醛酮还原酶及其在合成(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种醛酮还原酶突变体，生产该醛酮还 原酶突变体的基因工程菌的构建，及该醛酮还原酶突变体的生产方法及其在生物催化制备 (2S，3R) -2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用。
【背景技术】
[0002] 属于酮还原酶（KRED)或羰基还原酶类的酶对于从相应的前体立体异构酮底物或 相应的外消旋醛底物中合成旋光的醇有用。典型的，KRED将酮和醛底物转化为相应的醇产 物，但是也可催化逆反应，将醇底物氧化为相应的酮/醛产物。用如KRED的酶对酮和醛的还 原以及醇的氧化需要辅因子，最常见的为还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)或还原的 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)，以及用于氧化反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD) 或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)。NADH和NADPH作为电子供体，而NAD和NADP作为 电子受体。经常观察到酮还原酶和醇脱氢酶接受磷酸化的或非磷酸化的辅因子（以其氧化 的或还原的状态）。
[0003] KRED酶可在广泛范围内的细菌和酵母中发现（综述参见：Kraus和Waldman， Enzyme catalysis in organic synthesis (有机合成中的酶催化）第 1&2 卷；VCH ffeinheim 1995 ；Faber, K. , Biotransformations in organicchemistry (有机化学中的生 物转化），第 4 版，Springs, Berlin HeidelbergNew York. 2000 ;Hunnel 和 Kula, 1989, Eur. J. Biochem. 184:1-13)。已经报道了一些KRED基因和酶序列，例如，木兰假丝酵母、近平滑 假丝酵母、赭色掷孢酵母。
[0004] 4-乙酰氧基氮杂环丁酮（简称4AA)是一种重要的手性合成子，是合成碳青霉烯和 青霉烯类新型广谱抗生素的重要中间体，如用于合成亚胺培南、法罗培南、美罗培南等。
[0005] 4AA的化学结构式如式I所示。4AA的分子骨架特征是一个四元内酰胺环，共含有 3个手性中心，存在8种立体异构体，如何高选择性地建立手性中心，是合成4AA的关键所 在。日本NOyori和Takasago公司采用以乙酰乙酸乙酯为起始原料的路线，各步的收率和立 体选择性都很好，总收率高达50%，是一条非常具有工业化前景的路线，该工艺路线如式1 所示，其中R是含有1~6个碳原子的饱和低级烷基。在该路线中，乙酰乙酸乙酯首先与卤 化后N-羟甲基苯甲酰胺反应，生成2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸酯（式II)，然后利用手 性催化剂（R)-BINAP-Ru经过羰基不对称还原反应，生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟 基丁酸酯（式III)，再经过脱保护基、分子内成酰胺键、叔丁基二甲硅基保护、三氯化钌催 化下的乙酰氧基化得到4AA。
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[0007] 在上述路线中，最关键的步骤是手性催化剂（R)-BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰 氨甲基-3-羰基丁酸酯（式II)生成（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯（式III)， 但由于该过程需要使用到贵重金属钌作为催化剂，并且需要在高温高压条件下进行，对反 应器要求较高，因此造成该路线生产成本较高，限制了 4AA大规模工业化生产。
[0008] 近年来，利用生物催化进行不对称反应的方法以其高度的化学、区域和立体选择 性，受到了越来越广泛的关注。采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细 胞。由于生物催化还原反应需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的 微生物全细胞作为催化剂。
[0009] 美国专利文献US4927507曾报道一种利用面包酵母还原2-苯甲酰氨甲基-3-羰 基丁酸酯的方法，得到产物的构型为（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯和 (2R, 3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。中国专利文献CN1940079B和CN1940080B也 曾研究利用面包酵母细胞不对称合成制备（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯系列 化合物，但获得的主要产物构型为（2S，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，占总产物的 75%以上，少部分副产物为（2R，3S)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，再利用碱性条件下 进行C2位构型翻转，使副产物（2R，3S)-构型转化为（2S，3S)-构型产物，再通过化学方法 将（2S，3S)-构型产物进行C3位构型翻转，得到（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯， 最后脱除3个保护基，最终得到（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸。但是上述已报道 的方法中，利用面包酵母羰基不对称还原所得到的产物主要构型均为（2S，3S)-构型产物， 需要再经过化学方法进行构型翻转的步骤，操作繁琐，回收率低。
【发明内容】
[0010] 本发明提供具有还原2-苯甲酰胺基甲基-3-氧丁酸甲酯至（2S，3R) -2-苯甲 酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯的能力的醛酮还原酶突变体多肽、编码该多肽的多核苷酸 和该多肽的使用方法。化合物（2S，3R)-2-苯甲酰胺基甲基-3-羟基丁酸甲酯是合成 (2R，3R) -3- ((R) -1-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基）乙基）-4-氧氮杂环丁 -2-基乙酸酯的中 间体，而后者为用于生产不同的碳杂青霉烯类抗生素的中间体。可从（2S，3R)-2-苯甲酰胺 基甲基-3-羟基丁酸甲酯合成碳杂青霉烯类抗生素包括但不局限于亚胺培南、美洛培南、 多利培南、厄他培南、比阿培南、帕尼培南和与沙纳霉素类似的其它化合物。
[0011] 本发明的第一方面提供了一种醛酮还原酶突变体，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋 白质：
[0012] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[0013] SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由中国专利申请201410541899. 8中 所述的核苷酸序列（参见本申请序列表SEQ ID NO: 1)编码，具有还原酮羰基的功能，是一 种新的醛酮还原酶。
[0014] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有醛酮还原酶活性的蛋白质。
[0015] 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白。根据本发明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋 白质分子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持醛酮还原酶活性。也就是说，只要由 (a)衍生的蛋白质具有醛酮还原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目 的。
[0016] 优选地，上述衍生的醛酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0017] (c)与（a)的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性且具有醛酮还原酶活性的蛋白质。
[0018] SEQ ID N0:2所示的醛酮还原酶和其他已知醛酮还原酶的氨基酸序列的同一性低 于90%，具有显著差异性，例如与吗啡脱氢酶YtbE之间的同一性为85%。
[0019] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。
[0020] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的醛酮还原酶。优选 地，所述核酸是由SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示核苷酸序列组成的。
[0021] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于中国专利申请 20141