寡肽-1活性成分的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种寡肽?1活性成分的提取方法，包括如下步骤：匀浆：将动物颚下腺组织破碎，调节其pH值至弱酸性，进行搅拌以得到匀浆液；提取：将匀浆液冷冻后再解冻，离心分离后取上清液；提纯：将上清液依次进行过滤、超滤，取滤出液。本发明提出的寡肽?1活性成分的提取方法操作简单，成本低，且提取的寡肽?1活性成分纯度较高、比活性高。
【专利说明】
寡肽-1活性成分的提取方法
技术领域
[0001]本发明涉及蛋白质领域，具体涉及寡肽-1活性成分的提取方法。
【背景技术】
[0002]寡肽是多肽的一种分类，分子量段一般在1000道尔顿一下，一般由2-6个氨基酸组成。寡肽与其他肽的区别在于，分子量小的寡肽可以比多肽具有更高皮肤渗透性，更容易被人体皮肤吸收，同时由于分子量小到了一定程度，生物活性就发生了质的飞跃。肽分子量越小，“氨基酸链”越短，就越易被人体吸收和利用。
[0003]寡肽又可分为:寡肽-1、寡肽-3、寡肽-5等。寡肽-1能够促进细胞的增殖分化，从而以新生细胞替代衰老细胞和死亡细胞。寡肽-1在医药领域具有重要的意义，它能促进受伤的皮肤组织生长，抑制胃酸的分泌，可促进烧伤皮肤的生长和皮肤溃疡的愈合，在皮肤病、胃病、角膜抑制手术中起着重要作用。同时，寡肽-1在美容界也有很大的应用前景。传统化妆品起的是外部修饰作用，不能从根本上解决皮肤问题，而寡肽-1应用在美容化妆品中是依据人体皮肤的生理结构，在分子水平上对细胞进行修复和调整。
[0004]但是，由于寡肽-1主要存在于新鲜组织细胞中，在提取过程中容易分解失效，因此，动物组织细胞中的寡肽-1 一直未得到很好利用;此外，来源于新鲜组织或细胞的寡肽-1提取效率较低，获得量少，造成提取成本高、产品纯度低和比活性低。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006]为此，本发明的提出了一种寡肽-1活性成分的提取方法，操作简单，提取成本低、产品纯度高且比活性高。
[0007]本发明提出的一种寡肽-1活性成分的提取方法，包括如下步骤:匀浆:将动物颚下腺组织破碎，调节其PH值至弱酸性，进行搅拌以得到匀浆液;提取:将匀浆液冷冻后再解冻，离心分离后取上清液;提纯:将上清液依次进行过滤、超滤，取滤出液。
[0008]根据本发明实施例的寡肽-1活性成分的提取方法，提取过程只用到实验常用设备，操作简单且提取成本低，通过膜包的大小控制寡肽-1活性成分的纯度，可以提取纯度较高的寡肽-1活性成分。
[0009]另外，根据本发明上述实施例的一种寡肽-1活性成分的提取方法，还可以具有如下附加的技术特征:
[0010]进一步地，还包括在提纯后对滤出液进行浓缩的步骤，取浓缩液。
[0011 ]进一步地，匀浆步骤、提纯步骤和浓缩步骤均在O °C?4°C的条件下进行。
[0012]进一步地，在勾楽步骤中，破碎的动物颚下腺组织的体积为0.5mm3?2mm3。
[0013]进一步地，在匀浆步骤中，采用浓度为0.3%?I %的冰乙酸调节破碎的动物颚下腺组织的pH值至5?5.5，冰乙酸与破碎的动物颚下腺组件按重量份数比为(0.7:1)?(1:
0.7)。
[0014]进一步地，在勾楽步骤中，搅拌的转速为8000rpm/min?15000rpm/min，搅拌时间为3min?1min0
[0015]进一步地，在提取步骤中，对匀浆液进行冷冻的温度-100°C?_20°C，冷冻后再解冻的过程至少重复两次，离心分离的7000rpm/min?13000rpm/min，离心分离的时间为20min?40min，解冻过程和离心分离过程均在0°C?4°C的条件下进行。
[0016]进一步地，在提纯步骤中，采用孔径为0.2μπι?Ιμπι的滤膜进行过滤。
[0017]进一步地，在提纯步骤中，采用Skd?13kd的膜包进行超滤。
[0018]进一步地，在浓缩步骤中，采用0.8kd?1.3kd的膜包进行浓缩。
[0019]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例的寡肽-1活性成分的提取方法的流程图；
[0021]图2是本发明实施例提取的寡肽-1活性成份与阴性对照样、阳性对照样和空白对照样的对比图；
[0022]图3是本发明实施例提取的寡肽-1活性成分的质谱图。
【具体实施方式】
[0023]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0024]下面参考附图来详细说明根据本发明实施例的一种寡肽-1活性成分的提取方法。
[0025]如图1所示，本发明提出的一种寡肽-1活性成分的提取方法100，包括如下步骤。
[0026]步骤101:匀浆:将动物颚下腺组织破碎，调节其pH值至弱酸性，进行搅拌以得到匀浆液。在提取动物颚下腺组织时，可以把颚下腺组织周围的结缔组织、脂肪和肌肉等没有用的组织去除干净，剩下纯颚下腺组织，可以减小后续处理的工作量。可以将动物颚下腺组织剪碎至体积为0.5_3?2_3大小放在(TC?4°C环境下待用，体积太大不易充分匀浆，且温度过高或过低都会引起寡肽-1活性成分的降解。
[0027]在调节寡肽-1活性成分活性成份的pH值时，优选浓度为0.3 %?I %的冰乙酸，调节破碎的动物颚下腺组织的pH值至5?5.5，冰乙酸与破碎的动物颚下腺组件按重量份数比为(0.7:1)?(1:0.7)。也可选用盐酸、草酸等酸性物质来调节。
[0028]步骤102:提取:将匀浆液冷冻后再解冻，离心分离后取上清液。详细地讲，可以将匀浆液取出放置在-100°C?_20°C快速冷冻，然后解冻，解冻的温度最好不超过4°C，并重复此过程2次以上，目的是使细胞充分释放寡肽-1活性成分。离心分离过程也在(TC?4°C的条件下进行。
[0029]步骤103:提纯:在O°C?4 °C的条件下，将上清液依次进行过滤、超滤，取滤出液。详细地讲，就是将解冻后的寡肽-1活性成分在转速为7000rpm/min?13000rpm/min的条件下进行离心分离，时间优选为20min?40min，可以实现固液分离，破碎的组织沉淀在试管底部，然后取上清液进行过滤。过滤时优选孔径为0.2μπι?Ιμπι的滤膜，去除一些大颗粒物质和离心未沉淀的组织。过滤时可用针式过滤器，工业化生产可以使用较大的过滤器，以提高工作效率。
[0030]然后，在O0C?40C的条件下，将过滤后的液体进行超滤。可以选用方便工业化生产的超滤设备，采用Skd?13kd的膜包，滤出液变的清亮泛黄。优选的，超滤后可选用0.Skd?
1.3kd的膜包对提取物进行浓缩，取回流液。在提纯步骤的间歇，为防止寡肽-1活性成分的降解，可以将待提纯物置于冰上保存。
[0031]如图2所示，I号，2号和3号为根据本发明实施例的提取物，4号为阴性对照，提取物中没有寡肽-1活性成分质；5号为阳性对照，提取物中有寡肽-1活性成分;6号和7号为空白对照。I号，2号和3号的颜色深度更接近5号，说明I号，2号和3号中含有寡肽-1活性成分，颜色深度比5号深，说明寡肽-1活性成分的浓度比5号中蛋白的浓度较高。
[0032]图3为本发明实施例提取的寡肽-1活性成分的质谱图。寡肽-1活性成分的信号峰清晰可见，说明寡肽-1活性成分的纯度较高，且峰的相对强度较高，说明根据本发明实施例提取的寡肽-1活性成分的含量较高。
[0033]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0034]优选实施例一:
[0035]匀浆:在4°C的环境下，将动物颚下腺组织破碎成0.5mm3大小，称重，按照重量份数0.7:1的比例添加浓度为0.3%的冰乙酸调节其pH值至5，即0.7份动物颚下腺组织中加入I份冰乙酸，在8000rpm/min的搅拌速率下搅拌3min以得到勾楽液。
[0036]提取:将匀浆液置于-100°C环境下冷冻后再解冻到4°C，然后在7000rpm/min的转速下离心分离20min，取上清液。
[0037]提纯:用0.2μπι的滤膜过滤上清液，滤出液用8kd的膜包进行超滤，进行过滤、超滤，取滤出液，再用0.Skd的膜包对滤出液进行浓缩。在做过滤、超滤和浓缩准备工作时，将待提纯物置于冰上保存。
[0038]优选实施例二:
[0039]匀浆:在20C的环境下，将动物颚下腺组织破碎成1.3mm3大小，称重，按照重量份数1:1的比例添加浓度为0.6%的冰乙酸调节其pH值至5.3，S卩I份动物颚下腺组织中加入I份冰乙酸，在1100rpm/min的搅拌速率下搅拌6min以得到勾楽液。
[0040]提取:将匀浆液置于-60°C环境下冷冻后再解冻到2°C，重复两次，然后在10000rpm/min的转速下离心分离30min，取上清液。
[0041]提纯:用0.6μπι的滤膜过滤上清液，滤出液用1kd的膜包进行超滤，进行过滤、超滤，取滤出液，再用Ikd的膜包对滤出液进行浓缩。在做过滤、超滤和浓缩准备工作时，将待提纯物置于冰上保存。
[0042]优选实施例三:
[0043]匀浆:在O0C的环境下，将动物颚下腺组织破碎成2mm3大小，称重，按照重量份数I:
0.7的比例添加浓度为1%的冰乙酸调节其pH值至5.5，S卩I份动物颚下腺组织中加入0.7份冰乙酸，在15000rpm/min的搅拌速率下搅拌I Omin以得到勾楽液。
[0044]提取:将匀浆液置于-20°C环境下冷冻后再解冻到0°C，重复四次，然后在13000rpm/min的转速下离心分离40min，取上清液。
[0045]提纯:用Ιμπι的滤膜过滤上清液，滤出液用13kd的膜包进行超滤，进行过滤、超滤，取滤出液，再用1.3kd的膜包对滤出液进行浓缩。在做过滤、超滤和浓缩准备工作时，将待提纯物置于冰上保存。
[0046]根据本发明实施例的寡肽-1活性成分的提取方法，提取过程只用到实验常用设备，操作简单且提取成本低，通过膜包的大小控制寡肽-1活性成分的纯度，可以提取纯度较高的寡肽-1活性成分。
[0047]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，包括如下步骤: 匀浆:将动物颚下腺组织破碎，调节其PH值至弱酸性，进行搅拌以得到匀浆液； 提取:将所述匀浆液冷冻后再解冻，离心分离后取上清液； 提纯:将所述上清液依次进行过滤、超滤，取滤出液。2.如权利要求1所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，还包括在提纯后对所述滤出液进行浓缩的步骤，取浓缩液。3.如权利要求2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，匀浆步骤、提纯步骤和浓缩步骤均在O 0C?4°C的条件下进行。4.如权利要求1或2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在匀浆步骤中，破碎的动物颚下腺组织的体积为0.5mm3?2mm3。5.如权利要求1或2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在匀浆步骤中，采用浓度为0.3%?I %的冰乙酸调节破碎的动物颚下腺组织的pH值至5?5.5，冰乙酸与破碎的动物颚下腺组件按重量份数比为(0.7:1)?(1: 0.7)。6.如权利要求1或2的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在匀浆步骤中，搅拌的转速为8000rpm/min ?15000rpm/min，揽摔时间为 3min ?lOmin。7.如权利要求1或2述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在提取步骤中，对匀浆液进行冷冻的温度-100°c?-20°c，冷冻后再解冻的过程至少重复两次，离心分离的7000rpm/min?13000rpm/min，离心分离的时间为20min?40min，解冻过程和离心分离过程均在O 0C?4°C的条件下进行。8.如权利要求1或2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在提纯步骤中，采用孔径为0.2μπι?Ιμπι的滤膜进行过滤。9.如权利要求1或2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在提纯步骤中，采用8kd?13kd的膜包进行超滤。10.如权利要求2所述的寡肽-1活性成分的提取方法，其特征在于，在浓缩步骤中，采用0.8kd?1.3kd的膜包进行浓缩。
【文档编号】C07K1/14GK105859827SQ201610231287
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】成姚斌
【申请人】扬州梦晓生物工程有限公司