专利名称：沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物活性检测和生物医药领域，具体涉及沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性检测方法及其应用，特别是涉及沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基活性的检测方法及其在制备具有抗氧化和清除自由基功能药物中的应用。
背景技术：
沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物是将沙门氏菌鞭毛蛋白的结构进行改造的产物，它是包括沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基的融合蛋白，可以含有或者不含有包括Tat蛋白转导肽在内的穿膜肽，沙门氏菌鞭毛蛋·白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基可通过柔性连接肽连接。美国 Cleveland BioLabs 公司率先制备得到((Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Anagonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primatemodels. Science2008, 320 (5873) :226-230)，命名为 CBLB502 蛋白，申请人在参考 CBLB502蛋白的制备路线基础上进行了部分结构的改造，完成了沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物的制备，命名为CZLC331。经比较，CBLB502和CZLC331两者之间存在微小的序列差异，主要是使用不同的原核表达载体制备时为了提高表达效率和纯化方便而将个别氨基酸进行了微小调整，两者在功能上基本上是一致的。目前已发现沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin的衍生物蛋白具有多种生物活性，例如CBLB502蛋白具有抗放射活性和抗肿瘤活性，CBLB502在放射损伤小鼠模型中对造血系统及胃肠道系统均表现出较显著的保护作用，能够延长高剂量(剂量为14-17Gy) Y射线照射后小鼠的生存时间，提高低剂量(剂量为10-13Gy) Y射线照射小鼠的生存率(BurdelyaLG,Krivokrysenko VI,et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotectiveactivity in mouse and primate models. Science2008，320 (5873) : 226-230)，这些生物活性的研究成果表明沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物具有重要的工业生产价值。Burdelya等在该文献中还公开了 CBLB502蛋白的制备方法,可以通过此方法获得原核表达的CBLB502蛋白，进一步为沙门氏菌鞭毛蛋白(Flage 11 in )衍生物的工业生产奠定了基础。然而，工业生产需要有相应的质量标准和质检体系支持，而目前对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的检测和控制，停留在蛋白的免疫活性(蛋白印迹检测)和蛋白含量的检测，而针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性，尤其是抗氧化和清除自由基活性，目前尚无相应的活性研究报告和合适的检测方法报道。自由基是机体正常代谢的中间产物(包括但不限于超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)。自由基在机体内具有很强的氧化反应能力，同时过量的自由基却又易于在机体内与各种生物大分子发生反应而导致细胞和组织氧化损伤。机体内过多的自由基是许多疾病产生的重要原因，因此清除过量自由基已成为防治多种疾病的重要方式。生理状态下，人体内自由基处于产生与清除的动态平衡中，而此平衡主要依靠机体内的抗氧化系统进行维持。机体内过多的自由基是产生氧化应激的重要因素，也是致病的重要原因，如免疫系统相关疾病、神经系统退行性疾病、肿瘤等，因此清除体内过多的自由基或防止过多自由基的产生已成为预防免疫系统、神经系统疾病的重要途径。目前，还没有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白CBLB502具有抗氧化和清除自由基活性的报道。由此，本发明的发明人在蛋白水平上对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性(尤其是抗氧化和清除自由基活性)进行系列深入研究，并将研究成果转化为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生产的质量标准和质检方法，对于后续工业生产中的质控要求具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度较高的从蛋白水平直接检测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生物活性的方法。本发明所提供的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法， 是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除ABTS自由基动力学和清除DPPH自由基的活性作为检测指标。具体而言，沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，主要是针对该蛋白总的抗氧化活性进行检测，使用ABTS法进行检测，可包括以下步骤沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和TODH自由基的活性作为检测指标，可包括以下步骤I)将待检沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果；所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白包括但不限于命名为CBLB502和CZLC331的蛋白。所述检测方法中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性进行检测，用ABTS法进行检测，包括以下步骤I)制作标准曲线按照ABTS检测方法制作ABTS浓度与吸光度A735的标准曲线；2)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成lmg/mL的样品溶液；3)根据标准曲线，按照样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，计算出样品的总抗氧化能力。具体来讲，所述ABTS法进行检测可包括以下过程I)样品检测①将IOmM Trolox 标准溶液稀释成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用双
蒸水把待测样品沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成lmg/mL溶液；
②取200 μ I ABTS工作液(ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制)，空白对照为 ο μ I双蒸水或PBS，标准曲线检测分别加入10 μ I各个浓度的Trolox标准溶液，样品检测加入10 μ I沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，轻轻混匀，室温孵育2_6
分钟后测定A735 ；③根据测定的空白对照和标准溶液的A735值，绘制出横坐标为溶液浓度、纵坐标为A735值的标准曲线，根据标准曲线和样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，进而用下述方法计算出样品的总抗氧化活性；2)计算样品总的抗氧化活性总抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作为标准品进行抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox等效的抗氧化能力，TEAC)来表示，计算公式为TEAC = Trolox等效摩尔浓度/样品浓度(mol/g)，TEAC值 即为总的抗氧化活性。设定所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性为>O. 05Torlox mmol/g为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有总的抗氧化活性的标准。所述检测方法中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基动力学活性进行检测，可包括以下步骤I)待测样品溶液准备将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成O. ImM的样品溶液；2)沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白动态清除ABTS自由基活性检测(I)试剂配制①将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时；②将工作母液用PBS或80%乙醇稀释50，62. 5，125，250，375倍成ABTS工作液；(2)测定样品的吸收峰向Eppendorf管中分别加入不同稀释倍数的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白对照组中加入O. 02mL双蒸水，然后迅速用美国Varian公司的Cary50UV-VIS测定340nm和415nm的吸光度，测定时间为Os (未加入样品前)和30s，记录不同稀释倍数的ABTS工作液中各个时间点的吸光值(A34tl和A415)；(3)计算清除自由基动力学的最大反应速率通过吸光值A34tl (或A415)与物质的量浓度M换算的标准公式(M = A34tl (或A415) /ε 340 (或ε 4is))计算得到反应后的物质的量浓度M(mol/L),其中，ε 340=4· 8X IO4(mol/LrW，ε415 = 3. 6X IO4 (mol/L)'nr1)。该蛋白清除ABTS自由基的动力学参数为最大反应速率Vmax，可通过通用的Hill方程计算不同稀释倍数的ABTS工作液在反应后自由基的浓度M得到。设定所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除ABTS自由基动力学的标准为2 μ M的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基最大反应速率>0. 3 μ M · s、所述检测方法中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除DPPH自由基的活性进行检测，可包括以下步骤I)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的样品溶液；用分析纯级的甲醇将将DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六个离心管分别标号，加入等体积470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分别依次加入上述不同浓度的沙门氏菌鞭毛蛋白Fl age 11 in衍生物蛋白溶液,室温下反应5min后于517nm处测定其吸光度，其值分别为空白对照Atl、和样品A1 ；3)计算清除羟自由基活性按下式计算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X100%o设定所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白对DPPH自由基清除率>1. 5%·为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除羟自由基活性的标准。本发明另一方面在于提供所述方法在对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在蛋白生物活性的跟踪，沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生产制备、储存、运输过程中沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的活性确认，以及含有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白的生物制品的活性检测中的应用。本发明还一方面在于提供包括CBLB502蛋白和CZLC331蛋白在内的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在制备具有抗氧化和清除自由基功能药物中的应用，所述具有抗氧化和清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的免疫系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病等弓I起机体自由基增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产品。本发明提出了包括CBLB502、CZLC331等在内的鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法及其用途，该检测方法包括1)将待检鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力，以该蛋白总的抗氧化活性、该蛋白清除自由基动力学以及该蛋白对DPPH自由基的清除率作为检测指标；3)计算出检测数据并与该蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在对鞭毛蛋白Flagellin衍生物本身以及含有鞭毛蛋白Flagellin衍生物的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图I为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的296个氨基酸序列和331个氨基酸序列的序列比对结果图2为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白总的抗氧化活性的检测
结果图3为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白对ABTS自由基清除的动力学图4为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白对DPPH自由基清除结果
具体实施例方式本发明提供了一种灵敏度较高的从蛋白水平直接检测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物生物活性的方法。本发明中，沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物包括已有文献记载的CBLB502等蛋白，申请人制备的CZLC331蛋白以及其它类似结构的蛋白，下文中统称“蛋白”或“该蛋白”。本发明所提供的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过该蛋白的抗氧化、清除自由基和清除自由基的动力学特征进行体现，以该蛋白总的抗氧化活性、清除ABTS自由基动力学和清除DPPH自由基的活性作为检测指标，可包括以下步骤I)将待检的蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与该蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果。第一方面，蛋白的生物活性检测方法中，针对其总的抗氧化活性进行检测，用ABTS法进行检测。ABTS法测定总抗氧化能力的原理ABTS(2，2，-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6_sulfonic acid,中文为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制，在735nm测定ABTS+的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。TioIox (奎诺二甲基丙烯酸酯)是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参考。例如，TioIox的总抗氧化能力为I，相同浓度情况下，其它物质的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍数来表示。因此针对该蛋白总的抗氧化活性用ABTS法进行检测可包括以下步骤I)制作标准曲线按照ABTS检测方法制作ABTS浓度与吸光度A735的标准曲线；2)将待测蛋白样品配成lmg/mL的样品溶液；3)根据标准曲线，按照样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，进而计算出样品的总抗氧化能力。其中，步骤I)和2)用于样品的测定，可按以下过程操作①将IOmM Trolox 标准溶液稀释成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用双
蒸水把待测样品蛋白配制成lmg/mL溶液；②取200 μ I ABTS工作液(配方将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时，将工作母液用PBS或80%乙醇稀释125倍成ABTS工作液)，空白对照为10 μ I双蒸水或PBS，标准曲线检测分别加入10 μ I各个浓度的Trolox标准溶液，样品检测加入10 μ I蛋白溶液，轻轻混匀，室温孵育2-6分钟后测定A ·
λ735 ③根据测定的空白对照和标准溶液的A735值，绘制出横坐标为溶液浓度、纵坐标为A735值的标准曲线，根据标准曲线和样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度。进而用步骤3)的下述过程计算出样品的总抗氧化活性①总抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作为标准品进行抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力可以用 Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox 等效的抗氧化能力，TEAC)来表示，对于具有抗氧化活性的蛋白或抗氧化剂样品，如样品的浓度为O. 15mg/mL，测定获得的摩尔浓度和O. 3mM Trolox相同，则样品的抗氧化活性为
O.3mM/0. 15mg/mL=2mmol/g,即计算公式为TEAC = Trolox等效摩尔浓度/样品浓度(mol/g);②按上述公式计算，TEAC值即为样品总的抗氧化活性。第二方面，该蛋白的生物活性检测方法中，针对其对ABTS自由基清除的动力学， 可包括以下步骤I)待测样品溶液准备将待测的蛋白样品配成O. ImM的样品溶液；2)蛋白动态清除ABTS自由基活性检测(I)试剂配制①将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时；②将工作母液用PBS或80%乙醇稀释50、62· 5,125,250,375倍成ABTS工作液；(2)测定样品的吸收峰向Eppendorf管(微量离心管)中分别加入不同稀释倍数的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白对照组中加入O. 02mL双蒸水，然后迅速用美国Varian公司的Cary50UV-VIS测定340nm和415nm的吸光度，测定时间为Os (未加入样品前)和30s，记录不同稀释倍数的ABTS工作液中各个时间点的吸光值(A34tl为反应产物吸收峰值和A415为自由基吸收峰值);(3)计算清除自由基动力学的最大反应速率通过吸光值与物质浓度换算的标准公式ε 34(l=4. 8 X IO4IT1Cnr1和ε 415=3. 6 X IO4M-1CnT1计算得到反应后的浓度(浓度=A340 (或A415) / ε 340 (或ε 415))，式中，ε 340和ε 415表示340nm和415nm处的吸光度,M表示物质的量浓度(mol/L), cm表示厘米。该蛋白清除ABTS自由基的动力学参数(最大反应速率Vmax通过Hill方程计算不同稀释倍数的ABTS工作液在反应后自由基的浓度得到出)，计算得到的反应速率即为待测样品清除ABTS自由基动力学活性的数值。第三方面，该蛋白的生物活性检测方法中，针对其清除DPPH自由基的活性进行检测，可包括以下步骤I)待测样品溶液准备将待测的蛋白样品配成10、25、50、75、100、125μ g/mL的样品溶液，用分析纯级的甲醇将将DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六个离心管分别标号，加入等体积470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分别依次加入上述不同浓度的蛋白溶液，室温下反应5min后于517nm处测定其吸光度，其值分别为空白对照Atl和样品A1 ；3)计算清除羟自由基活性按下式计算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X 100%
以上三种检测方法中，将该蛋白总的抗氧化活性>0. 05Trolox mmol/g作为产品具有总的抗氧化活性的指标；以2 μ M的该蛋白清除ABTS自由基最大反应速率>0. 3 μ M · s—1作为产品清除ABTS自由基动力学活性的指标；3 μ g/mL的该蛋白清除DPPH自由基的比率>1.5%作为产品具有DPPH自由基清除活性的指标。对于被检测的蛋白产品，可以选用其中的任意一项作为检测指标，只要有一项检测指标达标的产品即可认为其具有清除自由基活性，作为合格产品，并可进一步用于制备具有清除自由基功能的药物的活性成分。上述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的生物活性检测方法在对该蛋白生物活性的跟踪，蛋白生产制备、储存、运输过程中对该蛋白的活性确认，含有该蛋白的生物制品的活性检测，以及在建立该蛋白质量标准和质检体系中的应用也属于本发明的保护范围。经本发明证实,沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有抗氧化和清除自由基功能，因而可以其为活性成份制备具有抗氧化和清除自由基功能的药物。所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白优选为通过生物工程发酵得到的CZLC331蛋白。 所述具有抗氧化和清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的免疫系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病等引起机体自由基增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产品。本发明用实施例来进一步从清除自由基能力角度对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生物活性进行检测来说明本发明，以下实施例以发明人制备的CZLC331蛋白为例进行说明，但本发明的保护范围并不限于下述实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I、沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的制备I、构建沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的原核表达载体pET28b-Tat-CZLC331I)沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白编码基因的人工合成沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的编码基因是通过柔性臂将沙门氏菌鞭毛蛋白的编码序列自5’端第1-528位碱基和自5’端第1206-1515位碱基连接得到的(分别对应沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基)，其核苷酸序列如序列表中序列I所不，长度为891bp (为编码CZLC331蛋白的核心蛋白序列)，蛋白序列如序列表中序列2所示(由296个氨基酸组成，为CZLC331蛋白的核心蛋白序列)，由北京博迈德科技发展有限公司公司合成。合成基因的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明获得了 891bp的目的基因，与预期结果相符。2)重组表达载体pET28b-Tat_CZLC331的构建a) PCR扩增沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白编码基因采用常规PCR的方法扩增出891bp的沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白编码基因，50 μ I PCR反应体系为质粒模板(携带沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白编码基因的克隆载体PGH-CZLC3 31，构建方法为将化学法合成的CZLC3 31蛋白编码基因插入克隆载体PGH (购自北京博迈德科技发展有限公司)的SmaI酶切位点获得)O. 5 μ 1，ΙΟΧ ΝΤΡδμ Ι,ΙΟΧΕχ Taq缓冲液5 μ 1，上、下游引物(上游引物序列为5’ -CGCGGGATCCATGGCTCAGGTTATCA-3’，下游引物序列为
5，-CCGCTCGAGTGCGTCGTCTCTGTCTTG-3，)各 0· 5 μ I，Ex Taq 酶 0· 25 μ I，ddH2038. 25 μ I ；PCR 反应条件为先 95°C 4 分钟；然后 95°C 45 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒，共30个循环；最后72 °C 7分钟。反应结束后，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经扩增获得了 891bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段。b)限制性内切酶分别酶切目的基因CZLC331和pET28b_Tat载体分别对沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白编码基因和pET28b_Tat载体(构建方法见下面)用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，然后在16°C采用T4DNA连接酶连接过夜并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中。pET28b_Tat载体构建方法为首先通过化学合成的方法合成含有酶切位点为NcoI (上游)和NdeI (下游)的双链TAT核心序列，然后采用限制性内切酶NcoI和NdeI双酶切TAT核心片段和载体pET28b，回收目的片段后经T4DNA连接酶连接及酶切鉴定，最后送英骏公司直接测序确证含有TAT核心片段的原核表达载体pET28b-Tat构建正确，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，长度为996bp，编码蛋白序列如序列表中序列4所示(序列3长度为996bp的DNA序列的编码蛋白序列，由331个氨基酸·组成，即CZLC331蛋白的氨基酸序列，CZLC331因此命名)，不含TAT核心片段的CZLC331蛋白序列(序列2)和含TAT核心片段的CZLC331蛋白序列(序列4)的序列比对结果如图I所示，相对于序列2而言，序列4的氨基端增加了 TAT穿膜肽序列，羧基端增加了 6个组氨酸和个别氨基酸。c)鉴定将培养后生长出的克隆分别通过限制性内切酶酶切及测序鉴定，获得序列及插入位置均正确的原核表达载体，命名为pET28b-Tat-CZLC331。2、转化宿主大肠杆菌及菌体复苏将步骤I构建正确的原核表达载体pET28b-Tat-CZLC331转化大肠杆菌BL21 (DE3)并涂布至LB平皿，待长出克隆，各组分别挑取一个克隆接种到5mL含有Kana+(终浓度100 μ g/mL)的LB培养基中，37°C、220rpm摇菌约16小时，待菌体完全复苏。3、原核表达载体pET28b-Tat_CZLC331的诱导表达将复苏的菌液稀释至0D600=0. 8，然后吸取5mL菌液接种到150mL含有Kana+(终浓度100 μ g/mL)的LB培养基中，37 °C、220rpm摇菌约4-5小时后测定0D600，待0D600=0. 6-1. O时迅速加入诱导剂IPTG (终浓度ImM)，并于30°C、220rpm诱导表达8小时。4、沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白样品的制备上述诱导表达菌液于4°C、12000rpm离心10分钟以收集菌体，采用20mM磷酸钠缓冲液稀释样品后超声破碎，制备CZLC331蛋白样品，留取上清液待分离纯化。5.沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的分离、纯化将步骤4制备的上清液采用初始缓冲液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl, pH7. 4)平衡后直接上样至平衡好的HisTrap HP5mL柱(购自GE公司)，然后采用4_5个柱体积的上述缓冲液冲洗柱子至洗脱峰基线，最后采用洗脱缓冲液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl+0. 5M咪唑，pH7. 4)洗脱蛋白样品，脱盐后得到沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物，命名为CZLC331蛋白，纯度达95%以上。经鉴定，其氨基酸序列与沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基相同。实施例2、沙门氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物CZLC331蛋白总的抗氧化活性检测
用ABTS法进行检测，可包括以下步骤I、试剂配制(1)CZLC331蛋白样品溶液制备在按实施例I方法已制备的CZLC331蛋白样品基础上，用双蒸水将CZLC331蛋白配制成lmg/mL样品溶液。(2)对照品维生素C(Vc)、还原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶液的制备同CZLC331蛋白制备,称取对照品IOmg,用双蒸水将其配制成lmg/mL的对照品溶液。2、总的抗氧化活性检测①将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时；②将工作母液用PBS或80%乙醇稀释125倍成ABTS工作液；③将IOmM Trolox 标准溶液稀释成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用双蒸水把待测样品CZLC331蛋白、Vc、GSH和NAC配制成lmg/mL溶液；④取 200 μ I ABTS 工作液；⑤空白对照中加入10 μ I双蒸水或PBS，标准曲线检测加入10 μ I各种浓度的Trolox标准溶液，样品检测加入10 μ I各种浓度的样品，轻轻混匀。⑥室温孵育2-6分钟后测定A735。⑦根据测定标准溶液得到的A735值，绘制出横坐标为溶液浓度、纵坐标为A735值的标准曲线；⑧根据标准曲线，按照样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，进而计算出样品的总抗氧化能力。⑨总抗氧化能力的表示方式在采用Trolox作为标准品进行抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力可以用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)来表示。对于具有抗氧化活性的蛋白或抗氧化剂，如样品的浓度为O. 15mg/mL，测定获得的摩尔浓度和O. 3mM Trolox相同，贝U样品的抗氧化能力为O. 3mM/0. 15mg/mL=2mmol/g,即计算公式为TEAC = Trolox等效摩尔浓度/样品浓度(mol/g)。⑩按同样方法进行对照品的检测与计算。检测结果参见图2，结果显示，CZLC331蛋白具有一定的抗氧化活性，lmg/mL样品溶液总的抗氧化活性>0. 0951Trolox mmol/g。实施例3、沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白对ABTS自由基清除的动力学测定CZLC331蛋白对ABTS自由基清除的动力学，具体方法可包括以下步骤I)待测样品溶液准备将待测CZLC331蛋白样品配成O. ImM的样品溶液；2)CZLC331蛋白动态清除ABTS自由基活性检测(I)试剂配制①将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时；②将工作母液用PBS或80%乙醇稀释50、62. 5,125,250,375倍成ABTS工作液；(2)测定样品的吸收峰
向Eppendorf管(微量离心管)中分别加入不同稀释倍数的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白对照组中加入O. 02mL双蒸水，然后迅速用美国Varian公司的Cary50UV-VIS测定340nm和415nm的吸光度，测定时间为Os (未加入样品前)和30s，记录不同稀释倍数的ABTS工作液中各个时间点的吸光值(A34tl和A415)；(3)计算清除自由基动力学的最大反应速率通过吸光值A34tl (或A415)与物质的量浓度M换算的标准公式(M = A34tl (或A415) /ε 340 (或ε 4is))计算得到反应后的物质的量浓度M(mol/L),其中，ε 340=4· 8X IO4(mol/Lr1CnT1, ε415=3· 6 X IO4(In0VLr1cnT1)tj该蛋白清除ABTS自由基的动力学参数为最大反应速率Vmax，可通过通用的Hill方程计算不同稀释倍数的ABTS工作液在反应后自由基的浓度M得到。检测结果参见图3，表明在CZLC331蛋白浓度不变的情况下，随着ABTS自由基浓 度不断增加，ABTS自由基消耗速率也在不断增加。通过该图数据利用Hill方程计算得出ABTS自由基清除的最大反应速率，结果为O. 3665 μ M/s,反映出CZLC331蛋白在测定浓度范围内对自由基有较强的清除能力。实施例4、沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白清除DPPH自由基活性检测采用DPPH比色法对CZLC331蛋白清除羟自由基的活性进行测定，DPPH溶解在甲醇溶液中，通过检测517nm吸收峰的浓度可得到CZLC331蛋白对DPPH自由基的清除作用，具体可包括以下步骤I)将待测CZLC331蛋白样品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的样品溶液，以Vc,NAC (N-乙酰半胱氨酸)和GSH (还原型谷胱甘肽)为对照；用分析纯级的甲醇将将DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六个离心管分别标号，加入等体积470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分别依次加入上述不同浓度的CZLC331蛋白溶液，室温下反应5min后于517nm处测定其吸光度，其值分别为Atl (空白对照)、和仏(样品)；3)计算清除羟自由基活性按下式计算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X 100%检测结果参见图4，结果表明，在3 μ g/mL终浓度下，CZLC331蛋白清除DPPH自由基的活性为2. 35%，但与Ne、NAC和GSH相比较，其清除能力稍弱。实施例5、不同批次CZLC331蛋白产品的生物活性检测I)样品准备针对不同批次的CZLC331蛋白产品，用双蒸水将CZLC331蛋白产品配制成3mg/mL的浓度，后续根据需求进行不同浓度的稀释(参见表I);2)所需试剂及仪器试剂所用试剂参照实施例2-4中的方法进行配制；仪器具有检测使用波段的紫外分光光度计，如Cary50UV_VIS ；3)检测操作过程参照实施例2-4的具体操作步骤进行测定；4)结果及评价标准表I不同批次CZLC331蛋白产品的生物活性检测结果
权利要求
1.沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和I3DDH自由基的活性作为检测指标，可包括以下步骤 1)将待检沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液； 2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力； 3)计算出检测数据并与沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果； 所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白包括但不限于命名为CBLB502和CZLC331的蛋白。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于其中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性进行检测，用ABTS法进行检测，包括以下步骤 1)制作标准曲线按照ABTS检测方法制作ABTS浓度与吸光度A735的标准曲线； 2)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成lmg/mL的样品溶液； 3)根据标准曲线，按照样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，计算出样品的总抗氧化能力。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于具体来讲，所述ABTS法进行检测可包括以下过程 1)样品检测 ①将IOmMTrolox标准溶液稀释成0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8和I. OmM ;用双蒸水把待测样品沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成lmg/mL溶液； ②取200μ I ABTS工作液(ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM 28mM终浓度配制)，空白对照为10 μ I双蒸水或PBS，标准曲线检测分别加入10 μ I各个浓度的Trolox标准溶液，样品检测加入10 μ I沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，轻轻混匀，室温孵育2_6分钟后测定A735 ； ③根据测定的空白对照和标准溶液的A735值，绘制出横坐标为溶液浓度、纵坐标为A735值的标准曲线，根据标准曲线和样品的A735值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，进而用下述方法计算出样品的总抗氧化活性； 2)计算样品总的抗氧化活性 总抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作为标准品进行抗氧化能力检测时，样品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox等效的抗氧化能力，TEAC)来表示，计算公式为TEAC = Trolox等效摩尔浓度/样品浓度(mol/g)，TEAC值即为总的抗氧化活性。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性为> O. 05Torlox mmol/g为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白具有总的抗氧化活性的标准。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于其中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基动力学活性进行检测，可包括以下步骤 I)待测样品溶液准备将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成O. ImM的样品溶液； 2)沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白动态清除ABTS自由基活性检测 (1)试剂配制 ①将ABTS与氧化剂K2S2O8按7mM28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12-16小时; ②将工作母液用PBS或80%乙醇稀释50，62.5，125，250，375倍成ABTS工作液； (2)测定样品的吸收峰 向Eppendorf管中分别加入不同稀释倍数的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白对照组中加入0.02mL双蒸水，然后迅速用美国Varian公司的Cary50UV-VIS测定340nm和415nm的吸光度，测定时间为Os (未加入样品前)和30s，记录不同稀释倍数的ABTS工作液中各个时间点的吸光值(A34tl和A415)； (3)计算清除自由基动力学的最大反应速率 通过吸光值A34tl (或A415)与物质的量浓度M换算的标准公式(M = A34tl (或A415)/ ε 34(| (或ε 4 5))计算得到反应后的物质的量浓度M(mol/L),其中，ε 34(l=4. 8X IO4 (mol/L)_1cm_1,ε 415=3. 6X IO4(In0VLr1cnT1)tj该蛋白清除ABTS自由基的动力学参数为最大反应速率Vmax，可通过通用的Hill方程计算不同稀释倍数的ABTS工作液在反应后自由基的浓度M得到。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除ABTS自由基动力学的标准为2 μ M的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基最大反应速率>0. 3μΜ· s'
7.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于其中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除DPPH自由基的活性进行检测，可包括以下步骤 1)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的样品溶液；用分析纯级的甲醇将将DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液； 2)六个离心管分别标号，加入等体积470μ I的DPPH自由基溶液，然后分别依次加入上述不同浓度的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液,室温下反应5min后于517nm处测定其吸光度，其值分别为空白对照Atl、和样品A1 ； 3)计算清除羟自由基活性按下式计算DPPH自由基清除率 DPPH 清除比率=(I-A1A0) X 100%。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白对DPPH自由基清除率>1. 5%为沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除羟自由基活性的标准。
9.权利要求1-8任一项所述方法在对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在蛋白生物活性的跟踪，沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生产制备、储存、运输过程中沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的活性确认，以及含有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性检测中的应用。
10.包括CBLB502蛋白和CZLC331蛋白在内的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在制备具有抗氧化和清除自由基功能药物中的应用，其特征在于所述具有抗氧化和清除自由基功能的药物包括治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病的候选药物，治疗氧化应激诱导的免疫系统疾病中的药物，治疗氧化应激诱导的多种免疫系统疾病等引起机体自由基 增加的相关疾病的药物，还包括它们的医药产品。
全文摘要
本发明公开了沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法及其用途，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和PDDH自由基的活性作为检测指标。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白本身以及含有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，应用前景广阔。
文档编号G01N21/31GK102866119SQ20121023278
公开日2013年1月9日 申请日期2012年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者张成岗, 李伟光, 吴永红, 李军怀, 高艳, 李志慧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 苏州科景生物医药科技有限公司