专利名称：一种野菊花提取物及其指纹图谱检测方法
技术领域：
本发明属于药物制备、药物分析和药物代谢技术领域。具体涉及中药野菊花提取物的制备，以及通过中药指纹图谱方法进行野菊花提取物质量检测和控制；一方面通过高效液相色谱(HPLC)指纹图谱针对野菊花活性成分进行多成分全面质量检测和控制，另ー方面通过锁定原型吸收成分，进行具体成分的质量检测和控制。
背景技术：
中药中含有多种化学成分，并被同时服用到体内，产生治疗作用。但中药内含化学成分的极性差距显著，经常是既含有极性很小的化学成分又含有极性很大的化学成分，单 ー溶剂通常难以提取出各类极性成分。所以采用不同极性试剂经两步或多步提取可尽量提取出各类剂型化学成分，保证提取物中各类成分的充分包含。另外，由于提取物中成分复杂，为了实现质量控制的目的，还需要科学有效的检测手段针对中药含有的化学成分进行检测。指纹图谱技术是ー种成熟的中药成分检测方法，在中药等植物药质量控制中的应用，已成为国内外公认的最有效手段之一。美国FDA在1996年颁布的《FDA关于植物制品的指南》和2004年的《植物药产品的行业指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品以指纹图谱进行质量控制，提出了建设性意见。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家食品药品监瞀管理局于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，明确要求对新申请的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准，中国国家药典委员会于2002年发布了《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，对色谱指纹图谱的技术内容提出了指导性意见。化学成分色谱指纹图谱，尤其是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱直接显示多种具体化学成分的指纹特征信息，便于从成分整体上进行多成分质量控制，在国际上容易获得认可，因此中药采用HPLC指纹图谱进行质量控制，是国际认可、技术合理的有效质量控制手段。采用具体某种中药内含成分进行中药质量控制，成分的选择直接决定中药质量控制水平的高低。最理想的备选成分是药效明确，机制清楚，原型吸收并达到靶点的长时间、高浓度驻留，但符合此高要求的成分常难明确，所以间接阻碍了中药质量控制水平的提升。但药效-质量关联的质控目标要求我们实践创新方法，逐渐接近目标；所以对中药多成分中主要通过吸收入血产生药效的情况开展研究，将可以原型吸收入血作为质控成分的筛选原则，可以更接近药效-质量关联的质控目标。野菊花为菊科多年生草本植物野菊的头状花序，外形与菊花相似，野生于山坡草地、田边路旁。以色黄无梗、完整、气香、花未全开者为佳。野菊花含可广泛用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、风火赤眼、头痛眩晕等病证。同时又有很好的降压作用，可用于高血压病的辅助治疗。野菊花中的化学活性成分与其功效作用密切相关。其大多以适当形式吸收进入血液循环系统后，运送到相应的作用部位才能产生疗效。所以通过提取物指纹图谱与ロ服提取物后生物样品指纹图谱的比较分析，明确野菊花中的原型吸收成分作为检测具体成分，并结合野菊花总体成分指纹图谱综合进行质量控制，是创新性的检测和质控方法。
发明内容
本发明的目的是提供ー种野菊花提取物的制备方法，并运用HPLC指纹图谱的方法对其进行检测和质量控制。为实现此目的，一方面通过高效液相色谱(HPLC)指纹图谱进行多成分全面质量检测和控制，另ー方面通过中药代谢方法锁定原型吸收成分，进行具体成分的质量检测和控制，使野菊花的药效物质更加明确。为此，本发明第一方面提供了制备野菊花提取物的方法，其包括以下步骤将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；药再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收こ醇并浓缩、干燥，即得。根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，水的用量是药材重量的5-20倍，例如5-15倍，例如5-10倍。 根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，是以煎煮的方式提取。在一个实施方案中，煎煮的时间为30-120分钟，例如30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。根据本发明第一方面的方法，其中水提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-120分钟，例如60-120分钟，例如约100分钟。根据本发明第一方面的方法，其中加こ醇提取时，所用こ醇的量是水体积的1-2倍，优选I倍。根据本发明第一方面的方法，其中こ醇提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。本发明第二方面提供了ー种野菊花提取物，其是基本上按照本发明第一方面的方法提取得到的。本发明第二方面提供了ー种野菊花提取物，其是以野菊花为药材经如下步骤的方法提取得到的将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；再加入水体积1-3倍的95%こ醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收こ醇并浓缩、干燥，即得。根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，水的用量是药材重量的
5-20倍，例如5-15倍，例如5-10倍。根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，是以煎煮的方式提取。在一个实施方案中，煎煮的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中水提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-120分钟，例如60-120分钟，例如约100分钟。根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中加こ醇提取时，所用こ醇的量是水体积的1_2倍，优选I倍。根据本发明第二方面的野菊花提取物，其中こ醇提取时，是以回流的方式提取。在一个实施方案中，回流的时间为30-90分钟，例如30-60分钟，例如约45分钟。本发明第三方面提供了用指纹图谱方法检测野菊花药材或野菊花提取物的方法，该方法包括如下步骤(a)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)；(b)另取对照的野菊花药材或对照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照本发明第一方面所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述对照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)；(c)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析；(d)高效液相色谱条件为色谱柱为C18色谱柱，流动相为O. 1%的磷酸水溶液-乙腈；流速O. 8" . 2ml/min ;采用200_400nm波长紫外检测记录每一波长下成分响应值的方式
检测；梯度洗脱方式为
权利要求
1.制备野菊花提取物的方法，其包括以下步骤将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；再加入水体积1-3倍的95%こ醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收こ醇并浓缩、干燥，即得。
2.ー种野菊花提取物，其是基本上按照权利要求I所述的方法提取得到的。
3.—种野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤 (a)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)； (b)另取对照的野菊花药材或対照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述対照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)； (c)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析； (d)高效液相色谱条件为色谱柱为C18色谱柱，流动相为O.1%的磷酸水溶液-こ腈；流速O. 8" . 2ml/min ;采用200-400nm波长紫外检测记录姆一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为J 0min—>I 5min— lOmin^·ISniin->I 20mm—>25min— :乙腈 +: S%—: 5%^18%—18%—丨 25%一25%^30min^J 40mm^ιι 45min—^ι SOmin-^155min~^60mm 乙腈 3 %—55% 70%丨 75% 80%80% (e)吸取步骤(C)的供试品溶液和对照品溶液，分别将其注入高效液相色谱中，照(d)项所述色谱条件进行洗脱，分别得到供试品HPLC图和对照品HPLC图； (f)比较步骤(e)所得供试品HPLC图和对照品HPLC图。
4.ー种野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤 (i)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)； ( )另取对照的野菊花药材或対照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述対照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)； (iii)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析； (iv)高效液相色谱条件为色谱柱为C18色谱柱，流动相为O.1%的磷酸水溶液-こ腈；流速O. 8" . 2ml/min ;采用200_400nm波长紫外检测记录姆一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为
5.根据权利要求4所述的方法，其中 所述 C18 色谱柱是 Thermo scientific 0DS-2 Hypersil C18 色谱柱; 所述C18色谱柱是Thermo scientific 0DS-2Hypersil C18色谱柱，规格为4.6mmX 250mm, 5 μ m ； 其中(iv)项所述流动相的流速为I. Oml/min ； 其中(iv)项所述波长为267nm ； 其中(iv)项中所述色谱柱的柱温控制在30°C ;和/或 其中步骤(vii)中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴等。
6.ー种以原型吸收成分和/或代谢成分为指标的野菊花药材或野菊花提取物的指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤 (1)取供测试的野菊花药材或供测试的野菊花提取物，所述供测试的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述供测试的野菊花提取物，二者可称为供试品，或者可称为供试品提取物)； (2)另取对照的野菊花药材或対照的野菊花提取物，所述对照的野菊花药材照权利要求I所述方法处理得到野菊花提取物(由此获得的野菊花提取物或者前述対照的野菊花提取物，二者可称为对照品，或者可称为对照品提取物)； (3)分别精密称取供试品提取物和对照品提取物适量，用50-100倍体积的甲醇溶解，经O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液分别称为供试品溶液和对照品溶液，用于高效液相色谱(HPLC)分析； (4)高效液相色谱条件为色谱柱为C18色谱柱，流动相为O.1%的磷酸水溶液-こ腈；流速O. 8" . 2ml/min ;采用200-400nm波长紫外检测记录姆一波长下成分响应值的方式检测；梯度洗脱方式为
7.根据权利要求6的方法，其中 所述 C18 色谱柱是 Thermo scientific 0DS-2Hypersil C18 色谱柱; 所述C18色谱柱是Thermo scientific 0DS-2Hypersil C18色谱柱，规格为4.6mmX 250mm, 5 μ m ； 其中(4)项所述流动相的流速为lml/min ； 其中⑷项所述波长为267nm ;和/或 其中(4)项中所述色谱柱的柱温控制在30°C。
8.根据权利要求6的方法，其中步骤(7)中所述哺乳动物选自人、大鼠、小鼠、狗、猴等。
9.根据权利要求6的方法，其中步骤(7)中所述生物样品选自血样、尿样及唾液样品。
10.根据权利要求6的方法，其中步骤(10)中获得2个代谢成分；在ー个实施方案中，所述2个代谢成分的保留时间分别约为46. 56min和47. 90min。
全文摘要
本发明提供了一种野菊花提取物及其指纹图谱检测方法。具体地，制备野菊花提取物的方法包括以下步骤将野菊花药材粉碎；加入药材重量5-30倍的水提取30-120分钟；再加入水体积1-3倍的95%乙醇继续加热回流提取30-90分钟；提取液回收乙醇并浓缩、干燥，即得。还提供了由该方法制备得到的野菊花提取物，用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法，用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法，以及以原型吸收成分和/或代谢成分为指标用指纹图谱方法检测和评价野菊花药材或野菊花提取物的方法。本发明方法可以有效地用于野菊花或其提取物的质量控制。
文档编号G01N30/02GK102706978SQ20121017841
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者刘洋, 方敏, 李铮, 汪国鹏, 潘艳丽, 胡宇驰 申请人:北京市药品检验所