专利名称：携带hiv基因的腺病毒载体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种密码子优化的多核苷酸或其片段或衍生物。本发明还涉及由 该优化的核酸序列或其片段或衍生物所编码的多肽或蛋白质。本发明更涉及携带 该优化的多核苷酸的腺病毒载体及其他病毒载体。该多核苷酸、多肽或蛋白质及 携带该多核苷酸的病毒载体可用为疫苗，较佳者是用于HIV感染的预防。二、 背景技术人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV-1)是获得性免 疫缺陷综合症(Acquired human Immune Deficiency Syndrome, AIDS)的病原 体。艾滋病(AIDS)从发现至今只有短短的20余年时间，全球艾滋病感染者已经 累计达到6900万人，其中3200万人已死亡。目前我国的艾滋病流行已进入快速增 长时期，累计感染达84万人。专家估计，如果不采取有效措施，不到十年我国就 可能成为艾滋病流行大国，到2010年我国艾滋病感染者有可能达到1000万人。 2003年全球艾滋病病毒感染500万人，全年死亡300万人。艾滋病流行已经成为全 球关注的公共卫生问题和社会热点问题。从人类与传染病斗争的历史来看，人类最终战胜传染病必须依靠疫苗。尽管 艾滋病疫苗研制难度很大，但欧美发达国家仍投入巨资进行开发。艾滋病疫苗的 研究至今已有20年的历史，在技术策略上经历了四个阶段。第一阶段(1984—1993年)是艾滋病疫苗研究的起始阶段，主要特点是疫苗以单一的蛋白亚单位疫苗 为主，以诱导抗体预防病毒感染为主要目标，忽视细胞免疫的作用。结果是令人 失望的，第二阶段U994—1995年)特点是强调疫苗的细胞免疫反应作用的同 时忽视了体液免疫的作用。该阶段的疫苗形式以诱导细胞免疫反应的重组病毒载 体疫苗(痘苗、金丝雀痘病毒)为主。第三阶段(1996—2002年)总结了注重 疫苗所诱导的体液和细胞免疫反应的均衡。第四阶段(2002年一至今)伴随着 超感染(同一个体先后感染不同的HIV毒株)以及其他病毒逃逸细胞免疫现象的 发现，有效抗艾滋病疫苗更加注重激活保守的具有交叉保护作用的细胞免疫或中 和抗体。迄今为止，已经对HIV-1晚期结构蛋白(Structual protein)特异性细胞 免疫应答做了较为广泛的研究。例如，以结构蛋白Gag、 Pol和Env作为靶标抗 原的各种疫苗也相继进入临床试验。但其有效性和临床安全性尚有待进一步验 证。当前艾滋病疫苗的主流设计路线除了选用当地流行株的上述三个结构蛋白 外，同时还选择1 —2个调控蛋白(Regulatory protein,主要是Nef)作为疫苗 组分。由于单一或有限表位疫苗难以奏效，且病毒易逃逸。所以新一代疫苗理论上应包含尽量多的抗原基因。但是，对HIV早期表达的辅助蛋白(Accessory protein,例如Vif、 Vpr和Vpu)和调控蛋白(两者统称为非结构蛋白)的研究 报道较少，特别是联合应用天然的和经基因优化的HIV-1的所有辅助蛋白、调控蛋白与结构蛋白作为疫苗靶标抗原的效果还鲜为人知，从而直接影响了艾滋病疫 苗的研发。HIV-l调控蛋白和辅助蛋白在病毒生活周期中起重要作用；功能与序 列也较保守，是设计HIV-1疫苗中的新靶标。联合应用这些早期表达的非结构蛋 白与晚期表达的结构蛋白可能更加有效。然而，也有人认为多种抗原基因的联合 可能造成抗原竞争而导致疫苗的免疫原性下降。HIV调节/辅助蛋白的融合蛋白在国际专利W003097675中描述。具体地， WO03097675所述融合蛋白包含Vif、 Vpr、 Vpu、 Rev、 Tat和Nef中的至少四种HIV 蛋白的氨基酸序列或者一种或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物，其中所述融 合蛋白不被加工成单独的具有天然N和C末端的HIV蛋白。三、发明内容本发明涉及一种密码子优化的多核苷酸或其片段或衍生物。本发明还涉及由 该优化的核酸序列或其片段或衍生物所编码的多肽或蛋白质。本发明涉及包含至 少一个HIV基因的复制缺陷型或复制型腺病毒载体疫苗。而该基因包含人源密码 子优化的，并且该基因适当的连在异源启动子后。将本发明的核酸插入所述病毒 基因组的方法和获得重组病毒的方法是本领域熟练技术人员已知的。本发明的另一个方面涉及腺病毒载体疫苗，包括一种复制缺陷型的腺病毒基 因组在腺病毒基因组中没有功能性的E1基因，E3区域可删除或可保留；另一种 是复制型腺病毒基因组在腺病毒基因组中保留了功能性的E1基因，E3区域缺失。 这些腺病毒载体疫苗是五型或二型或其他亚型腺病毒。在复制缺陷型的腺病毒载体中，表达盒嵌入腺病毒基因组的E1区域。在复制 型腺病毒载体中，表达盒插入腺病毒基因组的E3区域。该表达盒包括i)编码HIV调控、辅助和/或结构蛋白的核酸，该核酸是密码子优化，利于 人宿主中表达。选择表达HIV的基因序列应当被优化以适于在人细胞中表达。四个碱基的三 联密码子有64种情况。事实上，某些氨基酸有多达六个冗余的密码子，而其它氨 基酸可能只有一个必须的密码子。由于还不完全了解的原因，在不同类型细胞， 内源性DNA中存在的简并密码子的量不一样多。似乎在某种类型的细胞中对某些 密码子有不同程度的偏好。例如，亮氨酸残基由六种DNA残基CTA、 CTC、 CTG、 CTT、 TTA和TTG编码(它们分别对应于mRNA密码子CUA、 CUC、 CUG、 CUU、 UUA和UUG)。 对微生物基因组密码子频率的广泛深入分析揭示了大肠杆菌内源性DNA通常都含 有CTG亮氨酸特异性密码子，而酵母的DNA通常含有TTA亮氨酸特异性密码子。考 虑到这种偏好性，通常认为在大肠杆菌宿主中获得富含亮氨酸多肽的高水平表达 的可能性将某种程度上依赖于密码子使用的频率。例如，富含TTA密码子的基因 可能在大肠杆菌中表达不高，相似地，当转化酵母细胞时，在插入DNA中优选使用的密码子是TTA。利用重组DNA技术使用优化密码子的意义是很明显的。在成功转化的宿主细 胞中内源基因没能获得高水平表达，可能是由于插入的基因中密码子不太优化， 并且用于表达的宿主细胞可能不能有效工作。利用重组DNA技术根据所选择的宿 主细胞的密码子的偏好性进行基因合成。本发明的一个特征就是含有优化的适于 人细胞中表达的HIV基因的腺病毒载体。HIV结构蛋白gag、 pol和env以及HIV调控和辅助蛋白Vif、 Vpr、 Vpu、 Rev、 Tat、 Vpx和Nef的蛋白序列是本领域熟练技术人员已知的。通过实施例，且不限 于所述的实施方案，可参考geneb肌k数据库公开的各种序列，具体是Genbank登 录号为AY008715 (代表株97CNGX —6F)的HIV—1分离株的序列。在该genbank条 目中，详述了各种HIV1基因的序列和所述基因编码的蛋白的序列。携带HIV基因的腺病毒载体疫苗包含经优化的HIV结构蛋白gag和pol以及HIV 调控蛋白rev、 tat的多核苷酸序列或其片段或衍生物。在此基础上，它还可以包 含经优化的辅助蛋白vif、 vpr、 vpu、 vpx和nef。改造及/或优化的gag、 pol、 nef、 vpu、 vpr、 vif、 rev及tat序列见实施例。gag基因的492个密码子中的320个被改 变(65.0%); pol基因的851个密码子的577个被改变(67.8%); nef基因的207个 密码子中的121个被改变(58.5%); vpu基因的80个密码子中的58个被改变 (72.5%); vpr基因的96个密码子中的57个被改变(59.38%); vif基因的193个密 码子中的118个被改变(61.14%); rev基因的107个密码子中的73个被改变 (68.22%)，并在C末端增加了B亚型一致序列的16个氨基酸；Tat基因的96个密码 子中的55个被改变(57.29%)，并且C末端的5个氨基酸与一致序列不同。i) 一种异源启动子连在编码该融合蛋白的核酸的5'端。ii) 一种转录终止子连在编码该融合蛋白的核酸的3'端。 优选形成所述融合蛋白的HIV蛋白来自同一分化株。根据可选的实施方案，形成融合蛋白的HIV蛋白来自两种或更多种分化株。也可能形成所述融合蛋白的 一种或多种HIV蛋白是HIV-1蛋白或HIV-2蛋白。形成所述融合蛋白的HIV蛋白的氨基酸序列优选是由已知HIV分离株编码的 序列，即所述融合蛋白中HIV蛋白的氨基酸序列和天然存在的HIV分离株编码的相 应蛋白的氨基酸序列相同。可选地，融合蛋白中的一种或多种HIV蛋白的氨基酸 序列可以是共有序列，即已知HIV分离株中不出现，但与多种或所有己知的HIV 分离株显示最佳同源性的序列一特别就CTL表位而言。计算共有序列的计算机算法是本领域熟练技术人员已知的。这种编码HIV全部及/或部分调控、辅助和/或结构蛋白的核酸能够产生有效的 免疫应答，具体是细胞毒性T细胞应答。所述核酸编码的融合蛋白包含Gag、 Pol、 Nef、 Vpu、 Vif、 Vpr、 Rev、 Tat的所有蛋白或者选自其中的几种HIV蛋白的氨基 酸序列或者全部及/或多种所述蛋白的氨基酸序列的衍生物。该融合蛋白可以包 含其它蛋白的氨基酸序列或其一部分，其它蛋白的实例是HIV Env蛋白。Getggag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约55kD的前体蛋白 (p55),然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、 p24、 pl5三个蛋白。p24和pl7 分别参与构成HIV颗粒的内壳和内膜，pl5进一步裂解成与病毒RNA结合的核壳蛋 白p9和p7，辅助逆转录。Polpol基因编码病毒复制所需的酶类，其中p66蛋白为逆转录酶，p32蛋白则为整 合酶。从pol和gag基因重叠区起始的一段序列为pro基因，它编码蛋白酶p22， p22 在裂解上述HIV蛋白前体形成终末成熟蛋白的过程中起着主要作用。NefNef蛋白主要功能是下调CD4、 CD8、 CD28和MHC I 、 MHCII分子，从而使HIV病 毒逃逸免疫应答；增加病毒的感染力和病毒复制；同时nef干扰细胞信号转导通 路，使细胞更易受HIV感染；nef调节HIV感染细胞的胆固醇运输，影响病毒的组 装、出芽和感染。对于病毒复制而言非常重要，通过诱导细胞表面CD4的下调导 致疾病的迸展。因此，具有降低功能的Nef蛋白显示降低的与CD4的相互作用。VpuVpu主要诱导CD4受体降解，增加感染细胞子代病毒的释放。因此，具有降低 活性的Vpu具有降低的激发CD4降解的能力。 VifVif主要破坏AP0BEC3G的抗病毒功能，保证病毒的感染性;vif与gag、病毒蛋 白酶及RNA相互作用，有利于病毒的正确装配和反转录复合体稳定性，增强反转 录酶的活性。因此，具有降低活性的Vif蛋白显示降低的多聚化能力和/或降低的 与核蛋白复合物的结合。VprVpr是一个相当保守的蛋白，主要介导HIV-l前嵌合复合体(pre-integarion complex)进入核内；调节G2/M细胞周期，诱导感染的CD4+T细胞调亡，抑制细胞 和体液免疫反应；反式激活LTR和宿主细胞基因，诱导趋化因子产生。因此，具 有降低活性的Vpr显示降低的反式激活作用或者甚至不能反式激活和/或与病毒前整合复合物反应。 RevRev主要参与经l次剪接或未剪接病毒mRNA从胞核到胞质的转运，从而使后续 的结构蛋白得以表达；而且rev增加病毒mRNA的稳定性和加快mRNA的翻译。因此， 具有降低活性的Rev显示与RRE降低的相互作用。TatTat蛋白的主要功能是增加mRNA转录的起始和延伸效率。在HIV感染急性期产 生的高浓度胞外tat起着病毒毒素的作用，诱导产生免疫抑制及T细胞调亡。最近 研究表明tat抑制Dicer酶的活性从而抑制siRNA的形成及功能。因此，具有降低 活性的Tat蛋白显示降低的通过TAR元件来反式激活启动子。在构建本发明的腺病毒载体时，将目的基因插入到质粒或者穿梭载体通常是便利的。病毒载体可以在不同的E1互补细胞系包括293细胞系和PER. C6中扩增。 这两种细胞系都表达腺病毒E1基因产物。293细胞系在Graham et al 1977 J. Gen. Virol 36:59-72已有描述。在优选的实施例中，El基因从腺病毒载体缺失。HIV表达盒替代缺失的E1基 因。在另一个优选的实施例中，复制缺陷型腺病毒基因组没有功能性的E1基因， 并且优选地，E3基因被缺失了。优选所述病毒载体，尤其是腺病毒载体的病毒基因组中除了包含本发明的融 合蛋白的编码序列以外，还可以包含HIVErw基因。如上述，融合蛋白中HIV蛋白 的顺序可以改变，除Ad5—n3vrt印外，还包括Ad5-gpn3vrt等等。根据实施方案， 所有HIV基因可位于该病毒基因组的相同插入位点。在可选的实施方案中，所述 其它基因被插入该病毒基因组的不同位点上。在优选的实施方案中，本发明涉及 将本发明的核酸、载体或融合蛋白用作至少部分预防HIV感染和AIDS的疫苗。四
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。 图l是融合基因的示意图。图2是融合基因n3vrtgp插入腺病毒基因组的策略。 图3是pAd5-gp腺病毒载体质粒的构建过程。 图4表达的Western Blot分析1、 Ad5-厶E1AE3感染293细胞2、 Pre-stained protein ladder3、 Ad5-gag感染293细胞4、 Ad5-gagpol感染293细胞5、 Ad5-n3vrt感染293细胞。图5腺病毒HIV疫苗gag多肽elispot刺激结果。五具体实施方式
HIV基因组的单基因可通过合成技术制备。GC含量平均为60X，各段分布在 52%-73%之间。其中实施例lHIV1 gag疫苗序列1、 08BC gag共有序列来自lanl，序列为MGARAS I LRGGKL丽EK I RLRPGGKKHYMLKHL爾SRELERFALNPGLLETSEGCKQIIKQLQPALQTGTEELRSLF NTVATLYCVHAEIEVRDTKEALDKIEEEQNKIQQKTQQAKEADEKVSQNYPIVQNLQGQMVHQPLSPRTLNAWVKVVEE KAFSPEVIPMFTALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKDTINEEMEWDRLHPVHAGPVAPGQMREPRGSDIAGTT STLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIKQGPKEPFRDYVDRFFKTLRAEQATQDVK匪TD TLLVQNANPDCKTILRALGPGASLEEMMTACQGVGGPSHKARVLAEAMSQTNNTILMQRSNFKGSKRIVKCFNCGKEGH IAKNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRPEPTAPPAESFRFEETTPAPKQEPKDR EPLTSLRSLFGSDPLSQ2、以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) gag序列。atgggcgccagggcctccatcctgaggggcggcaagctggacaagtgggagaagatcaggctgaggcctggcggcaagaagcactacatgctgaagcatctggtctgggcctccagggagctggagaggtttgccctgaaccctggcctgctggagacctctgagggctgcaagcagatcatcaagcagctgcagcctgccctgcagacaggcacagaggagctgaggtccctgttcaacacagtggccaccctgtactgtgtgcatgctgagattgaggtgagggacaccaaggaggccctggacaagattgaggaggagcagaacaagatccagcagaagacccagc鄉ccaaggaggctgatgagaaggtctcccagaactaccccattgtgcagaacctgcagggccagatggtgcatcagcccctgtcccccaggaccctgaatgcctgggtgaaggtggtggaggagaaggccttctcccctgaggtgatccccatgttcacagccctgtctgagggcgccaccccccaggacctgaacaccatgctgaacacagtgggcggccatcaggctgccatgcagatgctgaaggacaccatcaatgaggaggctgctgagtgggacaggctgcatcctgtgcatgctggccctgtggcccctggccagatgagggagcccaggggctctgacattgctggcaccacctccaccctgcaggagcagattggctggatgaccaacaaccctcccatccctgtgggcgagatctacaagaggtggatcatcctgggcctgaacaagattgtgaggatgtactcccccacctccatcctggacatcaagcagggccccaaggagccattcagggactatgtggacaggttcttcaagaccctgagggctgagcaggccacccaggatgtgaagaactggatgacagacaccctgctggtgcagaatgccaaccctgactgcaagaccatcctgagggccctgggccctggcgcctccctggaggagatgatgacagcctgccagggcgtgggcggcccatcccacaaggccagggtgctggctgaggccatgtcccagaccaacaacaccatcctgatgcagaggtccaacttcaagggctccaagaggattgtgaagtgcttcaactgtggcaaggagggccacattgccaagaactgcagggcccccaggaagaagggctgctggaagtgtggcaaggagggccatcagatgaaggactgcacagagaggcaggccaacttcctgggcaagatctggccatcccacaagggcaggcctggcaacttcctgcagtccaggcctgagcccacagccccccctgctgagtccttcaggtttgaggagaccacccctgcccccaagcaggagcccaaggacagggagcccctgacctccctgaggtccctgtttggctctgaccccctgtcccagtaaa实施例2HIV1 pol疫苗序列1、 08BC pol共有序列来自lanl，序列为FFREILAFPQGEAREFPPEQT画SPTSRELQVRG酵SSEAGTERQGTLNFPQITLWQRPLVSI KVGGQIKEALLDTGADDTVLEEVNLPGKWKPKMIGGIGGFIKVRQYEQIPIEICGKKAIGTVLVGPTPV NIIGRNMLTQLGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALTAICDEMEKEGKITKIGP DNPYNTPIFAIRKKDSSKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLD KDFRKYTAFTIPSVNNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVG SDLEIGQHRTKIEELREHLLKWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIQLPEKDSWTVNDIQK LVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGAKALTDIVPLTEEAELELAENREILKEPVHGAYYDPSKELIAE IQKQGQDQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAKMRTAHTNDVKQLTEAVQKIAMESIVIWGKIPKFRLPIQKET WETWWTDYWQATWIPEWEFVNTPPLVKLWYQLEKDPIAGVETFYVDGAANRETKIGKAGYVTDRGRKKI VSLTDTTNQKTELQAIYIALQDSGSEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQLIKKERVYLSW VPAHKGIGGNEQVDKLVSNGIRKVLFLDGIDKAQEEHEKYHSNWRAMASDFNLPPIVAKEIVASCDQCQ LKGEAMHGQVDCSPGIWQLDCTHLEGKIILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFILKLAGRWPVKVI HTDNGSNFTSAAVKAACWWAGIQQEFGIPYNPQSQGVVESMNKELKKLIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFI HNFKRKGGIGGYSAGERIVDIIATDIQTRELQKQIIKIQNFRVYYRDSRDPIWKGPAKLLWKGEGAVVI QDNSDIKVVPRRKAKIIKDYGKQMAGADCVAGRQDED2、 改造步骤为缺失N端151个aa ，并在N端加了M A两个aa。这样得到的08—BC pol不具有蛋白酶的活性。并在08—BCpol上做下表9个突变。这样突变后的08一BC pol不具有反转录酶、RNA酶、整合酶的活性。aa residue,t-顿aaenzvmc functionAsp112A!aRTAsp187A!aRTAsp188A!aRTAsp445AJaRNaseHGlu480AlaRNaseHAsp500AlaAsp626AlaIN八sp678AlaINC'u714AlaIN3、以下为完整的改造后的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) pol序列。Atggcccccatctcccccattgagacagtgcctgtgaagctgaagcctggcatggatggccccaaggtgaagcagtggcccctgacagaggagaagatcaaggccctgacagccatctgtgatgagatggagaaggagggcaagatcaccaagattggccctgacaacccatacaacacccccatctttgccatcaggaagaaggactcctccaagtggaggaagctggtggacttcagggagctgaacaagaggacccaggacttctgggaggtgcagct鹏catcccccatcctgctggcctgaagaagaagaagtctgtgacagtgctggctgt鹏cgatgcctacttctctgtgcccctggacaaggacttcaggaagtacacagccttcaccatcccctctgtgaacaatgagacccctggcatcaggtaccagtacaatgtgctgccccagggctggaagggctcccctgccatcttccagtgctccatgaccaagatcctggagccattcaggaagcagaaccctgacattgtgatctaccagtacatggctgccctgtatgtgggctctgacctggagattggccagcacaggaccaagattgaggagctgagggagcatctgctgaagtggggcttcaccacccctgacaagaagcatcagaaggagcccccattcctgtggatgggctatgagctgcatcctgacaagtggacagtgcagcccatccagctgcctgagaaggactcctggacagtgaatgacatccagaagctggtgggcaagctgaactgggcctcccagatctaccctggcatcaaagtgaggcagctgtgcaagctgctgaggggcgccaaggccctgacagacattgtgcccctgacagaggaggctgagctggagctggctgagaacagggagatcctgaaggagcctgtgcatggcgcctactatgacccatccaaggagctgattgctgagatccagaagcagggccaggaccagtggacctaccagatctaccaggagccattcaagaacctgaagacaggcaagtatgccaagatgaggacagcccacaccaatgatgtgaagcagctgacagaggctgtgcagaagattgccatggagtccattgtgatctggggcaagatccccaagttcaggctgcccatccagaaggagacctgggagacctggtggacagactactggcaggccacctggatacctgagtgggagtttgtgaacaccccccccctggtgaagctgtggtaccagctggagaaggaccccattgctggcgtggagaccttctatgtggctggcgctgccaacagggagaccaagattggcaaggctggctatgtgacagacaggggcaggaagaagattgtctccctgacagacaccaccaaccagaagacagccctgcaggccatctacattgccctgcaggactctggctctgaggtgaacattgtgacagcctcccagtatgccctgggcatcatccaggcccagcctgacaagtctgagtctgagctggtgaaccagatcattgagcagctgatcaagaaggagagggtctacctgtcctgggtgcctgcccacaagggcattggcggcaatgagcaggtggacaagctggtctccaatggcatcaggaaggtgctgttcctggatggcattgacaaggcccaggaggagcatgagaagtaccactccaactggagggccatggcctctgacttcaacctgccccccattgtggccaaggagattgtggcctcctgtgaccagtgccagctgaagggcgaggccstgcatggccaggtggactgctcccctggcatctggcagctggcctgcacccatctggagggcaagatcatcctggtggctgtgcatgtggcctctggctacattgaggctgaggtgatccctgctgagacaggccaggagacagcctacttcatcctgaagctggctggcaggtggcctgtgaaggtgatccacacagccaatggctccaacttcacctctgctgctgtgaaggctgcctgctggtgggctggcatccagcaggagtttggcatcccatacaacccccagtcccagggcgtggtggcctccatgaacaaggagctgaagaagctgattggccaagtgagggaccaggctgagcatctgaagacagctgtgcagatggctgtcttcatccacaacttcaagaggaagggcggcattggcggctactctgctggcgagaggattgtggacatcattgccacagacatccagaccagggagctgcagaagcagatcatcaagatccagaacttcagggtctactacagggactcc agggaccccatctggaagggccctgccaagctgctgtggaagggcgagggcgctgtggtgatccaggacaactctgacatcaaggtggtg cccaggaggaaggccaagatcatcaaggactatggcaagcagatggctggcgctgactgtgtggctggcaggcaggatgaggactaaa实施例3HIV1 nef疫苗序列1、 08BC nef共有序列来自lanl，序列为 MGGKWSKSSIVGWPAIRERIRRTEPAADGVGAVSRDLEKHGAITSSNTADTNADCAWLETQEEEEVGFPVRPQVPLRPMTFKGALDLSFFLKEKGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQ GYFPDWHNYTPGPGVRFPLTFGWCFKLVPVDPREVEEANEGEDNCLLHPVCQHGMEDEH REVLKWKFDSQLAHRHRARELHPEFYKDC2、 改造步骤为Nef发挥大多数功能需要肉豆蔻基化位点(第2位氨基酸甘氨 酸G2，第164和165位的亮氨酸Leu-164-Leu-165)，将这三个位点都突变为丙 氨酸，Nef功能上是失活的。3、 以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) nef序列。Atggctggcaagtggtccaagtcctccattgtgggctggcctgccatcagggagaggatcaggaggacagagcctgctgctgatggcgtgggcgctgtctccagggacctggagaagcatggcgccatcacctcctccaacacagctgacaccaatgctgactgtgcctggctggagacccaggaggaggaggaggtgggcttccctgtgaggccccaggtgcccctgaggcccatgaccttcaagggcgccctggacctgtccttcttcctgaaggagaagggcggcctggagggcctgatctactccaagaagaggcaggagatcctggacctgtgggtctaccacacccagggctacttccctgactggcacaactacacccctggccctggcgtgaggttccccctgacctttggctggtgcttcaagctggtgcctgtggaccccagggaggtggaggaggccaatgagggcgaggacaactgtgctgcccatcctgtctgccagcatggcatggaggatgagcacagggaggtgctgaagtggaagtttgactccc缚ctggcccacaggcacagggccagggagctgcatcctgagttctacaaggactgctaaa实施例4HIV1 vpu疫苗序列1、 08BC vpu共有序列来自lanl，序列为 MLDLELAVGALIVALIIAIVVWTIVYIEYRRLVKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESEGDTEELSTMVDMGRLRLLDVNDL2、 以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) vpu序列 Atgctggacctggagctggctgtgggcgccctgattgtggccctgatcattgccattgtggtctggaccattgtctacattgagtacaggaggc tggtgaagcagaggaagattgactggctgatcaagaggatcagggaga鹏ctgaggactctggcaatgagtctgagggcgacacagag gagctgtccaccatggtggacatgggcaggctgaggctgctggatgtgaatgacctgtaaa实施例5HIV1 vif疫苗序列1、 08BCvif共有序列来自lanl，序列为 MENRWQVLIVW()VDRMKIRTWNSLVKHHMYVSRRANGWFYRHHYDSRHPKVSSEFADSAIRKAILGHVVIPRCDYQAGHNNKVGSLQYLALTALIKPKRIKPPLPSIKKLVEDR^ NPQKIRGRRGNHT副GH2、 以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) vif序列 Atggagaacaggtggcaggtgctgattgtctggcaggtggacaggatgaagatcaggacctggaactccctggtgaagcatcacatgtatgtctccaggagggccaatggctggttctacaggcatcactatgactccaggcatcccaaggtctcctctgaggtgcacatccccctgggcgaggccaggctggtgatcaagacctactggggcctgcagacaggcgagagggactggcatct鹏ccatggcgcctccattgagtggaggctgaggtcctacaacacccagattgagcctggcctggctgaccagctgatccacatgtactactttgactgctttgctgactctgccatcaggaaggccatcctgggccatgtggtgatccccaggtgtgactaccaggctggccacaacaacaaggtgggctccctgcagtacctggccctgacagccctgatcaagcccaagaggatcaagccccccctgccatccatcaagaagctggtggaggacaggtggaacaacccccagaagatcaggggcaggaggggcaaccacaccatgaatggccactaaa实施例6HIVI vpr疫苗序列1、 08BCvpr共有序列来自lanl，序列为 MEQPPEDQGPQREPYNEWTLELLEELKQEAVRHFPRPWLHGLGQYVYETYGDTWTGVETIIRILQQLLFIHFRIGCQHSRIGIVRQRRARNGASRS2、 以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) vpr序列 Atggagcagccccctgaggaccagggcccccagagggagccatacaatgagtggaccctggagctgctggaggagctgaagcaggag gctgtgaggcacttccccaggccatggctgcatggcctgggccagtatgtctatgagacctatggcgacacctggacaggcgtggagaccat catcaggattctgcagcagctgctgttcatccactttaggattggctgccagcactccaggattggcattgtgaggcagaggagggccaggaa tggcgcctccaggtcttaaa实施例7HIV1 rev疫苗序列1、 08BC rev共有序列自己比对(下述四个病毒株基因组中Rev序歹iJ)得到，但在 N端补上B型consensus的相应序列QILVESPAVLESGTKE,序列为MAGRSGDSDEALLRAVRIIKILYQSNPYPEPRGTRQARKNRRRRWRARQNQIHSISER ILSTCLGRPTEPVPLQLPPLERLHITDSERGGTSGTQQPQGTTEGVGSPQILVESPAVLESGT KEAccession Number Strain NameAF286229 98CN006AY008715 97CNGX—6FAY008716 97CNGX—7FAY008717 97CNGX 9F2、以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) rev序列Atggctggcaggtctggcgactctgatgaggccctgctgagggctgtgaggatcatcaagatcctgtaccagtccaacccataccctgagcccaggggcaccaggcaggccaggaagaacaggaggaggaggtggagggccaggcagaaccagatccactccatctctgagaggattctgtccacctgcctgggcaggcccacagagcctgtgcccctgcagctgccccccctggagaggctgcacatcacagactctgagaggggcggcacctctggcacccagcagccccagggcaccacagagggcgtgggctccccccagatcctggtggagtcccctgctgtgctggagtctggcaccaaggagtaaa实施例8HIV1 tat疫苗序列1、 08BCtat共有序列自己比对(下述四个病毒株基因组中Rev序列)得到Accession NumberAF286229AY008715AY008716AY008717Strain Name 98CN006 97CNGX—6F 97CNGX—7F 97CNGX 9F说明书第10/15页MEPVDPNLEPWNHPGSQPETACNNCYCKRCSYHCLVCFQKKGLG1SYGRKKRRQRR SAPQSSEDHQNLISKQSLPRTQGDQAGSEESKKKVESKTKPDPFDTat基因是使用含有终止密码子的寡核苷酸合成的，该基因将被插入编码本 发明的融合蛋白的核酸的最后的位置，并因此应当含有正确终止多聚蛋白的翻译 的终止三联密码、2、以下为完整的含有优化密码子的HIV1 (CRF08BC) tat序列Atggagcctgtggaccccaacctggagccatggaaccatcctggctcccagcctgagacagcctgcaacaactgctactgcaagaggtgctcctaccactgcctggtctgcttccagaagaagggcctgggcatctcctatggc鄉aagaagaggaggcagaggaggtctgccccccagtcctctgaggaccatcagaacctgatctccaagcagtccctgcccaggacccagggcgaccaggctggctctgaggagtccaagaagaaggtggagtccaagaccaagcctgacccatttgactaaa实施例9融合蛋白DNA的获得:编码HIV Optn3vrtgp融合蛋白的DNA的生成。 合成 3vrt 基因。合成 nef上游引物 ， 5-GCAAGCTTATGGCTGGCAAGTGGTCCAAGTC-3 ， nef 下游引物， 5-TGGGATCCGCAGTCCTTGTAGAACTCAGG-3。扩增出的nef基因在5'端和3， 端分别带上了 Hind III与BamH I位点，同时去掉TAA终止密码子，再与Hind III 及BamH I双酶切后的pGAl-3vrt连接即得到pGAl- n3vrt。 pGAl- n3vrt与pAd5 重组即得到pAd5-n3vrt。重组步骤如下用SgrAl和BstZ171限制性内切酶酶切 带有pGAl- n3vrt穿梭质粒载体，Clal线性化El/E3基因缺失的pAd5质粒载体， 酶切产物共转化A/5/W感受态细胞。挑取单克隆酶切和PCR鉴定，将阳性克隆 转化sure感受态细胞进一步鉴定。得到鉴定正确的pAd5-n3vrt腺病毒载体质粒。 pAd5-gp腺病毒载体质粒的构建过程见图3。Ad5-gp与Ad5-n3vrt。这两个病毒均已拯救出来，并WB验证过无误。 Western Blot检测将成功构建的pAd5-n3vrt及pAd5-gp感染HEK293细胞，24小时后弃去培养上清，用PBS洗两遍细胞，加SDS-PAGE上样缓冲液，水浴煮10分钟，用Western blot检测蛋白表达。如图4所示，Ad5-gag感染293细胞后为可见55kD的明显条带。Ad5-gagpol感染293细胞后在145kD处可见到明显条带。Ad5-n3vrt感染293细胞后检测出一条80kd的条带。实施例IO携带优化过的08BC n3vrtgp 5型腺病毒的获得、扩增及纯化用引物扩增出n3vrt片段(两端分别带上了 Hind III位点，同时去掉TAA终 止密码子，与pGAl-gp连接即得到pGAl-n3vrtgp。 pGAl-n3vrtgp与pAd5重组 即得到pAd5-n3vrtgp。重组步骤如上所述。见图2。将鉴定正确的重组腺病毒载体质粒用？acl线性化，利用Lipofectamine 2000 转染Trex293细胞，转染前一天铺Trex293至6孔细胞培养板中，每孔2X105，次日 晨待细胞达70%左右汇集度进行转染。转染后8-10天内出现病毒斑。10-15天细胞 开始出现明显的CPE现象，将细胞连同培养基一起收集，冻融三次后低速离心去 除细胞碎片。取部分上清冻存于超低温冰箱。部分上清继续感染细胞得到第二代 病毒，提取病毒DNA进行酶切和PCR鉴定，确保拯救的重组腺病毒正确无误。用Trex293细胞大量扩增重组腺病毒，CsCl密度梯度离心纯化两次。以10mM Tris (pH8.0)， 2mMMgC12， 5%蔗糖缓冲液透析病毒。应用TCIDso法检测纯化 后重组腺病毒的滴度。实施例ll 腺病毒HIV疫苗免疫原性的验证每组4只2—4kg恒河猴，雌雄各半(检测证实SRV、 STLV和SIV阴性)。用胰 岛素注射器(BD),分别在猴子两侧三角肌进行单点肌肉注射。每侧注射0.51111(病 毒用PBS稀释至浓度为10Allvp/ml); 20060830第一次免疫，20061213初免后15 周加强免疫。每次免疫后按照4周间隔静脉釆血，分离PBMCs，用ELISPOT和ICS 检测细胞免疫应答。以gag多肽刺激为例，结果如图5所示，初次免疫后，能够激 发较强的抗原特异性的T细胞应答。加强免疫后，Ad2亚型腺病毒载体能够克服 初免激发的针对Ad5的中和抗体。PBMC分离按实际所需用量配制好95X的Opti-prep(达科为，AS1114542); 全血与95X的Opti-prep比例为8: 1，如用8ml全血，则需lml 95X的Opti-prep， 用无菌水稀释好95X的Opti-prep;颠倒混匀全血，准确混匀8ml全血与lml 95% 的Opti- prep，上下颠倒数次以充分混匀，之后沿壁轻轻地在上层液面加入lml RO;水平转子800g-1000g， 20°C，离心30min;吸取淋巴细胞层，用R0重悬(R0 体积以能填满15ml离心管为准)，水平转子250g， 20°C，离心8min;弃上清， 再用10mlR0重悬(R0体积以能填满15ml离心管为准)，水平转子250g， 20'C， 离心8min;弃上清，用2mlR10重悬，计数。Elispot检测取一管抗猴Y干扰素的多克隆抗体用无菌PBS(PH7，2-7.4)1:100 稀释，100ul/孔，4'C包被过夜。甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200ul R10完全培养基，37。C封闭2小时。封闭期间分离PBMC。釆用95M稀释的opti-pep 分离淋巴细胞。弃去封闭液，每孔加入100ulPBMC。实验中设阳性对照组(ConA 组)，刺激多肽组(gag等肽库)，DMSO对照。在37'C 5XC02培养箱中孵育。 24h后，弃去细胞悬液，用无菌raST220ul/well洗涤6次。甩去洗液，在无菌干燥 纸上扣干。用含5XFBS的PBST按1:400稀释检测抗体生物素标记的抗猴Y干扰素 的多克隆抗体，100ul/wdl， 4。C过夜。用无菌PBST 220ul/well洗涤4次。甩去洗 液，在无菌千燥纸上扣干。配置链霉素偶联的碱性磷酸酶用含5XFBS的PBST 按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶(BD PharMingen， Cat#554065)， lOOul/well, 37°C, 2小时。处理BCIP/NBT底物(Pierce, Cat. #34042) ，37。C温浴 30min。用无菌PBST220ul/well洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。加入 BCIP/NBT底物，100ul/wel1，避光反应7分钟。弃去底物，用水洗涤2次。风干读 板。携带HIV基因的腺病毒载体疫苗<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院 〈120>携带HIV基因的腺病毒载体疫苗<160> 8<170> FastSEQ for Windows DEMONSTRATION Version 4. 0<210> 1 <211> 1477 <212> ■ <213>人工序列<400> 1atgggcgccagggcctccatCCtg8ggggCggc卿ctgg8C卿tggg3gaagatcagg60ctgaggcctggcggcaagaagcactacatgctgaagcatctggtctgggcctccagggag120ctgg柳ggtttgccctg肌ccctggcctgctggagacctctg鄉gctgcaagcagatc180atcaagcagctgcagcctgccctgcagacaggcacagaggagctgaggtccctgttcaac240acagtggccaccctgtactgtgtgcatgctg卿Ug郷tg3gggeiC3Ccaaggaggcc300ctggscaagattgaggaggagcagaacaag3tcc3gc3gaagacccagcaggCC3￡Lgg￡tg360gctgatgagaaggtctcccetgaactaccccattgtgcagaacc^gc3gggccagatggtg420catcagcccctgtcccccaggaccctgaatgcctgggtga郷tggtgg3gg卿aggcc■ttctcccctgaggtgatccccatgttcacagccctgtctg郷gcg固ccccccaggac540ctgaacaccatgctgaacac兆tgggcggccatcaggctgccatgcagatgctgaaggac600兆g郷ctgctgeigtgggacaggctgcatcctgtgcatgctggccctgtg660gcccctggcc卿tgagggagccc鄉ggctCtg￡lC3ttgctggcaccacctccaccctg720caggagcagattggctggstg3CC幼C肌Ccctcccatccctgtgggcgsgatctacaag780柳tgg8tC3tcctgggcctgaacaagattgtgaggstgt3CtCCCCC3Cctccatcctg840gacatcaagcagggcccc幼ggagccattc3ggg￡tCt￡ltgtgg3caggttcttcaagacc900ctgsgggctgagcaggccacccaggatgtgaagaactggacctgctggtg960cagaatgccaaccctgactgcaagaccatcctgagggccctgggccctggcgcctccctg1020gaggagatgatgacagcctgccagggcgtgggcggcccatcccaca鄉ccagggtgctg画gCtg鄉CC8tgtcccagacatcctgatgcagaggtccaacttcaagggc1140tccaagagg8ttgtg卿tgcttcaactgtggc卿gagggccacattgccaag犯ctgc1200agggcccccagg犯g卿ggctgctgg卿tgtggcaaggg3tg幼gg3C1260tgcacagagaggc郷ccttcctgggc肌gatctggcgggc鄉cct1320ggc肌cttcctgcagtccaggcctgagcccscagccccccctgctgagtccttcaggttt1380cccctgccccc卿caggaggggagcccctgacctccctg1440aggtccctgtttggctctgaccccctgtcccagtaaa1477〈210〉 2 <211> 2554 <212> DNA<213>人工序列〈400> 2atggcccccatctcccccattg卿C3gtgcctgtg卿ctgaagcctggcatggatggc60CCC犯ggtg3agcagtggccCCtg3C6Lg3gg8g幼g3tcaaggccctgacagccatctgt120gatg卿tggcaagatcaccaag8ttggccctgacaaccc180cccatctttgccatcaggaagaaggactcctccaagtggaggaagctggtgg3CttC鄉240gagctgaac8agaggacccaggacttctggg鄉tgc柳tgggcatcccccatcctgct300ggcctg,aag肌g8agtctgtgacagtgctggctgtgggcgatgcctacttctctgtg360cccctggacaeiggax;ttc3ggccttcaccatcccctctgtgaac￡iatg￡Lg420acccctggcatcaggtaccagt3C33tgtgctgccccagggctgg肌gggctcccctgcc480atcttccagtgctccatgacc犯gatcctggagccattcagg犯gcagaaccctgacatt540gtgatctaccagtacatggctgccctgtatgtgggctctg3cctggeig3ttggCC3gC3C600aggacc犯gattgaggagctgagggagcatctgctg幼gtggggCttC3Ccacccctgac660aag肌gcatcftg犯ggagcccccattcctgtggatgggctatgagctgcatcctgacaag720tgg6lC3gtgCagcccatccagctgcctgag肌ggactcctgg腦gtg犯tgacatccag780肌gctggtgggcaagctgaactgggcctcccagatctaccctggcatcaa3gtg鄉C8g840ctgtgcaagctgctg鄉ggcgcc犯ggccctgacagacattgtgcccctgacagaggag900gctg鄉tggagctggctgagaacagggagatcctgaaggagcctgtgcatggcgcctac960tatgacccatccaaggagctgattgctgagatccagaagcagggccaggaCC3gtgg3CC翻taccagatctaccEiggsgccattcaagaacctgaagacaggcaagt￡itgcc肌geitg3gg1080acagcccacgiccaatgatgtg卿c鄉tg3C卿ggCtgtgcagaagattgCC3tgg3g1140tccattgtgatctggggcaagatccccaagttcaggctgcccatccagaaggagacctgg1200g卿cctggtggacagactactggcaggcc3CCtgg3t3Cctgagtgggagtttgtgaac12603CCCCCCCCCtggtg卿ctgtggtaccagctgg卿aggaccccattgctggcgtggag1320accttctatgtggctggcgctgccaacaggg3gaccaagattggcaaggctggctotgtg1380ac柳caggggC3gga卿agattgtctccg肌gacagcc1440ctgcaggccatctacattgccctgcaggactctggctctgaggtgaacattgtg3C3gCC1500tcccagtatgccctgggcatcatccaggcccagcctgacaagtctgagtctgsgctggtg1560aaccagatcattgagcagctgatcaagaagg卿gggtctacctgtcctgggtgcctgcc1620C3C肌gggcattggcggc犯tgagcaggtggacaagctggtctccaatggcatcaggaag1680gtgctgttcctggatggcattg3C犯ggCCC3gg3gg3gCCC3CtCC幼C1740tggagggccatggcctctgscttcaacctgccccccattgtggccaaggagattgtggcc1800tcctgtgaccagtgccagctg卿ggcgsggccatgcatggcceiggtggeictgctcccct1860ggcatctggcagctggcctgcacccatctggagggcaagatcatcctggtggctgtgcat1920gtggcctctggctacattgaggctgaggtgatccctgctg3gacaggcc3ggagacagcc1980tacttcatcctg卿ctggctggc郷tggcctgtg鄉gtgatccacacagccaatggc2040tccaacttcacctctgctgctgtg,gctgcctgctggtgggctggcatccagcaggag2100tttggcatcccatac肌cccccagtcccagggcgtggtggcctccatgaac犯gg柳tg2160ttggccaagtgagggaccaggctgagcatctgaagacagctgtgcgigatg2220gctgtcttcatccacaacttcaagaggaagggcggcattggcggcteictctgctggcgag2280aggattgtggacatcattgccacag3catcc鄉ccagggagctgcagaagcagatcatc2340acttcagggtctactacaggg3CtCC3gggaccccatctgg卿ggccct2400gccaagctgctgtggaagggcgagggcgctgtggtgatcctg8C3tC8lElg2460gtggtgcccaggaggaaggccaagatcatc犯ggactatg gc肌gca^tggctggcgct2520gactgtgtggctggcaggcaggatgaggac2554<210〉 3<211> 373〈212〉 DNA<213>人工序列〈400〉 33tggCtggC3ggtctggcgactctgatgaggccctgctgagggCtgtgflggatcatcaag60atcctgtaccagtccaacccataccctgagccc兆gggcaCC鄉C8ggCcaggaagaac120ggtggagggccaggcagaeiccagatccactccatctctgagaggattctg180tccacctgcctgggc鄉cccacagagcctgtgcccctgcagctgccccccctgg柳gg240ctgcacatcacagactctgagaggggcggcacctctggcacccagcagccccagggcacc300acagagggcgtgggctccccccagatcctggtggagtcccctgctgtgctggagtctggc360acc肌ggsgt幼8373〈210〉 4〈211〉 307〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 43tgg3gCCtgtggaccccaacctggagccatggaaccatcctggctccca gcctgagaca60gcctgcaaca￡LCtgCt￡lCtgca卿ggtgctcctaccactgcctggtctg cttccagaag120肌gggcctgggcatctcctatggcagg卿3柳ggaggc鄉ggaggtctgccccccag180tcctctgaggaccatcagaacctgatctcc肌gcagtccctgcccaggacCC3gggCg3C240caggctggctctgaggeigtcc幼gaag幼gtgacccattt300gactaaa307〈210〉 5<211> 583〈212>醒<213>人工序列〈400〉 5ggtggc郷tgCtggLttgtCtggc鄉tggacaggatgaagatcaggacc60tggaactccctggtg犯gC3tC3C3tgtatgtctccagga gggcc组gg ctggttctac120￡LggC3tC3Ctatgactccaggcatccc幼g gtctcctctg aggtgcacatccccctgggc180gaggccetggctggtgatc犯gacctactgg ggcctgc卿c鄉cg,gggactggcat240ctgggccatggcgcctccattgagtggagg ctgaggtcctacaac3CCC8gattgagcct300ggcctggctgaccagctgatccacatgtactactttgactgctttgctga ctctgccatc3603gg犯ggCCELtcctgggccatgtggtgatccccaggtgtgactaccaggctggccacaac420犯c卿gtgggctccctgcagtacctggccctgacagccctgatcaagccC幼g3gg3tC480<formula>formula see original document page 20</formula>
权利要求
1. 一种携带HIV基因的腺病毒载体疫苗，它包含经优化的HIV结构蛋白gag和pol以及HIV调控蛋白rev、tat的多核苷酸序列或其片段或衍生物，相关核苷酸序列如下含有优化密码子的HIV1gag序列atgggcgcca gggcctccat cctgaggggc ggcaagctgg acaagtggga gaagatcagg 60ctgaggcctg gcggcaagaa gcactacatg ctgaagcatc tggtctgggc ctccagggag 120ctggagaggt ttgccctgaa ccctggcctg ctggagacct ctgagggctg caagcagatc 180atcaagcagc tgcagcctgc cctgcagaca ggcacagagg agctgaggtc cctgttcaac 240acagtggcca ccctgtactg tgtgcatgct gagattgagg tgagggacac caaggaggcc 300ctggacaaga ttgaggagga gcagaacaag atccagcaga agacccagca ggccaaggag 360gctgatgaga aggtctccca gaactacccc attgtgcaga acctgcaggg ccagatggtg 420catcagcccc tgtcccccag gaccctgaat gcctgggtga aggtggtgga ggagaaggcc 480ttctcccctg aggtgatccc catgttcaca gccctgtctg agggcgccac cccccaggac 540ctgaacacca tgctgaacac agtgggcggc catcaggctg ccatgcagat gctgaaggac 600accatcaatg aggaggctgc tgagtgggac aggctgcatc ctgtgcatgc tggccctgtg 660gcccctggcc agatgaggga gcccaggggc tctgacattg ctggcaccac ctccaccctg 720caggagcaga ttggctggat gaccaacaac cctcccatcc ctgtgggcga gatctacaag 780aggtggatca tcctgggcct gaacaagatt gtgaggatgt actcccccac ctccatcctg 840gacatcaagc agggccccaa ggagccattc agggactatg tggacaggtt cttcaagacc 900ctgagggctg agcaggccac ccaggatgtg aagaactgga tgacagacac cctgctggtg 960cagaatgcca accctgactg caagaccatc ctgagggccc tgggccctgg cgcctccctg1020gaggagatga tgacagcctg ccagggcgtg ggcggcccat cccacaaggc cagggtgctg1080gctgaggcca tgtcccagac caacaacacc atcctgatgc agaggtccaa cttcaagggc1140tccaagagga ttgtgaagtg cttcaactgt ggcaaggagg gccacattgc caagaactgc1200agggccccca ggaagaaggg ctgctggaag tgtggcaagg agggccatca gatgaaggac1260tgcacagaga ggcaggccaa cttcctgggc aagatctggc catcccacaa gggcaggcct1320ggcaacttcc tgcagtccag gcctgagccc acagcccccc ctgctgagtc cttcaggttt1380gaggagacca cccctgcccc caagcaggag cccaaggaca gggagcccct gacctccctg1440aggtccctgt ttggctctga ccccctgtcc cagtaaa 1477；含有优化密码子的HIV1pol序列atggccccca tctcccccat tgagacagtg cctgtgaagc tgaagcctgg catggatggc 60cccaaggtga agcagtggcc cctgacagag gagaagatca aggccctgac agccatctgt 120gatgagatgg agaaggaggg caagatcacc 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2、 根据权利要求l所述疫苗，其特征在于它还包含经优化的辅助蛋 白vif、 vpr、 vpu和nef，相关核苷酸序列如下含有优化密码子的HIVlvif序列:atggag肌caggtggc柳tgctgattgtctggC8ggtggg3tC3gg3CC60tggaactccctggtg卿C3tcacatgtatgtctccaggagggccaatggctggttctac1208ggC3tC8Ct3tg3CtCC3ggcatcccaaggtctcctctgaggtgcacatccccctgggc180gaggccaggctggtg3tc肌gacctactggggcctgc卿caggcg卿ggg3CtggC3t240CtgggCC3tggcgcctccattgagtgg鄉ctgaggtcctgattgagcct300ggcctggctgaccagctgatccacatgtactactttgactgctttgctgactctgccatc360agg犯ggccatcctgggccatgtggtgatccccaggtgtgactaccaggctggccacaac420咖肌ggtgggctccctgcagtacctggccctgacagccctgatcaagcccaagaggatc480幼gccccccctgccatccatcaagaagctggtggeigg織ggtgga織acccccagaag540atcaggggcaggaggggc犯ccacaccatgaatggccact583;含有优化密码子的HIVlvpr序列 atggagcagc cccctgagga ccagggcccc gagctgctgg aggagctg肌gcaggaggct ggcctgggcc agtatgtcta tgagacctat atcaggattc tgcagcagct gctgttcatc attggcattg tgaggc柳g gagggccaggcagagggagc cstacaatga gtggaccctg 60gtgaggcact tccccaggcc atggctgcat 120ggcgacacct ggacaggcgt ggagaccatc 180cactttagga ttggctgcca gcactccagg 240aatggcgcct ccaggtctta aa 292;含有优化密码子的HIVlvpn序列-atgctggacc tggagctggc tgtgggcgcc gtctggacca ttgtctacat tgagtacagg ctgatcaaga ggatcaggga gagggctgag gaggagctgt ccaccatggt ggacatgggc ta犯ctgattgtgg ccctgatcat tgccattgtg 60 aggctggtga agcagaggaa gattgactgg 120 gactctggca atgagtctga gggcgacaca 180 aggctgaggc tgctggatgt gaatgacctg 240244;含有优化密码子的HIVlnef序列-atggctggca agtggtcc肌gtcctccatt aggagg織g agcctgctgc tgatggcgtg ggcgccatca cctcctccaa cacagctgacgtgggctggc ctgccatcag ggagaggatc 60 ggcgctgtct ccagggeicct gg卿agcat 120 accaatgctg actgtgcctg gctggagacc 180caggaggagg aggaggt鹏cttccctgtg aggccccagg tgcccctgag gcccatgacc 譜ttcaagggcg ccctggacct gtccttcttc ctgaaggaga agggcggcct ggagggcctg 300atctactcca agaagaggca ggagatcctg gacctgtggg tctaccacac ccagggctac 360ttccctgact ggcacaacta cacccctggc cctggcgtga ggttccccct gacctttggc 420ggtgcttca agctggtgcc tgtggacccc agggaggtgg aggaggccaa tgagggcgag 480gacaactgtg ctgcccatcc tgtctgccag catggcatgg aggatgagca cagggaggtg 540ctgaagtgga agtttgactc ccagctggcc cacaggcaca gggccaggga gctgcatcct 600gagttctaca aggactgcta aa 622。
3、 根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于它还包含相关核酸序列或其片段或衍生物编码的多肽或蛋白质。
4、 根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于它携带有相关多核苷酸腺病毒载体或其它病毒载体。
全文摘要
本发明描述了一种腺病毒载体，它携带密码子优化的HIV结构基因和/或HIV调控和辅助基因，以及异源启动子和转录终止子。当单独或者联合质粒载体疫苗采用初次-加强免疫的方案时，该病毒载体疫苗可以用于预防HIV感染。
文档编号A61K48/00GK101219221SQ20071002629
公开日2008年7月16日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者凌 陈, 鑫 马 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院