专利名称：一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体是基于金杂化的介孔二氧化硅纳米复合材料制备的无标记型电化学免疫传感器，用于测定水及食品中的环境雌激素，属于电化学检测技术领域。
背景技术：
环境雌激素(EEs)属于环境内分泌干扰物，是一类进入人体后会产生类似于雌激素作用的环境毒素。这类毒素会干扰我们的内分泌系统，造成内分泌紊乱，从而带来一系列的健康问题。环境雌激素的来源很多，在日常生活中无处不在。常见的有塑料包装的食品、洗发水、沐浴露等日化用品，鱼、虾、贝类等水产品、海产品以及饲料添加激素喂养的鸡、甲鱼、黄鳝等。环境雌激素物质进入人体后，影响性激素的正常工作，出现各种机能障碍，甚至 引起器官病变，严重影响健康。因此，对环境雌激素污染物的检测显得尤为重要。目前国内外报道的用于环境雌激素污染物检测的方法很多，主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、电化学分析法等。大多数检测方法复杂、费时费力，需要昂贵的仪器和经过严格训练的检验人员。已有的部分环境雌激素的电化学检测法虽然电极修饰过程简单，重现性好，灵敏度高，但其特异性差。因此，制备高灵敏、特异性环境雌激素电化学免疫传感器已迫在眉睫。近年来，纳米材料在单分子水平的各种探针技术、纳米集成阵列器件、电极表面修饰等方面的研究取得了突飞猛进的发展。其中，将纳米材料引入电极表面，能有效的增加电极的比表面积，固载更多的抗体或酶等生物大分子，从而改善电子的传递，增强传感器的灵敏度和稳定性，提高传感器的响应速度。纳米介孔二氧化硅(SBA-15)材料具有比表面积大、孔径较大、生物相容性较好等优点，能有效地固载抗体，增强体系的灵敏度，是制备免疫传感器的良好材料。金纳米粒子具有比表面积大、表面活性位点多、催化效率高、吸附能力强等特点。氯金酸在SBA-15的孔道中经过原位还原得到金杂化的介孔二氧化硅纳米复合材料(Au@SBA-15)，两种材料的协同作用显著提高了电子的传递效率，可成功用于免疫传感器的制备。免疫传感器是一种将分析化学与免疫学技术相结合而发展起来的具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器。它是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理来检测或计量化合物的装置，通常由分子识别部分(敏感元件)和转换部分(换能器)组成。电化学免疫传感器是生物传感器领域中研究较多的一种类型，因其具有结构简单，操作简便，灵敏度高，选择性好，易于小型化，可连续、实时、快速自动化检测分析等优点而被广泛研究。经对现有技术文献的检索发现，目前CN101059480A公开了一种玻碳电极修饰的电化学检测方法，该发明的特异性低于电化学免疫方法。CN102262125A公开了一种检测己烯雌酚的电化学免疫传感器的制备方法及应用，该发明是一种竞争型免疫传感器，其电极表面修饰过程较为复杂。CN101995462A公开了一种检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器，该发明是一种夹心型免疫传感器，其灵敏度高、特异性强，但因采用酶标抗体，与无标记型传感器相比，制备过程较为复杂，且易使部分抗体和酶失活。本发明采用纳米复合材料制备的无标记型电化学免疫传感器，是一种制备简单、低成本、高灵敏、特异性好、快速检测多种环境雌激素的方法，有效地克服了目前检测环境雌激素方法的不足。
发明内容
本发明的技术任务之一是为了克服现有检测环境雌激素技术中的不足，如仪器复杂、成本高、检测过程繁琐等缺点，提供一种高灵敏、特异性环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法，其制备技术成熟可靠；本发明的技术任务之二是提供该电化学免疫传感器的应用，所述电化学免疫传感器能高灵敏、特异性、低成本、快速检测多种环境雌激素。本发明的一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下(I)用壳聚糖(Chit)溶液分散石墨烯(GS)，超声至形成分散均匀的石墨烯-壳聚糖溶液(GS-Chit)；
所述的分散均勻的GS-Chit, GS浓度为0. 5 I. 5mg mL—1, Chit的浓度为I. 0
3.Omg mL 1 ；(2)用原位还原法将氯金酸在介孔二氧化硅(SBA-15)的孔道中还原，得到金杂化的二氧化硅纳米复合材料(Au@SBA-15)；所述的氯金酸和SBA-15的质量比为I : 0. 5 I. 5 ;(3)将交联剂戊二醛、AuiSBA-15溶液、环境雌激素抗体(Ab)均匀混合，制备成纳米复合材料与抗体的混合液(Au@SBA-15-Ab)；所述的交联剂戊二醛的质量分数为2. 5% ;所述的Au@SBA-15 溶液浓度为 3. 5mg mL 1 ；所述的环境雌激素抗体浓度为I. Omg mL—1 ；所述的交联剂戊二醛、Au@SBA-15溶液、环境雌激素抗体的体积比为I : I. 5
2.5 I 3 ;所述的Au@SBA-15-Ab是将交联剂戊二醛、AuiSBA-15溶液、环境雌激素抗体(Ab)放在振荡器上振荡10 30h后离心洗涤，用pH为6. 8 7. 8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释得到。(4)利用电极表面自组装技术将GS-Chit和Au@SBA-15-Ab修饰在电极表面；所述的GS-Chit和Au@SBA-15-Ab修饰到电极表面，包括以下步骤I)依次用不同粒径的三氧化二铝抛光粉抛光处理直径为4mm的玻碳电极，用乙醇超声处理，然后将电极置于铁氰化钾溶液中，在-0. 6 0. 6V扫描，峰电位差小于IOOmV,吹干待用；2)将制备的分散均匀的GS-Chit滴涂到电极表面，室温晾干；3)将戊二醛滴涂到步骤2) GS-Chit修饰的电极表面，湿润保持lh，水冲洗，去掉多余的戊二醛；4)将制备的Au@SBA-15-Ab混合均匀后滴涂到步骤3)戊二醛修饰的电极表面，湿润条件下晾干；(5)将浓度为100 u g mr1的牛血清白蛋白(BSA)滴涂在步骤4) AuiSBA-15-Ab修饰的电极表面，湿润保持Ih后用水冲洗掉多余的BSA，置于4°C下保存待用，制备成无标记型电化学免疫传感器。按照以上方法制备的电化学免疫传感器，以Au@SBA-15纳米复合材料作为修饰材料，既具备金纳米粒子与SBA-15两者的优点，又能起到协同增效作用。如SBA-15比表面积大、生物相容性好、固载更多抗体，其介孔结构能很好的保护抗体的生物活性；金纳米粒子催化活性强，能进一步提高电子传递效率等，进而显著改善传感器的灵敏度。以上所述的一种环境雌激素电化学免疫传感器，用于环境雌激素检测，步骤如下(I)将制备好的电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为辅助电极，组成三电极系统，结合电化学工作站CHI760D，在5mmol L—1铁氰化钾溶液中，用方波伏安法(SWV)在-0. 6 0. 6V电压范围内测定，记录响应电流I。；(2)用水冲洗上述电极，将配制好的位于线性范围中不同浓度的环境雌激素标准溶液分别滴涂到不同电极表面，反应I. 5h ;(3)分别将步骤⑵修饰的电极执行步骤⑴所述的测定过程，此时的响应电流记为Ii ;(4)根据上述步骤(I)和步骤(3)所得的电流差值A I = I0-Ii与环境雌激素标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线；(5)将步骤(2)中的标准溶液更换为被检测的样品溶液，重复步骤(2)和步骤
(3)，根据滴涂样品溶液前后响应电流的变化值Al和工作曲线，得到样品溶液中某种环境雌激素的含量。上述的环境雌激素为雌二醇、雌三醇、己烯雌酚或炔诺酮。与现有技术相比，本发明的一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用，其突出的特点是(I)将纳米介孔材料和贵金属纳米粒子引入到电化学免疫传感器的制备中，有效的提高了环境雌激素电化学免疫传感器的灵敏度和生物相容性；(2)利用纳米材料掺杂技术，在介孔内用化学原位还原法实现纳米粒子的尺寸和位置的可控合成，进而将生物活性物质固载到介孔内的纳米粒子表面，能更好的保持其生物活性，提高传感器的再生性；(3)利用电极表面的层层自组装技术及交联剂的作用，将导电材料石墨烯和纳米复合材料牢固的修饰在电极表面，防止检测过程中造成的脱落；(4)使用完全相同的材料和修饰方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变抗体种类即可实现多种环境雌激素的高灵敏、特异性检测，此方法简单、经济，有利于促进传感器的商品化。(5)本发明制备的电化学免疫传感器用于环境雌激素的检测，试剂用量少，检测速度快，直接将检测液修饰到电极表面，便于检测。
图I为本发明制备的SBA-15的透射电镜图。图2为本发明制备的Au@SBA-15的透射电镜图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 实施例I(I)称取0. 5mg石墨烯,加入到浓度为I. Omg 的壳聚糖溶液中，超声30min至分散均匀，制得分散均匀的0. 5mg mL—1石墨烯-壳聚糖溶液(GS-Chit)；(2)称取15mg SBA-15，加入到3mL浓度为IOmg 1171的氯金酸(HAuCl4)中，用水稀释至40mL,密封条件下搅拌20h,以6000r mirT1的转速离心15min,弃上清液。然后逐滴加入Immol L—1的硼氢化钠直到溶液颜色不再发生变化，搅拌lOmin，离心洗涤，室温真空干燥，得到粉末状的Au@SBA-15 ；(3)取步骤(2)中粉末状的Au@SBA-15，用水稀释为3. 5mg m^1的Au@SBA_15溶液，分别取500 u L质量分数为2. 5%的戊二醛，750 u L浓度为3. 5mg mL—1的Au@SBA_15溶液和1000 u L浓度为I. Omg mL—1的Ab于4mL离心管中，4°C下振荡IOh以孵化抗体，离心弃上清液，用PH为6. 8的PBS重复离心洗涤2次后，再用pH为6. 8的PBS稀释至lmL，得到AuOSBA-I5-Ab。(4)电化学免疫传感器的制备，具体步骤如下I)将直径为4mm的玻碳电极依次用I. 0、0. 3和0. 05 y m的三氧化二铝抛光粉抛光处理，使其成镜面，用水冲洗后在乙醇中超声lmin，用5mmol L—1的铁氰化钾在-0. 2 0. 6V扫循环伏安，氧化还原峰电位差为90mV，用水冲洗电极，吹干；2)取6 ii L浓度为0. 5mg mL—1的GS-Chit滴涂在步骤I)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，使电极表面形成均匀的壳聚糖-石墨烯复合膜；3)取6 质量分数为2. 5%的戊二醛滴涂到步骤2)得到的电极表面，湿润保持lh，用水洗去多余的戊二醛；4)向步骤3)得到的电极表面滴涂6 ii L混合均匀的AuOSBA-15_Ab，湿润条件下晾干;5)向步骤4)得到的电极表面滴涂3 ii L浓度为100 ii g mL—1的BSA，封闭抗体上的非特异性结合位点，湿润保持Ih后用水冲洗掉多余的BSA，于4°C下保存待用，制备成环境雌激素电化学免疫传感器。实施例2(I)称取I. Omg石墨烯,加入到浓度为I. 5mg ^mL-1的壳聚糖溶液中，超声30min至分散均匀，制得均匀分散的I. Omg mL—1石墨烯-壳聚糖溶液(GS-Chit)；(2)称取30mg SBA-15,加入到3mL浓度为IOmg .mL4的氯金酸(HAuCl4)中，用水稀释至40mL，密封条件下搅拌20h，然后逐滴加入lmmol 的硼氢化钠直到溶液变成棕色且颜色不再发生变化，搅拌lOmin，离心洗涤，室温真空干燥，得到粉末状的Au@SBA-15 ；(3)取步骤(2)中粉末状的Au@SBA-15，用水稀释为3. 5mg m^1的Au@SBA_15溶液，分别取500 u L质量分数2. 5%的戊二醛，1000 u L浓度为3. 5mg mL—1的Au@SBA_15溶液和1500 u L浓度为I. Omg mL—1的Ab于4mL离心管中，4°C下振荡20h以孵化抗体，离心弃上清液，用PH为7. 4的PBS重复离心洗涤2次后，再用pH为7. 4的PBS稀释至lmL，得到AuiSBA-I5-Ab ；(4)电化学免疫传感器的制备，具体步骤如下I)将直径为4mm的玻碳电极依次用I. 0、0. 3和0. 05 y m的三氧化二铝抛光粉抛光处理，使其成镜面，用水冲洗后在乙醇中超声lmin，用5mmol L—1的铁氰化钾在-0. 2 0. 6V扫循环伏安，氧化还原峰电位差为90mV，用水冲洗电极，吹干；2)取6 ii L GS-Chit滴涂在步骤I)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，使电极表面形成均匀的壳聚糖-石墨烯复合膜；3)取6 质量分数为2. 5%的戊二醛滴涂到步骤2)得到的电极表面，湿润保持lh，用水洗去多余的戊二醛；
4)向步骤3)得到的电极表面滴涂6 ii L混合均匀的Au@SBA_15_Ab，湿润条件下晾干;5)向步骤4)得到的电极表面滴涂3 u L浓度为100 y g mL—1的BSA，封闭抗体上的非特异性结合位点，湿润保持Ih后用水冲洗掉多余的BSA，于4°C下保存待用，制备成环境雌激素电化学免疫传感器。实施例3(I)称取I. 5mg石墨烯,加入到浓度为3. Omg ^mL-1的壳聚糖溶液中，超声30min至分散均匀，制得均匀分散的I. 5mg mL—1石墨烯-壳聚糖溶液(GS-Chit)；(2)称取45mg SBA-15，加入到3mL浓度为IOmg 1171的氯金酸(HAuCl4)中，用水稀释至40mL，密封条件下搅拌20h，然后逐滴加入lmmol 的硼氢化钠直到溶液变成棕色且颜色不再发生变化，搅拌lOmin，离心洗涤，室温真空干燥，得到粉末状的Au@SBA-15 ；(3)取步骤(2)中粉末状的Au@SBA-15，用水稀释为3. 5mg m^1的Au@SBA_15溶液，分别取500 u L质量分数2. 5%的戊二醛，1250 u L浓度为3. 5mg mL—1的Au@SBA_15溶液和IOOOii L浓度为I. Omg .mL-1的Ab于4mL离心管中，4°C下振荡30h以孵化抗体，离心弃上清液，用PH为7. 8的PBS重复离心洗涤2次后，再用pH为7. 8的PBS稀释至lmL，得到AuiSBA-I5-Ab ；(4)电化学免疫传感器的制备，具体步骤如下I)将直径为4mm的玻碳电极依次用I. 0、0. 3和0. 05 y m的三氧化二铝抛光粉抛光处理，使其成镜面，用水冲洗后在乙醇中超声lmin，用5mmol L—1的铁氰化钾在-0. 2
0.6V扫循环伏安，氧化还原峰电位差为95mV，用水冲洗电极，吹干；2)取6 ii L浓度为I. 5mg mL—1的GS-Chit滴涂在步骤I)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，使电极表面形成均匀的壳聚糖-石墨烯复合膜；3)取6 质量分数为2. 5%的戊二醛滴涂到步骤2)得到的电极表面，湿润保持lh，用水洗去多余的戊二醛；4)向步骤3)得到的电极表面滴涂6 ii L混合均匀的Au@SBA_15_Ab，湿润条件下晾干。5)向步骤4)得到的电极表面滴涂3 ii L浓度为100 ii g mL—1的BSA，封闭抗体上的非特异性结合位点，湿润保持Ih后用水冲洗掉多余的BSA，于4°C下保存待用，制备成环境雌激素电化学免疫传感器；实施例4用于环境雌激素的检测(I)将上述实施例1、2、3中制备的无标记型电化学免疫传感器作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为辅助电极，组成三电极系统，结合电化学工作站CHI760D，在5mmol -L^1铁氰化钾溶液中，用方波伏安法在-0. 6 0. 6V电压范围内测定，记录响应电流Ici ；(2)用水冲洗上述电极，分别取6 ii L配制好的浓度在线性范围内的环境雌激素标准抗原溶液滴到不同的电极表面，反应I. 5h ;(3)将步骤⑵得到的电极分别执行步骤⑴所述的测定过程，此时的响应电流记为Ii ; (4)根据上述步骤(I)和步骤(3)得到的电流差值A I = I0-Ii与环境雌激素标准抗原浓度的线性关系，绘制工作曲线。实施例5水样中炔诺酮、雌三醇的测定(I)分别选择能特异性识别炔诺酮、雌三醇的抗体，按照实施例2所述的方法制备无标记型电化学免疫传感器，唯一不同的是实施例2中步骤(3)中的抗体具体为炔诺酮或雌三醇的抗体；(2)取适量湖水水样，经0.02 滤膜过滤后调节pH至7，于4°C下保存待用；(3)用上述步骤(2)处理好的水样按照实施例4中的检测方法进行检测，根据其电流的变化值Al与实施例4得到的炔诺酮、雌三醇工作曲线，计算水样中炔诺酮、雌三醇的含量，同时做加标回收实验，结果如表I和表2所示。实施例6牛奶中己烯雌酚的测定(I)选择能特异性识别己烯雌酚的抗体，按照实施例2所述的方法制备无标记型电化学免疫传感器，唯一的不同是实施例2中步骤(3)中的抗体具体为己烯雌酚抗体；(2)取适量牛奶于离心管中，4°C下离心15min，去除上层脂肪，于4°C下保存待用；(3)用上述步骤(2)处理好的牛奶样品按照实施例4中的检测方法进行检测，根据其电流的变化值Al与实施例4得到的己烯雌酚工作曲线，计算牛奶样品中己烯雌酚的含量，同时做加标回收实验，结果如表3所示。实施例7动物源性食品中雌二醇的测定(I)选择能特异性识别雌二醇的抗体，按照实施例2所述的方法制备无标记型电化学免疫传感器，唯一的不同是实施例2中步骤(3)中的抗体具体为雌二醇抗体；(2)将去除脂肪的动物源性食品绞碎成匀样后，称取适量匀样按照常规方法进行样品处理，得到上清液，于4°C下保存待用；(3)用上述步骤(2)处理好的样品溶液按照实施例4中的检测方法进行检测，根据其电流的变化值Al与实施例4得到的雌二醇的工作曲线，计算动物源性食品中雌二醇的含量，同时与酶联免疫法做对比，结果如表4所示。 上述动物源性食品包括鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、猪肝。表I水样中炔诺酮的测定结果
权利要求
1.一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下 (1)用壳聚糖(Chit)溶液分散石墨烯(GS)，超声至形成分散均匀的石墨烯-壳聚糖溶液(GS-Chit)； 所述的分散均勻的GS-Chit, GS浓度为0. 5 I. 5mg ml/1, Chit浓度为I. 0 3. Omg mL 1 ； (2)用原位还原法将氯金酸在介孔二氧化硅(SBA-15)的孔道中还原，得到金杂化的介孔二氧化硅纳米复合材料(Au@SBA-15)； 所述的氯金酸和SBA-15的质量比为I : 0. 5 I. 5 ; (3)将交联剂戊二醛、Au@SBA-15溶液和环境雌激素抗体(Ab)均匀混合，制备成纳米复合材料与抗体的混合液(Au@SBA-15-Ab)； 交联剂戊二醛的质量分数为2. 5%,AuiSBA-15溶液浓度为3. 5mg 环境雌激素抗体浓度为I. Omg mL-1 ； 所述的交联剂戊二醛、Au@SBA-15溶液和环境雌激素抗体的体积比为I : I. 5 2. 5 I 3 ; 所述的Au@SBA-15-Ab是将交联剂戊二醛、Au@SBA_15溶液、环境雌激素抗体(Ab)放在振荡器上振荡10 30h后离心洗涤，用pH为6. 8 7. 8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释得到； (4)利用电极表面自组装技术将GS-Chit和Au@SBA-15-Ab修饰在电极表面； (5)将浓度为IOOiig mL—1的牛血清白蛋白(BSA)滴涂在步骤4)Au@SBA-15_Ab修饰的电极表面，湿润保持Ih后用水冲洗掉多余的BSA，置于4°C下保存待用，制备成无标记型电化学免疫传感器。
2.根据权利要求I所述的一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于所述的GS-Chit和Au@SBA-15-Ab修饰到电极表面，步骤如下 (1)依次用不同粒径的三氧化二铝抛光粉抛光处理直径为5mm的玻碳电极，用乙醇超声处理，然后将电极置于铁氰化钾溶液中，在-0. 6 0. 6V扫描,峰电位差小于IOOmV,吹干待用； (2)将制备的分散均匀的GS-Chit滴涂到电极表面，室温晾干； (3)将戊二醛滴涂到步骤(2)GS-Chit修饰的电极表面，湿润保持lh，用水冲洗掉多余的戊二醛； (4)将制备的AuOSBA-15-Ab混合均匀后滴涂到步骤(3)戊二醛修饰的电极表面，湿润条件下晾干。
3.根据权利要求I或2所述的一种环境雌激素电化学免疫传感器，其特征在于包括如下步骤将制备好的电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、钼丝电极作为辅助电极，组成三电极系统，结合电化学工作站CHI760D，用于水及食品中环境雌激素的检测。
所述的环境雌激素为雌二醇、雌三醇、己烯雌酚或炔诺酮。
全文摘要
本发明涉及一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。本发明利用壳聚糖分散的石墨烯导电能力强、稳定性好，金杂化的介孔二氧化硅纳米复合材料比表面积大，生物相容性好，催化效率高等特点显著提高传感器的灵敏度。该方法通过壳聚糖分散的石墨烯、交联剂、纳米材料与抗体的复合溶液、牛血清蛋白的层层自组装构建免疫传感器。基于抗原抗体的特异性结合，借助电化学工作站仪器，通过记录相应抗原修饰传感器前后的电流变化，可直接检测水及食品中的环境雌激素。本发明的优点在于灵敏度高、特异性好、易于操作、检测限低，能实现实际样品中多种环境雌激素的灵敏、快速、准确检测。
文档编号G01N27/327GK102749373SQ20121023242
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者吴丹, 孙蒙, 张勇, 李玉阳, 李贺, 杜斌, 闫良国, 马洪敏, 魏琴, 黎荣霞 申请人:济南大学