可以是干扰素（IFN)蛋白、因子VIII、因子IX、促红细胞生成素、 a-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、生长激素、低密度脂蛋白（LDL)、受体IL-2受体 及其拮抗剂、胰岛素、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白介素、胰岛素样生长因子、超氧化物 歧化酶、免疫应答调节剂、甲状旁腺激素和干扰素、神经生长因子、组织纤溶酶原激活剂、和 /或集落刺激因子，或其片段（参见，例如美国专利号6,054, 288,通过引用结合在此）。在 一些实施例中，IFN蛋白具有与以下各项的序列基本一致（例如，至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%-致）的氨基酸序列：人正^€[(例 如，IFN-a-la、IFN-a-lb、IFN-a-2a、IFN-a-2b和共有IFN-a(c0nIFN-a);图 1)、人 IFN-M例如，IFN-P-la和IFN-P-lb)、人IFN-y、或IFN-t、或表现出与干扰素相同或 相似的生物活性的多肽（例如为人IFN-a、人IFN-0、人IFN-y、或IFN-t、或conIFN-a 的活性的至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)(参见美国专利号 4, 695, 623和美国公开号2011/0000480,通过引用结合在此，例如特定IFN序列）。
[0091] 细菌基因产物或其片段的非限制性实例包括分支杆菌的10.4、85A、85B、86C、CFP-10、Rv3871和ESAT-6基因产物或其片段；大肠杆菌的0、H和K抗原或其片段；以及炭 疽杆菌的保护性抗原（PA)或其片段。病毒基因产物或其片段的非限制性实例包括HIV和 其他腺病毒的Gag、Pol、Nef、Tat、Rev、Vif、Vpr或Vpu或其片段（参见，例如美国公开号 2012/0076812,通过引用结合在此）；HSV的9D抗原或其片段；所有含包膜蛋白的病毒的 Env或其片段。寄生虫基因产物或其片段的非限制性实例包括恶性疟原虫的环子孢子（CS) 蛋白、配子表面蛋白Pfs230和Pfs48/45、以及肝特异性抗原1或3(LSA-1或LSA-3)，或其 片段。真菌基因产物或其片段的非限制性实例包括任何细胞壁甘露糖蛋白（例如，烟曲霉 的Afmpl)或表面表达的糖蛋白（例如，粗球孢子菌的SOWgp)。
[0092] 使用本发明的组合物的预防或治疗方法
[0093] 本发明的药物组合物可以用作治疗患有疾病（例如，癌症或由感染物引起的疾病 例如AIDS)的受试者（例如，人）的疫苗。具体来说，本发明的组合物可以用于治疗（暴露前 或暴露后）由以下各项引起的感染：细菌，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、 微小分枝杆菌、麻风分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、土拉热弗朗西丝氏菌、布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼠疫 杆菌、白喉杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳杆菌、破伤风梭菌或炭疽杆菌；选自下组的病毒 科的病毒，该组由以下各项组成：逆转录病毒科、黄病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、纤 丝病毒科、披膜病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、冠状病毒科、弹状病毒科、副粘 病毒科、小核糖核酸病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、乳头瘤病毒科、细小病毒科、星状病 毒科、多瘤病毒科、杯状病毒科以及呼肠孤病毒科；寄生虫，包括刚地弓形虫、恶性疟原虫、 间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、锥体虫属或军团菌属；以及真菌，包括曲霉属、皮炎 芽生菌、假丝酵母属、粗球孢子菌、新型隐球酵母、荚膜组织胞浆菌荚膜变种、巴西