专利名称：硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐酸小檗碱长循环脂质体的方法
技术领域：
本发明属于智能药物载体技术领域，具体涉及一种综合利用硫酸铵梯度 法、薄膜蒸发法制备盐酸小檗碱长循环脂质体的方法。
背景技术：
脂质体(liposomes)是由脂质双分子层构成的内部为水相的封闭嚢泡。 这种由磷脂质双层(phosphocid bilayers )结构组成的脂质体(liposomes)在 结构上交替间隔着水层和磷脂质双层，可以包埋亲水性或亲脂性的物质。脂 质体作为一种智能药物载体得到越来越多的关注，具有优良的靶向性、生物 相容性和提高药物稳定性、治疗指数以及降低药物毒性等优点。脂质体进入 人体循环系统后，因血液中的蛋白、调理素等的作用，易发生破裂，包封的
药物快速渗漏，被网状内皮组织系统(RES)识别吸收，从而降低了应用价值。 于是，人们致力于研究长循环脂质体。通过在脂质体的成分中加入一定比例 的糖脂或在磷酸分子上联接含多羟基团的物质(如聚乙二醇PEG),使脂质体 表面暴露出一些亲水性的多羟基基团等方式，减少与血浆中蛋白、调理素的 作用，从而增加其在血液中的稳定性。
目前，制备脂质体的方法颇多，传统的成熟的被动载药方法有为薄膜蒸 发法、逆相蒸发法、溶剂注入法等。近年来，由于脂质体主动载药的发展， 大大改善了被动载药制得的脂质体包封率都不高、包封条件不易掌握、包封 率差异较大等缺点；主动载药法特别是用硫酸铵梯度法制备生物碱类药物的
脂质体。硫酸铵梯度法是利用硫酸铵水溶液作为水相。当脂质体双分子膜内
的硫S臾铵浓度远远大于外水相中的硫酸铵浓度时，内水相中的铵离子(NH/) 解离为氨分子(NH3)。由于NH3跨膜速率远远大于S042、且NH3和SO^的渗透 系数(P)也有很大的差异，所以当一个NH3离开脂质体内部时，就会在脂质体 的内水相中留下一个H"，从而建立起一个硫酸铵梯度，同时产生一个pH梯 度，使药物逆硫酸铵梯度载入脂质体，可制备出相对较高包封率的脂质体。
发明内容
本发明的目的是提供一种硫酸铵梯度法结合薄膜蒸发法制备盐酸小檗 碱长循环脂质体的方法，此方法是综合利用以上的现有技术，创建的一种新 的主动复合被动载药的方法，以制备盐酸小檗碱长循环脂质体。本发明将解 决药物载体中存在的两个主要问题1、提高脂质体药物的包封率；2、提高 脂质体药物载体的稳定性。
完成上述任务本发明的技术方案是，硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐 酸小檗碱长循环脂质体的方法，步骤如下
1) .将蛋黄卵磷脂(EPC),以及1/2.5-1/3.5蛋黄卵磷脂质量的胆固醇(CH)， 以及1/20-1/5蛋黄卵磷脂质量的聚乙二醇2000 (PEG2000)溶于适量无水乙 醇中，直至形成黄色透亮溶液；
2) .减压回收乙醇，在容器壁形成膜；注入硫酸铵溶液，使得膜材溶解； 水化lh 2h;
3) .然后以蒸馏水为透析介质，透析15 20h，制造硫酸铵梯度，得空白 脂质体；
4) .在空白脂质体中加入盐酸d 、檗碱溶液；5) .在30。C 60。C孵化10 60分钟；
6) .然后取孵化后的溶液，以蒸馏水为透析外液，在4。C 37。C透析12h， 透析到外液无色透明；把透析液转移至容量瓶中定容，即可获得包封率高， 稳定，粒径均匀的长循环脂质体。
以上所述的无水乙醇的"适量"，是以能够完全溶解为度； 所述的"在30。C 6(TC孵化10~60分钟"，推荐采用6(TC下孵化10分钟； 所述的硫酸铵溶液的浓度为1.0 ml . l" 2.5ml . 1";可以分别是1.0、 1.5、 2.0、 2.5ml . 1";硫酸铵溶液的加入量以膜材完全溶解为度；本申请推荐采 用的浓度为2.5ml . 1";推荐采用的加入量为25ml硫酸铵溶液/50 500mg EPC;
本申请推荐的透析温度为4°C。
更具体和更优化地说，本发明的综合利用硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制 备盐酸小檗碱长循环脂质体的方法，具体操作步骤是
1) .用50ml三角烧瓶称取50~500mg蛋黄卵磷脂(EPC),以及1/3蛋黄卵 磷脂质量的胆固醇(CH)，以及1/20-1/5蛋黄卵磷脂质量的聚乙二醇2000, 溶于适量乙醇中(2 5ml)，若难溶，可加热适当超声使其溶解，形成黄色透 亮溶液；
2) .在旋转蒸发仪减压回收乙醇，直至无醇味，在烧瓶壁形成膜，分成几 组，分别注入25ml 1.0、 1.5、 2.0、 2.5ml . T1的硫酸铵溶液，可适当超声， 使得膜材溶解，7jc化lh 2h;
3) .然后把溶液装入透析袋，以蒸馏水为透析介质， 一般透析15 20h制 造硫酸铵梯度，最后得空白脂质体；4) .取5ml的空白脂质体将其转移至50ml三角烧瓶中，加入5ml的lmg l"-2mg . r1的盐酸小檗碱溶液；
5) .分组，分别在30。C 60。C等不同温度下孵化10 60分钟；
6) .然后取1 2ml转移至透析袋中，以蒸馏水为透析外液，分组，分别不 同温度下(4°C、室温、37。C)透析12h，每3h换一次透析液，根据温度， 需直至透析到外液无色透明，把透析液转移至100ml容量瓶中定容，测紫外 吸光度，根据标准曲线可算出包封率。
3.有益效果
本发明提供的用硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备长循环脂质体的综合 制备方法，通过本发明所获得的长循环脂质体包封率高，稳定，粒径均勾。
图1为孵化时间对包封率的影响曲线图； 图2为將化温度对包封率的影响曲线图； 图3为硫酸铵浓度对包封率的影响曲线图； 图4为盐酸小檗碱的标准曲线图。
具体实施例方式
实施例1:用50ml三角烧瓶称取400mg蛋黄卵磷脂(EPC),以及133mg 胆固醇(CH), 60mgPEG2000溶于2ml乙醇中，若难溶，可加热适当超声使 其溶解，形成黄色透亮溶液，在旋转蒸发仪减压回收乙醇，直至无醇味(约 90分钟)，在烧瓶壁形成膜，注入25ml 2.0mol . 1"浓度硫酸铵溶液，可适当 超声，使得膜材溶解，水化lh 2h,然后把溶液装入透析袋，以蒸馏水为透 析介质， 一般透析15 20h制造硫酸铵梯度，最后得空白脂质体，取5ml的
空白脂质体将其转移至50ml三角烧瓶中，加入5ml lmg.l"盐酸小檗碱溶 液，在水浴40。C下孵化60分钟，然后取lml转移至透析袋中以蒸馏水为透 析外液在4。C下透析12h,每3h换一次透析液，根据温度，需直至透析到外 液无色透明，把透析液转移至100ml容量瓶中定容，测紫外吸光度，根据标 准曲线可算出包封率。变化孵化时间从10、 20、 30、 40、 50、 60分钟，考 察最优条件。(见图1)
实施例2:用50ml三角烧瓶称取400mg蛋黄卯磷脂(EPC)，以及133mg 胆固醇(CH)， 60mgPEG2000溶于2ml乙醇中，若难溶，可加热适当超声使 其溶解，形成黄色透亮溶液，在旋转蒸发仪减压回收乙醇，直至无醇味(约 卯分钟)，在烧瓶壁形成膜，注入25ml 2.0mol . 1"浓度硫酸铵溶液，可适当 超声，使得膜材溶解，水化lh 2h,然后把溶液装入透析袋，以蒸馏水为透 析介质， 一般透析15~20h制造硫酸铵梯度，最后得空白脂质体，取5ml的 空白脂质体将其转移至50ml三角烧瓶中，加入5ml lmg.l"盐酸小檗碱溶 液，在水浴40。C下孵化IO分钟，然后取2ml转移至透析袋中以蒸馏水为透 析外液在4。C下透析12h,每3h换一次透析液，根据温度，需直至透析到外 液无色透明，把透析液转移至100ml容量瓶中定容，测紫外吸光度，根据标 准曲线可算出包封率。变化不同赙化温度30、 36、 40、 46、 50、 56、 60°C, 考察最优条件。(见图2)
实施例3:用50ml三角烧瓶称取400mg蛋黄卵磷脂(EPC),以及133mg 胆固醇(CH)， 60mgPEG2000溶于2ml乙醇中，若难溶，可加热适当超声使 其溶解，形成黄色透亮溶液，在旋转蒸发仪减压回收乙醇，直至无醇味(约 卯分钟)，在烧瓶壁形成膜，注入25ml 2.5mol . 1"浓度硫酸铵溶液，可适当
超声，使得膜材溶解，水化lh 2h，然后把溶液装入透析袋，以蒸馏水为透 析介质， 一般透析15~20h制造硫酸铵梯度，最后得空白脂质体，取5ml的 空白脂质体将其转移至50ml三角烧瓶中，加入5mllmg l"盐酸小檗碱溶液， 水浴60。C下孵化60分钟，然后取lml转移至透析袋中以蒸馏水为透析外液 在4。C下透析12h，每3h换一次透析液，根据温度，需直至透析到外液无色 透明，把透析液转移至100ml容量瓶中定容，测紫外吸光度，根据标准曲线 可算出包封率。变化硫酸铵的浓度1.0、 1.5、 2.0、 2.5mol.r1,考察最优条 件。(见图3)
实施例4,与实施例l基本相同，但有以下改变 所述的粹化温度和时间为3(TC孵化60分钟；
所述的硫酸铵溶液的浓度是1.0 ml . 1";硫酸铵溶液的加入量为25ml 硫酸铵溶液/50 500mg EPC; 所述的透析温度为室温。
实施例5，与实施例l基本相同，但有以下改变 所述的孵化温度和时间为4(TC孵化30分钟；
所述的碌u酸铵溶液的浓度分别是1.5ml . 1";硫酸铵溶液的加入量为 25ml硫酸铵溶液/50 500mg EPC; 所述的透析温度为37°C。
实施例6,与实施例1基本相同，但有以下改变 所述的將化温度和时间为50°C孵化20分钟；
所述的石克酸铵溶液的浓度分别是2.0ml . r1;硫酸铵溶液的加入量为 25ml硫酸铵溶液/50 500mg EPC。
权利要求
1、一种硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐酸小檗碱长循环脂质体的方法，步骤如下1).将蛋黄卵磷脂，以及1/3蛋黄卵磷脂质量的胆固醇，以及1/20-1/5蛋黄卵磷脂质量的聚乙二醇2000溶于适量无水乙醇中，形成黄色透亮溶液；2).减压回收乙醇，在容器壁形成膜；注入硫酸铵溶液，使得膜材溶解；水化1h～2h；3).以蒸馏水为透析介质，透析15～20h，制造硫酸铵梯度，得空白脂质体；4).在空白脂质体中加入盐酸小檗碱溶液；5).在30℃～60℃孵化10～60分钟；6).取孵化后的溶液，以蒸馏水为透析外液，在4℃～37℃温度下透析12h，透析到外液无色透明；把透析液转移至容量瓶中定容，即可获得包封率高，稳定，粒径均匀的长循环脂质体。
2、 按照权利要求1所述的硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐酸小檗碱 长循环脂质体的方法，其特征在于，所述的孵化温度和时间为60。C下孵化IO分钟；所述的硫酸铵溶液的浓度分别是1.0 ml . l" 2.5ml . r、硫酸铵溶液的加 入量为25ml硫酸铵溶液/50 500mg EPC; 所述的透析温度为4°C。
3、 按照权利要求1或2或3所述的硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐 酸小檗碱长循环脂质体的方法，其特征在于，具体操作步骤是1) .用50ml三角烧瓶称取50~500mg蛋黄卵磷脂，以及1/3蛋黄卵磷脂量 的胆固醇，以及1/20-1/5蛋黄卯磷脂质量的聚乙二醇2000溶于适量乙醇中， 若难溶，可加热和超声波处理使其溶解，形成黄色透亮溶液；2) .在旋转蒸发仪减压回收乙醇，直至无醇味，在烧瓶壁形成膜，注入 25ml2.5ml . l"的硫酸铵溶液，适当超声，使得膜材溶解，水化lh 2h;3) .把溶液装入透析袋，以蒸馏水为透析介质，透析15 20h制造硫酸铵 梯度，最后得空白脂质体；4) .取5ml的空白脂质体将其转移至50ml三角烧瓶中，加入5ml的lmg l"-2mg . l"的盐酸小檗碱溶液;5) .在60。C孵化IO分钟；6) .取1 2ml转移至透析袋中，以蒸馏水为透析外液，于4。C下透析12h， 每3h换一次透析液，需直至透析到外液无色透明，把透析液转移至100ml 容量瓶中定容，测紫外吸光度，根据标准曲线算出包封率。
全文摘要
硫酸铵梯度法-薄膜蒸发法制备盐酸小檗碱长循环脂质体的方法1)将蛋黄卵磷脂、1/3蛋黄卵磷脂质量的胆固醇及1/20-1/5蛋黄卵磷脂质量的聚乙二醇2000溶于乙醇中；2)减压回收乙醇在容器壁形成膜；注入硫酸铵溶液使膜材溶解；水化1h～2h；3)以蒸馏水为透析介质透析15～20h，制造硫酸铵梯度，得空白脂质体；4)在空白脂质体中加入盐酸小檗碱溶液；5)在30℃～60℃孵化10～60分钟；6)取孵化后的溶液，以蒸馏水为透析外液于不同温度下透析12h，到外液无色透明；透析液转移、定容，即获得包封率高，稳定，粒径均匀的长循环脂质体。本发明所获得的长循环脂质体包封率高，稳定，粒径均匀。
文档编号A61K31/4375GK101108167SQ20071002553
公开日2008年1月23日 申请日期2007年8月3日 优先权日2007年8月3日
发明者安学勤, 琨 朱 申请人:南京师范大学