专利名称：一种增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种在植物体串连融合表达抗菌肽以提高抗菌肽表达丰度和稳 定性的技术，用于增强农作物抗病性。
背景技术：
抗菌肽是生物体防御系统中产生的一类对外源病菌具有高效杀灭活性的肽类物质，特别是一些动物来源的抗菌肽，如天蚕素(Cecropins)、蜂毒素 (Melittins)、蛙皮素(Magainins)等，对细菌、真菌、病毒、螺旋体等多种病 原菌甚至癌细胞都有一定的杀灭活性，而且长期使用不会使病原菌产生耐药性， 也不存在残留污染问题，是抗生素和化学杀菌剂的理想替代品。由于抗菌肽具有高效、环保、不使病源菌产生耐药性等优点，近年来，已成 为植物抗病基因工程、养殖饲料添加剂、新兴医药等领域的研究热点。特别是 在植物抗病基因工程领域，抗菌肽基因资源成为最有潜力和应用价值的资源之 一。然而，动物源抗菌肽基因转入植物后所遇到的主要问题就是抗菌肽表达丰 度偏低，限制了抗菌肽功效的发挥。虽然基因的转录后表达很复杂，与多种因 素有关，但这种动物源抗菌肽在植物细胞表达偏低的现象普遍认为主要是外源 抗菌肽在植物细胞不够稳定，容易被细胞内的蛋白酶降解的原因。1997年，Tailor等发现凤仙花(Impatiens balsamina L.)种子天然抗菌肽的 前体蛋白是由引导肽和连续6个长度为20个氨基酸的成熟肽单元串联融合组 成，各成熟肽单元之间由保守的蛋白酶剪切位点隔开，前体蛋白翻译后可在胞 间溶胶中自动剪切为各成熟抗菌肽单元。为了验证该剪切位点是否可以应用于 其它植物和其它抗菌肽，Francois等将由该剪切位点隔开的大丽花抗菌肽和萝卜 抗菌肽在拟南芥中融合表达，结果证明该凤仙花抗菌肽剪切位点完全可以在拟 南芥中发挥作用，大丽花抗菌肽和萝卜抗菌肽的融合蛋白被彻底切割为有功能活性的2个抗菌肽。与其它类型的蛋白质剪切位点相比，识别该位点的内肽酶 天然存在于植细胞胞间溶胶，前体蛋白切割完全，切割后成熟肽两端残留的剪 切位点的氨基酸少，对成熟肽的功能影响小。本发明利用了该内肽酶识别位点， 以Thanatin抗菌肽为例，设计了可自动剪切的抗菌肽基因多拷贝串联融合表达 技术，并结合其它外源蛋白增强表达技术，以增强抗菌肽在植物体内的表达丰 度和稳定性，提高作物抗病效果。发明内容本发明提供了一种增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方法，解 决了异源抗菌肽在植物体内表达丰度偏低，易被植物内源蛋白酶降解的问题。本发明的具体技术方案如下 一种通过多拷贝串联融合表达的原理来增强 抗菌肽在植物体内的表达丰度和稳定性的方法，包含以下步骤A)以特征序列为MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆几定质酶信号肽为引导肽，引 导目标蛋白定向积累于细胞壁和细胞间隙；B )以特征序列为 SNAADEVATPEDVEPG的多肽为连接肽，连接多个抗菌肽串联融合表达，表达 后于S丄NAADEVATPE丄DVEPG位点剪切为多个抗菌肽单元；C)根据目标植 物密码子使用频率对编码序列进行优化；D)将引导肽、抗菌肽、连接肽组合 成引导肽+抗菌肽+(连接肽+抗菌肽"N的结构形式将抗菌肽串联融合表达，提 高抗菌肽表达效率和稳定性，N为任意拷贝数。上述的多拷贝抗菌肽融合表达载体构建方法，包含以下步骤A)在引导 肽+抗菌肽的融合基因末端设计BglII+终止密码+Xbal或其它切点，克隆构建 Destination Vector, B)在连接肽+抗菌肽的融合基因头部加BamH I切点，尾部 加BglII+终止密码+Xba I或其它切点(同A步骤的末端设计)，克隆构建Entry Vector; C)将Entry Vector的目标序列用BamH I和Xba I切下，连接于Destination Vector用BglII和Xba I酶切产生的载体臂，以所得新的载体为 Destination Vector将Entry Vector目标片段反复连接进入Destination Vector,直至获得所需抗菌肽基因拷贝数。以下，对本发明的技术方案做出解释首先，根据目标植物密码子偏爱性设 计引导肽、抗菌肽和连接肽的密码子，再按引导肽+抗菌肽+(连接肽+抗菌肽^N 的方法设计多拷贝抗菌肽融合表达载体，然后利用分子克隆的方法构建含引导肽+抗菌肽单元的Destination Vector和含连接肽+抗菌肽单元的Entry Vector,将 Entry Vector中的目标片段切下反复连接进入Destination Vector即可获得多拷贝 抗菌肽融合表达载体，N次连接可获得N+1拷贝数抗菌肽基因融合表达载体。 利用该载体转化植物即可增强抗菌肽在目标植物内表达的丰度和稳定性，提高 植物抗病效果。这里引导肽来源于大豆几丁质酶信号肽，可以引导目标蛋白分 泌到细胞间隙和细胞壁周围，使抗菌肽在细胞外围高丰度积累以增强抗病效果。 连接肽来源于凤仙花抗菌肽前体肽剪切位点，可在植物体内将多拷贝融合表达 的抗菌肽剪切为多个抗菌肽单元。多拷贝抗菌肽融合表达载体构建方法，酶切 位点，及抗菌肽、引导肽、连接肽的氨基酸序列和编码序列详见附图1，其中， 抗菌肽序列为Thanatin所示部分，引导肽序列为SP所示部分，连接肽序列为 LP所示部分，对应的DNA编码序列是根据油菜密码子使用频率优化得来。本 发明的方法可应用于油菜、水稻、玉米、大豆、小麦等各种可转换植物的转基 因改良，提高其抗病能力。
图1~图3为可自剪切多拷贝Thanatin抗菌肽融合表达载体设计与构 建示意图；其中图1: Thanatin 1 5拷贝融合表达载体构建过程及最终载体结构； 图2: SP-Thanatin序列结构及分段合成示意图；图3: LP-Thanatin序列结构及 分段合成示意图。AFPV1 AFPV5为不同拷贝数抗菌肽融合表达的植物表达载 体。SP:大豆几丁质酶信号肽；LP:连接肽，来源于凤仙花，可被植物体内的
内肽酶识别，识别序列为S氺NAADEVATPE丄DVEPG; TMAS:甘露碱合成酶基 因的终止子；BAR:抗除草剂basta基因；PMAS:甘露碱合成酶启动子；P2X35S: 组成型表达强启动子；Q: TMV omega翻译增强序列；Toes:章鱼碱合成酶基 因的终止子；① (D:分段合成的基因片断01igo1 6。
具体实施方式
以抗菌肽Thanatin为例构建可剪切多拷贝抗菌肽融合表达载体。设计要点以凤仙花抗菌肽剪切位点为间隔序列，其氨基酸序列及剪切方式 为S丄NAADEVATPE;DVEPG，以大豆几丁质酶信号肽为引导序列，其序列特 征为MASERQALMLILL TTFF FTIKPSQA，将多拷贝抗菌肽融合表达产物导入 细胞间隙和细胞壁周围高丰度积累，再剪切为单个有活性的抗菌肽单元。该大 豆几丁质酶信号肽与GFP蛋白融合表达研究表明该信号肽可将目标蛋白特异性 导入细胞间隙和细胞壁。按附图1设计抗菌肽融合表达载体结构。融合表达的抗菌肽由一个引导肽， 5个Thanatin抗菌肽，和4个剪切肽组成，剪切肽分别位于5个抗菌肽之间， 使融合抗菌肽表达后得以剪切。融合表达载体由Destination Vector和Entry Vector两个载体经多次反复连接而来。前者克隆了引导肽和第一个抗菌肽基因。 后者克隆了剪切肽和后续抗菌肽基因。DestinationVector末端设计了 BamH I切 点，Entry Vector前端设计了BglII切点，两者为同尾酶，酶切后反复连接，即 可获得任意拷贝数的抗菌肽融合表达载体。融合表达载体结构设计好后，将氨基酸序列按油菜等双子叶植物密码子倾向 转换为适合油菜等双子叶植物表达的基因序列。并根据该序列分段合成基因片 段① ⑥。① ctgcagccatggcttctgagagacaggctcttatgcttatccttcttactactttcttct② acaggcttcttagatccagcctgagaaggcttgatagtgaagaagaaagtagtaaga
③ ggatctaagaagcctgttcctatcatctactgtaacagaagaactggaaagtgtcagaga④ gaattctctagactaagatctcattctctgacactttccag⑤ ggatccaacgctgctgatgaggttgctactcctgaggatgtt⑥ ggaacaggcttcttagatccaggctcaacatcctcaggagtag构建Destination Vector:将Oligo① ④用双蒸水稀释到10 |aM，分别 取Oligo① ④5 |iL、 0.2 uL、 0.2 fiL、 5 (iL， 25 mM Mg2+ 8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 iaL， 10 x PCR buffer 10 pL， Taq 5 U,加水到100 pL，进行PCR。PCR循环为94°C 5，， (94°C 30", 58°C 30", 72°C 30") x 10, (94°C 30"， 50°C 30", 72°C 30") x 20, 72°C 10，， 4°C~。 PCR产物于MicroconYM30过柱，浓縮于30 (iL，力B10UPstl、 10 U EcoR I 、 5 10 x Reaction Buffer于50 体系酶切3 h，再次用Microcon YM30过柱，浓縮于15 |iL。同时pUC18质粒用Pst I 、 EcoR I双酶切，上样于 1%的琼脂糖凝胶，电泳后回收目标带，取l pL载体与4 目标DNA连接后 转化大肠杆菌。构建Entry Vector:将Oligo③ ⑥用双蒸水稀释到10 pM，分别取Oligo ③ ⑥0.2nL、 5|aL、 5 4、 0.2 pL， 25 mM Mg2+8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 |iL, 10 xPCRbufferl0pL，Taq5U，力口水至Ul00iLiL,按上述同样方法进行PCR，产物 于1.5%的琼脂糖凝胶电泳后回收目标带，克隆于pMD18-T载体。挑取Destination Vector和Entry Vector克隆测序确认目标片段完全正确。 将Destination Vector用Bgl II和Xba I双酶切，Entry Vector用BamH I和 Xbal双酶切，0.8%凝胶电泳后回收目标片段连接。所得新载体反复如此酶切 连接，即可获得任意拷贝数抗菌肽基因融合表达的载体。将多拷贝抗菌肽融合表达的Destination Vector用Nco I和Xba I双酶切切 下目标片段，连接于植物表达载体，例如pFGC5941,即可获得可剪切多拷贝抗 菌肽融合表达载体。利用该载体转化植物，如拟南芥、油菜等，可显著提高抗 菌肽的表达丰度和体内存在的半衰期，提高植物抗病效果。如转化拟南芥后，拟南芥对菌核病的抗性大大提高，没有转化的拟南芥野生型ColO接种核盘菌 48h后叶片全部枯死，转基因拟南芥接种48h后只有约一半叶片枯死，这说明 经转化后的拟南芥对菌核病抗菌性能得到了大大的提高。采用本发明的方法转 化油菜后，油菜叶片接种菌核病菌丝块后病。
权利要求
1. 一种增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方法，包含以下步骤A)以特征序列为MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆几丁质酶信号肽为引导肽，引导目标蛋白定向积累于细胞壁和细胞间隙；B)以特征序列为SNAADEVATPEDVEPG的多肽为连接肽，连接多个抗菌肽串联融合表达，表达后于S↓NAADEVATPE↓DVEPG位点剪切为多个抗菌肽单元；C)根据目标植物密码子使用频率对编码序列进行优化；D)将引导肽、抗菌肽、连接肽组合成引导肽+抗菌肽+(连接肽+抗菌肽)*N的结构形式将抗菌肽串联融合表达，提高抗菌肽表达效率和稳定性，N为任意拷贝数。
2. 根据权利要求1所述的增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方 法，其特征在于所述的多拷贝抗菌肽融合表达包含以下步骤A)在引导肽+抗 菌肽的融合基因末端设计BglII +终止密码+Xbal或其它切点，克隆构建 Destination Vector, B)在连接肽+抗菌肽的融合基因头部加BamH I切点，尾部 加BglII+终止密码+Xba I或其它切点(同A步骤的末端设计)，克隆构建Entry Vector; C)将Entry Vector的目标序列用BamH I和Xba I切下，连接于 Destination Vector用BglII和Xba I酶切产生的载体臂，以所得新的载体为 Destination Vector将Entry Vector目标片段反复连接进入Destination Vector,直 至获得所需抗菌肽基因拷贝数。
全文摘要
本发明涉及一种增强抗菌肽在植物体内表达的丰度和稳定性的方法，属于生物技术领域，它通过设计了一种在植物体内可自动剪切的多拷贝抗菌肽串联融合表达技术，使多拷贝融合表达的抗菌肽在植物体内可自动剪切为有功能活性的单个抗菌肽单元，以增加抗菌肽表达丰度和抗菌肽的稳定性。
文档编号C12N15/62GK101397559SQ20071007159
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日
发明者刘仁虎, 刘智宏, 汪小福, 王伏林, 郎春秀, 陈笑芸, 陈锦清 申请人:浙江省农业科学院