专利名称：蛋白质药物制剂的制作方法
蛋白质药物制剂本发明提供了一种液体药物制剂，其包含治疗性蛋白质、表面活性剂和至少一种选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂。常用的其中涉及界面相互作用的方法和条件如过滤泵送搅动(filtrationpumping agitation)(例如振摇或搅拌)、冷冻/融化以及冷冻干燥可导致聚集。聚山梨酯是一类重要的非离子表面活性剂，其广泛用在蛋白质药物中以稳定蛋白质避免界面诱导的聚集和使蛋白质的表面吸附最小化(Wang W 2005.生物药剂学中的蛋白质聚集及其抑制(Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics). Int J Pharm289(1-2) :1-30)。由于其在保护许多蛋白质中有效，聚山梨酯普遍存在于蛋白质制剂中。事实上，特别是对于单克隆抗体(Mab)，超过70%的市售制剂含有聚山梨酯20或聚山梨酯80 (PS20或PS80)。聚山梨酯的广泛使用是由于其具有高HLB数、低CMC值，并且因此在低浓度下具有非常有效的表面活性。聚山梨酯稳定蛋白质的作用机理被认为是基于它们的表面活性，并且因此基于它们的与蛋白质竞争性的在界面处的相互作用，但是尚未发现CMC 本身是主要参数。从聚山梨酯本身与表面例如过滤器相互作用这一事实，聚山梨酯对表面的高亲和力是显然的。聚山梨酯是由聚氧乙烯(POE)失水山梨醇的脂肪酸酯组成的两亲性非离子表面活性剂。市售可得的聚山梨酯是主要含有失水山梨醇POE脂肪酸酯的化学上种类不同的混合物。另外，存在大量的Ρ0Ε、失水山梨醇POE和异山梨醇POE脂肪酸酯。已知聚山梨酯易于被自氧化作用和水解作用降解。尽管有当前关于聚山梨酯降解的知识水平(Kerwin BA 2008.在蛋白质生物治疗药物的制剂中使用的聚山梨酯20和80 :结构和降解途径(Polysorbates 20and 80used in the formulation of protein biotherapeutics Structure and degradation pathways). J Pharm Sci 97(8) :2924-2935),胃肠外蛋白质制剂中使用的聚山梨酯的命运促使人们进行更周密的研究，以理解该时间过程以及在药学相关条件下的降解机理。这是尤其恰当的，因为关于降解的聚山梨酯物质对蛋白质稳定性的相互作用或影响了解不多。已知原料形式的和水溶液形式的聚山梨酯均随时间推移通过两种机理进行降解a)水解；b)自氧化。聚山梨酯的降解(a)通过不再稳定蛋白质、并且从而具有反面影响或(b)由于随时间推移不溶性降解产物(其可能在产品中以“颗粒”形式出现)累积而可能对产品质量具有潜在影响。因此，需要至少部分克服现有技术的蛋白质药物制剂的缺点的蛋白质药物制剂。本发明的一个目的是提供一种液体药物制剂，其包含蛋白质、表面活性剂和至少一种选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂。本发明的另一个目的是提供至少一种选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂用于防止包含蛋白质的液体药物制剂中的表面活性剂降解的用途。在本发明的一个优选的实施方案中，所述至少一种抗氧化剂选自自由基清除剂。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述自由基清除剂选自抗坏血酸、BHT、BHA、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽和掊酸丙酯。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述蛋白质是治疗性蛋白质，优选是抗体，更优选是单克隆抗体。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述螯合剂选自EDTA和朽1檬酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述链终止剂选自蛋氨酸、山梨醇、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。附图
简要说明
·
图IA显示了在三个不同温度下历经6个月的储存时间聚山梨酯20制剂中过氧化物含量的增加，图IB显示了在三个不同温度下历经6个月的储存时间聚山梨酯80制剂中过氧化物含量的增加，图2A显示了用HPLC/ELSD方法测得的历经6个月的储存时间聚山梨酯20的聚山梨酯浓度的下降，图2B显示了用HPLC/ELSD方法测得的历经6个月的储存时间聚山梨酯80的聚山梨酯浓度的下降，图3A显示了在存在和不存在BHT/EDTA/蛋氨酸的情况下PS20的聚山梨酯浓度。赋形剂是P1 =聚山梨酯，P2 =聚山梨酯+ΒΗΤ，P3 =聚山梨酯+EDTA，P4 =聚山梨酯+蛋
氨酸，图3B显示了在存在和不存在BHT/EDTA/蛋氨酸的情况下PS80的聚山梨酯浓度。赋形剂是P1 =聚山梨酯，P2 =聚山梨酯+ΒΗΤ，P3 =聚山梨酯+EDTA，P4 =聚山梨酯+蛋
氨酸，图4显示了在存在或不存在各种用于防止聚山梨酯降解的赋形剂的情况下故意降解的聚山梨酯20的结果。本文所用的术语“药物制剂”(或“制剂”)意指例如要施用于需要其的哺乳动物(例如人)的含有治疗有效量的活性药物成分(例如多肽或抗体)以及药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液。本文所用的术语“多肽”指氨基酸的聚合物，但不指特定的长度。因此，在多肽的定义内包括肽、寡肽和蛋白质片段。术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。本发明的抗体优选是人源化抗体、嵌合抗体或其它遗传工程抗体，只要保留本发明的特征性性质即可。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选其可变结构域或至少其抗原结合部位。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如在Houston, J. S. , Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中描述了 scFv 抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体制剂”指单一氨基酸组成的抗体分子制备物。术语“嵌合抗体”指包含来自于一个来源或物种的可变区(即，结合区)和源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分的抗体，其通常是用重组DNA技术制备的。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明包括的其它优选的“嵌合抗体”形式是其中恒定区已经由原抗体的恒定区被修饰或改变以产生本发明的性质(尤其是在Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合方面)的那些。所述嵌合抗体也称为“类别转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA节段的被表达的免疫球蛋白基因的产物。制备嵌合抗体的方法包括常规重组DNA和基因转染技术，是本领域公知的。参见例如 Morrison，S. L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ;美国专利No. 5，202，238 和 5，204，244。本文所用的术语“人抗体”用于包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是公知的(van Dijk, M. A.和van de ffinkel,J. G. , Curr.Opin.Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。人抗体也可在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物经免疫接种能在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分或选择物(selection)。经抗原激发，人种系免疫球蛋白基因芯片(gene array)在这类种系突变小鼠中的转移将导致人抗体的产生(参见例如Jakobovits, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 ；Jakobovits, A.等人，Nature362(1993)255-258 ；Bruggemann,M.等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人抗体也可在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom, H. R.和 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole 等人和 Boerner 等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, p. 77 (1985)；和 Boerner, P.等人，J. Immunol. 147(1991)86-95)。如针对本发明的嵌合抗体和人源化抗体已经提及的那样，本文所用的术语“人抗体”也包括在恒定区被修饰以产生本发明的性质(尤其是在Clq结合和/或FcR结合方面)的这类抗体，所述修饰例如通过“类别转换”、即Fe部分的改变或突变(例如从IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突变)来进行。术语“药学上可接受的赋形剂”指不具有治疗活性且具有可接受的毒性的任何成分，例如配制药物产品中使用的缓冲剂、溶剂、张力物质(tonicity agent)、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或聚合物。根据已建立的政府标准(包括美国食品药品管理局(UnitedStates Food and Drug Administration)颁布的那些标准)，对于施用于人而言,它们通常是安全的。本文所用的术语“缓冲剂”表示稳定药物制剂的pH的药学上可接受的赋形剂。适合的缓冲剂在本领域中是公知的且可以在文献中找到。优选的药学上可接受的缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂或其混合物。最优选的缓冲剂包括柠檬酸盐、L-组氨酸或L-组氨酸与L-组氨酸盐酸盐的混合物。其它优选的缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。独立于所用的缓冲剂，PH可以用本领域已知的酸或碱例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾来调节。本文所用的术语“张力物质”表示用于调节制剂的张力的药学上可接受的赋形剂。一般而言，张力涉及溶液的渗透压，通常其是相对于人血清的渗透压而言的。制剂可以是低张的、等张的或高张的。典型得，制剂优选是等张的。等张制剂是液体或由固体形式、例如由冻干形式重构得到的液体，表示具有与用于与其对比的一些其它溶液(例如生理盐水溶液和血清)相同的张力的溶液。适合的张力物质包括但不限于盐、氨基酸和糖。优选的张力物质是氯化钠、海藻糖、蔗糖或精氨酸。“张力”是由半透膜分开的两种溶液的渗透压的量度。渗透压是必需施加给溶液以防止水穿过半透膜向内流动的压力。渗透压和张力只受不能穿过半透膜的溶质影响，因为只有这些溶质产生渗透压。能自由穿过半透膜的溶质不影响张力，因为它们在半透膜的两侧浓度总是相等的。在与张力物质或稳定剂相关的上下文中的术语“氨基酸”表示具有位于羧基的a-位的氨基部分的药学上可接受的有机分子。氨基酸的实例包括精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸(ornithine)、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在与张力物质或稳定剂相关的上下文中优选的氨基酸是精氨酸、色氨酸、蛋氨酸、组氨酸或甘氨酸。本文所用的术语“糖”表示单糖或寡糖。单糖是不可被酸水解的单体碳水化合物，包括单糖和它们的衍生物，例如氨基糖。单糖的实例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山 梨糖、核糖、脱氧核糖和神经氨酸。寡糖是由通过糖苷键以分枝或以直链连接的一个以上单体糖单元组成的碳水化合物。寡糖内的单体糖单元可以相同或不同。取决于单体糖单元的数量，寡糖是二糖、三糖、四糖、五糖等糖。与多糖不同，单糖和寡糖是水溶性的。寡糖的实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖。优选的糖是蔗糖和海藻糖。本文所用的术语“表面活性剂”表示用于保护蛋白质制剂对抗机械应力如搅动和剪切的药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的表面活性剂的实例包括泊洛沙姆、聚山梨酯、聚氧乙烯烧基醚(节泽)、烧基苯基聚氧乙烯醚(alkylphenylpolyoxyethylene ether)(曲通-X)或十二烷基硫酸钠(SDS)。优选的表面活性剂是聚山梨酯和泊洛沙姆。本文所用的术语“聚山梨酯”指山梨醇及其脱水物的油酸酯，典型地其是与环氧乙烷共聚的。优选的聚山梨酯是聚山梨酯20(聚环氧乙烷(20)失水山梨醇单月桂酸酯，吐温20)或聚山梨酯80 (聚环氧乙烷(80)失水山梨醇单月桂酸酯，吐温80)。本文所用的术语“泊洛沙姆”指由聚环氧丙烷(PPO)中心疏水链和侧接的两个聚环氧乙烷(PEO)亲水链构成的非离子三嵌段共聚物，各PPO或PEO链可以具有不同的分子量。泊洛沙姆也以商品名普流罗尼克被人们所知。优选的泊洛沙姆是泊洛沙姆188-其中PPO链具有1800g/mol的分子量和80% (w/w)的PEO含量的泊洛沙姆。术语“抗氧化剂”表示防止活性药物成分氧化的药学上可接受的赋形剂。其包括螯合剂、活性氧清除剂和链终止剂。抗氧化剂包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、掊酸丙酯、半胱氨酸、蛋氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。实验部分长期研究试验研究I在不存在蛋白质的情况下，用具有240mM海藻糖和0.02%或0.02% (w/v)PS 20或 PS 80 的 pH6 的 20mM His/His. HCl(SA Ajinomoto Omnichem NV, Louvain-Ia-Neuve,比利时)制备制剂(“空白对照”)。将 0. 001% BHT(Fluka Chemmie AG, Steinenheim)、0. 01 % EDTA (Fluka Chemmie AG, Steinenheim)、IOmM蛋氨酸(SA Ajinomoto Omnichem NV,Louvain-Ia-Neuve，比利时)加入到该制剂中。将制剂用0. 22 U m Millex GV(PVDF)注射器过滤装置(Millipore,Bedford,MA,USA)过滤并在经灭菌的标准6mL020mm I型透明玻璃注射小瓶(Schott forma vitrum AG, St. Gallen,瑞士 )中无菌灌装至 2. 4mL,用Teflon 包被的注射剂塞(Daikyo Seiko,Tokyo,日本)闭合，并用招紧耳盖(crimp cap)密封。将小瓶在5°C、25°C和40°C储存。在分散在3个月中的各时间点对样品进行分析。试骀研究2在不存在蛋白质的情况下，用具有240mM海藻糖和0.02%或0.02% (w/v)PS 20的pH6 的 20mM His/His. HCl (SA Ajinomoto Omnichem NV, Louvain-la-Neuve,比利时)制备制剂(“空白对照”)。测试了下列抗氧化剂0. 005% BHT (Fluka Chemmie AG, Steinenheim,瑞士)、0. IEDTA(Fluka Chemmie AG, Steinenheim,瑞士)、20mM 蛋氨酸(SA AjinomotoOmnichem NV, Louvain-la-Neuve,比利时)、20mM梓樣酸(Fluka Chemmie AG, Steinenheim, 瑞士)、0. 5%抗坏血酸(Acros organics,Geel Belgium) >0. 1%谷胱;甘月太(Fluka ChemmieAG, Steinenheim,瑞士)、0. 2 亚硫酸钠(Merck KGaA, Darmstadt,德国)、0. 5 山梨醇(Fluka Chemmie AG, Steinenheim,瑞士)、0. 5 N-乙酸半胱;氛酸(Fluka Chemmie AG,Steinenheim,瑞士)、0. 01 格酸丙酷(Fluka Chemmie AG, Steinenheim,瑞士)、0. 01 对氨基苯甲酸(Fluka Chemmie AG, Steinenheim,瑞士)，向制剂中加入泊洛沙姆188。向制剂中掺入300ppm H2O2或IOOppm FeCl20将制剂用0. 22 u m Millex GV(PVDF)注射器过滤装置(Millipore，Bedford, MA, USA)过滤并在经灭菌的标准6mL 0 20_ I型透明玻璃注射小瓶(Schott forma vitrum AG, St. Gallen,瑞士 )中无菌灌装至 2. 4mL,用Teflon 包被的注射剂塞(Daikyo Seiko, Tokyo，日本)闭合，并用铝紧耳盖密封。将小瓶在25°C和40°C储存。在分散在3周中的各时间点对样品进行分析。聚山梨酯定量采用基于HPLC/ELSD的方法或荧光胶束法对制剂中的聚山梨酯浓度进行定量。(a) HPLC/ELSD 方法HPLC/ELSD 方法是以 Hewitt 等人(Hewitt D，Zhang T, Kao YH 2008.使用混合式色谱法和蒸发光散射检测对蛋白质溶液中的聚山梨酯20进行定量(Quantitationof polysorbate 20in protein solutions using mixed-mode chromatography andevaporative light scattering detection). J Chromatogr A 1215(1-2) :156-160)所述的方法为基础的，用以分析制剂中的聚山梨酯。使用来自Waters的30 ii m混合式色谱柱Oasis MAX。测定聚山梨酯的峰面积，并与校准曲线对比。为了排除潜在的分析干扰，校准标准物含有样品中存在的所有赋形剂。(b)荧光胶束法使用荧光胶束法来测定提取样品中聚山梨酯的浓度。该分析基于荧光染料N-苯基-I-萘胺(NPN)吸收到聚山梨酯胶束的疏水核中。NPN在水性环境中具有低的荧光量子产率，而在非极性环境中观察到高产率。用通过750mL编织回授线圈(knittedreaction coil) (Dionex, Sunnyvale, CA)与 Waters474 突光检测器连接的 Waters2695HPLC(Milford, MA)以流动注射分析(FIA)来建立试验。将荧光检测器设置为350nm的激发波长和420nm的发射波长。流动相由0. 15M氯化钠、pH8. 0的0. 05M TRIS、5%乙腈、15ppm苄泽35和5. OmM NPN(N-苯基-I-萘胺)组成。为了定量，测定聚山梨酯的峰面积，并与校准曲线对比。为了排除潜在的分析干扰，校准标准物含有样品中存在的所有赋形剂。过氧化物测定基于FOXII分析(Ha E，Wang W，Wang YJ 2002.聚山梨酯80的过氧化物形成和蛋白质稳定性(Peroxide formation in polysorbate 80and protein stability). JPharm Sci 91(10) :2252-2264)，用市售可得的来自Thermo Fischer的过氧化物定量试剂盒PeroXOquant进行过氧化物测定,其依赖于在酸性条件下Fe2+到Fe3+的快速的氢过氧化物介导的氧化以及与二甲酚橙的复合物，二甲酚橙在560nm有强吸收。用不含蛋白质的制剂进行过氧化物测定。结果发现在制剂溶液中过氧化物浓度增加(图IA和B)。尽管这种增加以前在原料和水溶液中已经被其他人注意到，但在药学相关条件中没有这种报道。发现聚山梨酯浓度在制剂溶液中随时间推移增加，并且温度越高越明显(图2A和B)。与不包含另外的组分的那些相比，包含另外的组分可改善水性制剂中聚山梨酯的稳定性。这是通过测试掺入了 BHT、蛋氨酸和EDTA的制剂中的聚山梨酯含量确定的。显然，这些物质的加入在使聚山梨酯的降解最小化方面具有积极的作用(图3A和B)。针对其使聚山梨酯降解最小化的潜能，进一步筛选了以下组分表I
权利要求
1.一种液体药物制剂，其包含蛋白质、表面活性剂和至少一种选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂。
2.权利要求I的液体药物制剂，其中所述至少一种抗氧化剂选自自由基清除剂。
3.权利要求2的液体药物制剂，其中所述自由基清除剂选自抗坏血酸、BHT、BHA、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽和掊酸丙酯。
4.权利要求1-3的液体药物制剂，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质，优选是抗体，更优选是单克隆抗体。
5.权利要求1-4的液体药物制剂，其中所述螯合剂选自EDTA和柠檬酸。
6.权利要求1-5的液体药物制剂，其中所述链终止剂选自蛋氨酸、山梨醇、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。
7.权利要求1-7的液体药物制剂，其中所述表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆。
8.权利要求7的液体药物制剂，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。
9.选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂用于防止包含蛋白质的液体药物制剂中的表面活性剂降解的用途。
10.权利要求9的抗氧化剂的用途，其中所述自由基清除剂选自抗坏血酸、BHT、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽和掊酸丙酯。
11.权利要求9或10的抗氧化剂的用途，其中所述螯合剂选自EDTA和柠檬酸。
12.权利要求9-11的抗氧化剂的用途，其中所述链终止剂选自蛋氨酸、山梨醇、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。
13.权利要求9-12的抗氧化剂的用途，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质，优选是抗体，更优选是单克隆抗体。
14.权利要求9-13的抗氧化剂的用途，其中所述表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆。
15.权利要求14的抗氧化剂的用途,其中所述聚山梨酯是聚山梨酯20和/或聚山梨酯·80。
全文摘要
本发明提供了一种液体药物制剂，其包含治疗性蛋白质、表面活性剂和至少一种选自自由基清除剂、螯合剂或链终止剂的抗氧化剂。
文档编号A61K47/18GK102711833SQ201180006504
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月14日 优先权日2010年1月19日
发明者H-C·马勒, S·K·K·拉乌里 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司