专利名称：野菊花乙醇提取物在制备防治酒精性肝病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及野菊花乙醇提取物的用途，尤其涉及野菊花乙醇提取物在制备防治酒精性肝病的药物中的应用。
背景技术：
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的头状花序。秋、冬二季花初开放时采摘，晒干或蒸后晒干入药，是我国大部分地区民间常用中草药之一。广泛分布于我国东北、华北、西北、华东、西南等地，在安徽省主要分布于皖东、皖南等地。野生资源比较丰富，多生于石质山坡、草地、田边、路旁等处。
野菊花性味苦、辛，微寒，归肝、心经，具有疏散风热、消肿解毒、抗感染、抗病毒的功效，民间主治疔疮痈肿，目赤肿痛，头痛眩晕。临床上，野菊花被广泛用于预防感冒、流行性脑膜炎等急慢性感染性疾病，也用于治疗痈毒疖肿、高血压病和高脂血症、肿瘤等。国内研究多局限于野菊花化学成分的提取和鉴定方面，药效学研究也集中在抗菌和抗病毒活性方面。
野菊花化学成分 野菊花中化学成分较多，例如含有黄酮类化合物、萜类、挥发油、棕榈酸、多糖、β-胡萝卜素、蛋白质、氨基酸、嘌呤、胆碱、鞣质、维生素、叶绿素等多种成分。
黄酮类化合物是野菊花中重要的药效成分，早在1942年人们就从野菊花中分离出黄酮类化合物木犀黄酮苷(luteolin glucoside)。在国家重大基础研究前期研究专项基金资助下，我校药学院从野菊花中进行提取分离，并选用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型对几个有效部位及给药剂量进行正交设计，经过多次反复实验，筛选出抗炎活性部位及给药剂量。并经药学院天然药化教研室鉴定，确定了野菊花抗炎有效部位为野菊花乙醇提取物，其中总黄酮含量高达60％以上，故又称为野菊花总黄酮(Total flavonoids ofChrysanthemum indicum，TFC)。通过薄层色谱、高效液相色谱得知，TFC主要含有木犀草素、蒙花苷、木犀草素-7-葡萄糖苷等黄酮类化合物。
酒精性肝病及其药物治疗现状 长期的过度饮酒，通过乙醇本身和它的衍生物乙醛可使肝细胞反复发生脂肪变性，坏死和再生，而导致酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)，包括酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver)、酒精性肝炎(Alcoholic hepatitis)、肝纤维化(Alcoholic fibrosis)和肝硬化(Alcoholic cirrhosis)等多种表现。其组织学诊断分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化4型。在欧美国家，酒精性肝病是中青年死亡的主要原因之一。据估计1993年美国约有1530万人酗酒，酒精性肝病患者有200多万人，每年有2万6千人死于肝硬化，至少40％或许达90％的患者有酗酒史。在我国，随着生活条件的改善，酗酒者有增多趋势，尽管酒精性肝病的发生率尚无精确的统计，但并不少见。由于国内肝病主要由肝炎病毒引起，肝炎病毒携带者的数量更多，可能掩盖了实际上是酒精作为病因的肝病。因此正确认识酒精引起的肝损害，及时诊断和防治具有重要的意义。
酒精性肝病的治疗主要针对(1)减轻酒精性肝病的严重度；(2)阻止或逆转肝纤维化；(3)改善已存在的继发性营养不良；(4)酒精性肝硬化的治疗。近年来，治疗酒精性肝病的药物有 1.糖皮质激素酒精性肝病时肝内有炎症反应，肝细胞肿胀坏死以及胶原生成和沉积；有证据表明，酒精性肝病的起始和发展有免疫因素参与。糖皮质激素能抑制花生四烯酸代谢的脂氧合酶和环氧合酶的途径，从而抑制白三烯类及前列腺素的促炎症作用，尚可促进白蛋白合成和阻止I型胶原生成。因此有人提出可用来治疗酒精性肝病，但目前许多研究结果不一致。许多因素包括性别，肝病严重度，肾功能，营养状态甚至地域可造成不同的结局。一般认为激素对轻中型病例无明显效果，而仅仅严重病例才能从激素受益。至于激素是否对病人的远期生存率有影响，或长程激素治疗是否能阻止发展为肝硬化，尚缺乏研究。
2.胰岛素与胰高血糖素胰岛素及胰高血糖素静滴对酒精性肝病有一定疗效，但在治疗过程中应检测血糖，防止发生致命性低血糖。
3.丙基硫氧嘧啶 丙基硫氧嘧啶治疗的疗效主要见于严重病例，而且是酒精量相对较少者。
4.抗氧化剂 还原型谷胱甘肽，牛磺酸，胡萝卜素，维生素E，r-月见草，硒有机化合物等，有可能减少氧应激损害及脂质过氧化诱致的肝纤维化，可解除外源性有毒物质的毒性。
5.多不饱和卵磷脂 为肝窦内皮和肝细胞膜稳定剂，可降低脂质过氧化，但因富含不饱和脂肪酸，对不能戒酒者应慎用。
6.降脂药 有异议，需待解释。许多降血脂药可能趋使血脂更集中于肝脏进行代谢，反而促使脂质贮积并损害肝功能。
7.抑制肝纤维化的中药 在我国应用活血化瘀中药治疗慢性肝病已有悠久历史，如桃仁，丹参，当归，汉防己甲素，何首乌，山楂，姜黄，枸杞子，川芎，泽泻，黄岑，黄精，大黄等，分别有改善肝脏微循环，防止肝细胞变性坏死，减少胶原纤维的产生或增强胶原酶活性等作用，有助于酒精性肝炎肝纤维化的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供野菊花乙醇提取物的新用途，即在制药中的新应用。
实际上，本发明涉及野菊花乙醇提取物在制备防治酒精性肝病的药物中的应用。
野菊花乙醇提取物物理性状为深棕色粉末，易吸潮，水溶性较差，易溶于亲脂性有机溶剂，具有特殊香味。
野菊花乙醇提取物中总黄酮含量为50～65％(HPLC法；比色法)。另外还有皂苷(15～20％，比色法)、咖啡酸(1～2％，HPLC)及绿原酸(1～3％，HPLC)。野菊花乙醇提取物经进一步分离，得到木犀草苷、木犀草素及蒙花苷。经HPLC法测定，三种黄酮类化合物的含量分别为木犀草苷(10～15％)、木犀草素(2～4％)、蒙花苷(8～12％)。
野菊花乙醇提取物(TFC，250，500mg·kg-1)能显著降低急性酒精性肝病小鼠血清中升高的TG、AST、ALT水平以及肝匀浆中升高的MDA含量(与模型组比较，p＜0.05)，明显提高肝匀浆中SOD、GSH、GSH-Px的活性(与模型组比较，p＜0.05)，显著抑制酒精性肝病引起的TNF-α和IL-1β的过高产生(与模型组比较，p＜0.05)；同时，病理组织学检查结果提示TFC(250，500mg·kg-1)可明显改善肝脏脂肪变性程度，减轻肝组织炎症反应。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用野菊花乙醇提取物的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
野菊花乙醇提取物对急性酒精性肝病的防治作用试验如下 (一)材料 动物 昆明种小鼠，雄性，体重22±2g；由安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号皖医实动准第02号)。
主要药物和试剂 野菊花乙醇提取物(TFC，自制)，凯西莱(河南省新谊药业股份有限公司，批号060716)，无水乙醇(上海化学试剂有限公司，批号200610206)，ALT、AST测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20070118、20070115)，TG测定试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司，产品号AO-10017)，SOD、MDA、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20070123、20070122、20061010)，GSH、GSH-Px测定试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所，批号20070123、20070122)，TNF-α、IL-1β放射免疫分析测定盒(北京北方生物技术研究所，批号070120、070120)。
主要仪器BP211D电子天平(德国Saftarius生产)，DL-5M低速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司产品)，TGL-16H高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司产品)，722S分光光度仪(上海精密科学仪器公司产品)，GSY-8电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂意成公司产品)，Multiskan MK3酶标仪(荷兰雷勃公司产品)，SW-CJ-IF型超净工作台(江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品)等。
(二)方法 模型制备、分组及标本采取 正常喂养一周后的昆明种小鼠，
，体重22±2g，随机分成6组，每组10只。设正常对照组(Normal)、模型组(Model)、TFC低剂量组(125mg·kg-1)、中剂量组(250mg·kg-1)、高剂量组(500mg·kg-1)和凯西莱(TP)阳性对照组(20mg·kg-1)。
实验时，根据体重灌胃(ig)给药(20ml.kg-1)，每日1次，连续7天，灌胃药物以5g·L-1的羧甲基纤维素钠制成混悬液，每日灌胃前称体重决定灌胃量，模型组和正常对照组予以相应体积的溶媒。于末次给药前6h开始禁食(不禁饮)，末次给药后1h，除正常对照组小鼠ig相应体积生理盐水外，其余各组小鼠一次性ig 50％酒精6g·kg-1，继续禁食(不禁饮)6h后，小鼠眼球采血，分离血清，做相关指标检测。同时，引颈处死动物，取出肝脏并称重，取肝左叶距边缘0.5cm处的一小块肝组织，行病理组织学检查，并常规制备肝匀浆。
血清生化指标测定 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)测定按试剂盒规范操作。
肝脏生化指标及细胞因子的测定在相同部位取肝脏精确称取0.5g，在冰水中制成10％的肝匀浆，4℃ 3000rpm离心10min，提取上清液，按试剂盒方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量，并用放射免疫分析法测定匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量。
肝脏组织病理学检查肝脏组织以10％的中性福尔马林固定，石蜡包埋切片进行常规HE染色，在光镜下观察肝组织脂肪变性和炎症活动情况。肝脏组织学诊断标准参考中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组所制订的酒精性肝病诊断标准。
(三)结果 1.野菊花乙醇提取物对急性酒精性肝病小鼠血清AST、ALT、TG水平的影响 由表1可见，野菊花乙醇提取物(TFC，250，500mg·kg-1)能显著降低急性酒精性肝病小鼠血清中ALT、AST、TG水平，表明其具有稳定肝细胞膜和线粒体膜，改善肝脏的脂质代谢，减少肝脏对脂质的吸收，减轻游离脂肪酸对肝脏的细胞毒性作用。
表1野菊花乙醇提取物对酒精致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TG的影响(
n＝10) ##P＜0.01，与正常组比较；**P＜0.01，*P＜0.05，与模型组比较 2.野菊花乙醇提取物对酒精性肝病小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH、GSH-Px含量的影响 由表2、3可见，野菊花乙醇提取物(TFC，250、500mg·kg-1)可显著降低急性酒精性肝病小鼠肝匀浆中MDA含量，提高肝匀浆中SOD、GSH及GSH-PX的活性，说明野菊花乙醇提取物可能具有一定的抑制过氧化物质形成以及促进抗氧化物质生成的作用，并可通过提高肝组织SOD、GSH及GSH-Px活力，阻遏酒精性脂肪肝的发展与转归。
表2野菊花乙醇提取物对酒精致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA的影响(
n＝10) ##P＜0.01，与正常组比较；**P＜0.01，*P＜0.05，与模型组比较 表3野菊花乙醇提取物对酒精致急性肝损伤小鼠肝脏GSH、GSH-Px的影响(
n＝10) ##P＜0.01，与正常组比较；**P＜0.01，*P＜0.05，与模型组比较 3.野菊花乙醇提取物对急性酒精性肝病小鼠肝匀浆TNF-α和IL-1β含量的影响 由表4可见，和正常组比较，给予酒精(50％，6mg·kg-1)后的全体小鼠肝组织中TNF-α和IL-1β含量显著升高，说明在酒精的刺激下，小鼠的肝组织均有一定程度的损伤，导致TNF-α和IL-1β的大量分泌。而给予野菊花乙醇提取物(TFC，250、500mg·kg-1)后，肝组织中TNF-α、IL-1β含量显著降低，提示其对细胞因子的调节作用可能是其治疗酒精性肝病的重要机制。
表4野菊花乙醇提取物对酒精致急性肝损伤小鼠肝脏TNF-α和IL-1β的影响(
n＝10) ##P＜0.01，#P＜0.05，与正常组比较**P＜0.01，*P＜0.05，与模型组比较 4.野菊花乙醇提取物对急性酒精性肝病小鼠肝脏病理组织学变化的影响 病理组织学检查 正常组小鼠肝细胞形态正常，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝细胞大小较一致，胞核居中，胞质淡红色，在中央静脉区偶可见少数散在脂滴，肝血窦正常，无明显变性、坏死(图1)。模型组小鼠出现典型脂肪肝病变肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀，细胞内充满大小不一的脂滴，小叶内出现碎片状坏死及散在的点状或灶型坏死，汇管区有炎细胞浸润，肝窦变窄，胞浆、胞核淡染，但未见肝纤维化(图2)。野菊花乙醇提取物(TFC，125mg·kg-1)组对急性酒精性肝病模型小鼠肝脏脂肪变性程度和肝组织炎症反应的减轻作用不明显(图3)，野菊花乙醇提取物(TFC，250mg·kg-1、500mg·kg-1)组明显减轻模型小鼠肝脏脂肪变性程度，肝组织的炎症反应也显著减轻(图4，图5)，阳性对照药凯西莱(TP)(20mg·kg-1)组也明显减轻模型小鼠肝脏脂肪变性程度，肝组织的炎症反应也显著减轻(图6)。
从以上结果，可以得出本发明的有益效果在于 A、本发明对野菊花乙醇提取物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新应用领域。
B、本发明的野菊花乙醇提取物既能治标，又能治本，安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
C、本发明的野菊花乙醇提取物原料来源丰富、价廉、制备工艺成熟，可制成各种口服剂型，使用方便。
D、本发明的野菊花乙醇提取物对急性酒精性肝病具有良好的防治作用，长期服药无危害。
图1为正常组小鼠肝细胞形态(HE×200)图， 图2为急性酒精性肝病模型组小鼠出现典型脂肪肝病变(HE×200)图， 图3为急性酒精性肝病模型小鼠+TFC 125mg·kg-1用药组(HE×200)图， 图4为急性酒精性肝病模型小鼠+TFC 250mg·kg-1用药组(HE×200)图， 图5为急性酒精性肝病模型小鼠+TFC 500mg·kg-1用药组(HE×200)图， 图6为急性酒精性肝病模型小鼠+凯西莱用药组(HE×200)图。
具体实施例方式 下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例 干燥野菊花(5kg)用80％乙醇，50L，回流提取2次，每次3h，合并提取液，回收溶剂至无醇味(10L)，上AB-8大孔树脂(5kg)，用25L水洗脱，除去水溶性杂质，再用50％乙醇2L洗脱，合并醇洗脱液，回收溶剂，得野菊花乙醇提取物(500±50g)。HPLC法测定野菊花乙醇提取物中总黄酮含量为55％；比色法测定总黄酮含量为65％。另外还有皂苷(20％，比色法)、咖啡酸(1.5％，HPLC)及绿原酸(2.5％，HPLC)。
野菊花总黄酮经进一步分离，得到木犀草苷、木犀草素及蒙花苷。经HPLC法测定，三种黄酮类化合物的含量分别为木犀草苷(15％)、木犀草素(4％)、蒙花苷(12％)。以上化合物为野菊花乙醇提取物中主要的黄酮类化合物。
以上野菊花乙醇提取物临用前均以0.5％CMC-Na配成混悬液，所用剂量均以干粉量表示。
野菊花乙醇提取物推荐临床剂量62.5-125mg/日，口服，分三次服用。
权利要求
1.野菊花乙醇提取物在制药中的应用，其特征在于野菊花乙醇提取物在制备防治酒精性肝病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及野菊花乙醇提取物的新用途，即在制备防治酒精性肝病药物中的应用。本发明对野菊花乙醇提取物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新应用领域。野菊花乙醇提取物既能治标，又能治本，安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景；其原料来源丰富、价廉、制备工艺成熟，可制成各种口服剂型，使用方便。
文档编号A61P1/16GK101112407SQ20071002557
公开日2008年1月30日 申请日期2007年8月3日 优先权日2007年8月3日
发明者俊 李, 吕雄文, 涌 金, 程文明, 陈飞虎, 石静波 申请人:安徽医科大学