巨大戟醇提取物的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及巨大戟醇提取物的分离纯化方法，属于中药提取分离领域。
【背景技术】
[0002] 巨大戟醇（ingenol)是一种四环二聰类天然产物，其结构式如式I所示，来源于 大戟科大戟属植物，W其为母核的衍生物表现出较好的抗癌、抗HIV等生物活性，其中W巨 大戟醇-3-当归酸醋为分子实体的新药Picato已于2012年被抑A批准上市，用于光化性 角化病的治疗。
[0003]
[0004] 巨大戟醇结构新奇复杂，在过去的30多年里，其独特的结构和活性虽然引起 了众多化学家的关注，也有相关全合成的报道，但合成路线大多步骤繁琐，得率低，难 W适应日益增长的市场需求；LEOF*ha;rma公司与ScrippsResearchInsti1:ute合作 [Science341，878(2013)]，由（+)-3-曹帰通过14步最终合成得到巨大戟醇，总收率达到 1.2%，但其合成路线仍然处于实验室阶段，且合成过程中需要用到剧毒试剂四氧化饿和二 氧化砸，该工艺用于放大生产还有待进一步验证。
[0005] 目前市场上，巨大戟醇仍然主要来源于大戟科植物的提取分离。
[0006] 中国专利CN102126941A对提取浸膏采用萃取、反萃取、碱水解、调抑、减压浓缩， 然后对浓缩后的浸膏采用硅胶柱层析，结合重结晶手段纯化得到高纯度的巨大戟醇，该方 法前期有多次萃取操作，耗时长，转移率低，损失较大，且用到价格昂贵的有毒性的萃取试 剂己腊，成本高，不利于环保，也不适合规模化生产，而且硅胶柱层析采用了石油離/己酸 己醋（1:1)洗脱除杂，然后加入己酸己醋洗脱，在除杂的过程中由于己酸己醋的加入会将 部分巨大戟醇化合物带出，降低产率。
[0007] 专利CN103694096A对提取浸膏同样采用了萃取操作，萃取物浓缩后先后经过娃 胶柱层析和制备液相纯化，最终得到高纯度的巨大戟醇单体，由于千金子药材中巨大戟醇 主要W其醋类衍生物形式存在，该纯化工艺未采用水解步骤，因而最终产品收率极低，难W 满足规模化生产要求。
[0008] 专利WO2013050365Al中对千金子药材粉末直接加碱揽拌水解，中和后再依次用 石油離和四氨巧喃萃取，然后采用硅胶柱层析纯化得到高纯度的巨大戟醇，该方法虽简化 了纯化步骤，但因其用药材粉末直接加碱揽拌水解，无法保证药材里的巨大戟醇衍生物都 能浸提出来并水解完全。
[0009] 上述专利均采用了多步萃取操作，因千金子中富含油类成分，萃取时容易乳化，需 大量溶剂多次萃取才能将目标成分萃取完全，萃取效率低，导致提取率低；萃取所用萃取剂 石油離沸点低，减压浓缩回收率低，也在一定程度上增加了生产成本；而且现有技术中柱层 析大多采用石油離和己酸己醋混合洗脱剂洗脱，虽然能够有效的除去极性小的杂质，由于 混合洗脱剂中己酸己醋的加入，目标化合物巨大戟醇也会随着杂质被带出，降低了生产产 率。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。
[0011] 本发明的技术方案：巨大戟醇提取物的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0012] a、将巨大戟醇提取物加碱水解后，加酸中和，然后浓缩得到膏状物；
[0013]K将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化，所述硅胶柱层析装 置包括层析柱A和层析柱B，层析柱A和层析柱B之间采用H通阀进行连接；硅胶柱层析具 体操作如下：调节H通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，在层析柱A中上样，然后，层析 柱A采用石油離洗脱除杂，调节H通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入己 酸己醋洗脱，收集巨大戟醇-己酸己醋混合液；
[0014]C、将步骤b得到的巨大戟醇-己酸己醋混合液减压浓缩后，静置析出，过滤得到巨 大戟醇。
[0015] 进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取 溶剂提取得到；所述提取溶剂为甲醇、己醇、丙丽、己離或氯仿。
[0016] 进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下；取大戟科大戟属 植物药材，粉碎或切段，按料液比1:5~20w/v加入提取溶剂进行回流提取，提取1~4次， 每次0. 5~2小时，合并提取液，减压浓缩得巨大戟醇提取物。其中，w/v的单位为kg/L。
[0017] 进一步地，优选所述大戟科大戟属植物为甘遂、乳浆大戟、千金子或南欧大戟。
[0018] 进一步地，优选步骤a所述碱水解、酸中和的操作如下：取巨大戟醇提取物，加入 甲醇或无水己醇稀释，甲醇或无水己醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0. 5~2倍，加碱水 解0. 5~24小时，每升混合溶液中碱的含量为5~40g，水解完毕，加酸调节抑至7得到水 解液，然后将水解液浓缩得膏状物。
[0019] 进一步地，优选步骤a中所述碱为氨氧化钢、氨氧化钟、甲醇钢或己醇钢；所述酸 为磯酸、盐酸、醋酸或甲酸。
[0020] 进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
[0021] 调节H通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，装填层析柱A和层析柱B，层析柱A 采用石油離洗脱平衡至无气泡，层析柱B采用己酸己醋洗脱平衡至无气泡，然后上样，样品 装入层析柱A，然后采用石油離洗脱；洗脱完毕，调节H通阀，使层析柱A和层析柱B连接， 向层析柱A中加入己酸己醋洗脱，得到巨大戟醇-己酸己醋混合液。
[0022] 进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
[0023]调节H通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A先装填0~1/2柱体积的 层析用硅胶，并用石油離洗脱平衡至无气泡，层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用己酸 己醋洗脱平衡至无气泡，另将拌样硅胶与步骤a得到的膏状物按质量比1~1. 5:1混合拌 匀，得到样品I，取样品I装入A柱，上样量为层析柱A柱体积的1/2~1，用2~6个柱体 积的石油離洗脱；然后，调节H通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2~6个柱体积的己酸 己醋洗脱，收集巨大戟醇-己酸己醋混合液；
[0024] 或调节H通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A装填1个柱体积层析用 硅胶并用石油離洗脱平衡至无气泡；层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用己酸己醋洗 脱平衡至无气泡，另将步骤a得到的膏状物用石油離稀释得到样品II，石油離的体积为膏 状物体积的0. 5~3倍，将1/2~1个柱体积的样品II上样至层析柱A，用2~6个柱体积 的石油離洗脱；然后，调节H通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2~6个柱体积的己酸己 醋洗脱，收集巨大戟醇-己酸己醋混合液。
[00巧]硅胶柱层析中，优选最终收集合并巨大戟醇纯度> 80%的巨大戟醇-己酸己醋混 合液。纯度是通过高效液相（HHX)检测的。
[0026] 进一步地，为了达到更好的柱层析效果，优选步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每 小时0. 5~5个柱体积。
[0027] 进一步地，优选所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重 新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分 离纯化，进行连续操作。
[0028] 进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泉；更进一步地，优 选湿法上样、洗脱溶剂石油離或己酸己醋采用泉送加入。
[0029] 硅胶柱层析湿法上样时可通过泉送加入。湿法上样即将膏状物加石油離稀释后上 样，即样品II。
[0030] 进一步地，优选步骤C中所述静置析出，优选在-20~5C下静置0~2地。
[0031] 本发明所具有的有益效果如下：
[0032] 1、操作步骤简单，采用本发明方法石油離洗脱除杂，然后采用己酸己醋洗脱得到 目标化合物，不仅可W省去多步萃取操作，并且最终的巨大戟醇的纯度仍能将纯度提高到 99. 9%，由于萃取步骤的省去，操作更为简单、产品损失少，收率得到提高。
[0033] 2、水解时间大为缩短，在0. 5-24小时内，可大幅缩短产品的生产周期。
[0034] 3、采用柱切换技术，操作更简单，一次完整的柱层析流程相当于将提取物进行了 多次单柱柱层析，而且层析柱B中的硅胶可W重复使用2次W上，一定程度上减少了硅胶使 用量和试剂消耗量，可大幅降低生产成本。
[0035] 4、本发明采用单一洗脱剂石油離洗脱除杂，然后采用己酸己醋洗脱得到目标化合 物，采用的单一洗脱剂，洗脱剂易回收。
[0036] 5、本发明采用附图1的装置，采用泉送加入溶剂，尤其适用于规模化连续生产。
【附图说明】
[0037] 图1是本发明用到的装置连接示意图（1为层析柱A，2为层析柱B，3为H通阀，4 为泉）；
[0038] 图2是本发明制备得到的巨大戟醇TLC谱图（展开剂为石油離：己酸己醋1:1 ; 显色剂为2 %香草醒-浓硫酸溶液）；