0541899. 8，其可以从含有该核酸的培养基中分离获得，可以从含有该核酸的重组表 达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
[0022] 本发明中，SEQ ID N0:1所示的基因命名为BYKY-KRED，全长843bp。其中，其编码 序列（⑶S)从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0023] 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0:2的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID N0:1。本发明的醛酮还原酶基因的核苷酸序列也可以是 编码序列表中SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物 可以通过对核苷酸序列SEQ ID NO: 1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺 失或添加来制得。
[0024] SEQ ID NO: 1的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信 号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能 没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动 子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
[0025] SEQ ID NO: 1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO: 1所示序列的多聚 核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC ; 20 X SSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6X SSC+0. lwt % SDS溶液，更优选为5X SSC+0. lwt % SDS ;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0026] 本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的醛酮还原酶基因的重组表达载体。 其可通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因或其突变体的核酸序列连接于各种 表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、 噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载 体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21分别用Ndel和Hindlll酶切，形成 互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的醛酮还原酶基因的重组表达质 粒BYKY-KRED或其突变体表达质粒。
[0027] 本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。 可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规 的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的醛酮还原 酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E.coli)，更优选E.Coli BL21(DE3)。将 前述重组表达质粒BYKY-KRED或其突变体转化至E. Coli BL21(DE3)中，即可获得本发明 优选的基因工程菌株，即E. Coli BL21 (DE3)/BYKY-KRED或其突变体。转化方法可选择本 领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是： 42 °C，热击90秒。
[0028] 本发明的第五个方面是提供一种重组醛酮还原酶的制备方法，其包括如下的步 骤：培养本发明的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组醛酮还原酶。
[0029] 其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化 至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使 转化体生长并表达本发明的醛酮还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基（蛋 白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. 0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可 以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转 化体生长并表达本发明的醛酮还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规 操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠 杆菌（优选E. coli BL21 (DE3)/pET21a-BYK-KRED或其突变体）接种至含氨苄青霉素的LB 培养基中培养，当培养液的光密度达到〇. 6~0. 8时，加入终浓度为0. 1~1. Ommol/ L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)进行诱导，诱导温度10~37°C (更佳地是 25°C )，即可高效表达本发明所述重组醛酮还原酶。
[0030] 本发明的第六个方面是提供一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形 成手性羟基化合物的催化剂，其可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过该培养物 离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里"加工的制品"是指由转化体得 到的提取物、或通过对提取物中的醛酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者 通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品，或者通过冻干 得到的冻干粉。
[0031] 本发明的第七方面提供了本发明的醛酮还原酶、重组醛酮还原酶或催化剂在催化 前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。
[0032] 所述前手性羰基化合物较佳地为2-取代氨基甲基-3-氧代丁酸酯化合物，即式I 所示的化合物：
[0033]
[0034] 其中，R为C1~C6烷基，R'为氨基保护基。
[0035] 优选地，所述的氨基保护剂选自叔丁氧羰基、苄氧羰基、三苯甲基、苯甲酰基、甲酰 基、三氟乙酰基。
[0036] 所述前手性羰基化合物更优选地为2-苯甲酰胺甲基-3-氧代丁酸甲酯。
[0037] 本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选 择，较佳地，所述应用包括下述步骤：在pH 5. 0~8. 0的水溶液中，在本发明的醛酮还原酶、 重组醛酮还原酶或催化剂的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活 性手性羟基化合物。
[0038] 在一种具体的实施方式中，在pH 5. 0~8. 0的水溶液中，在本发明的醛酮还原酶 冻干粉催化下，在NADP+、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物进行不对称还 原反应，形成光学活性手性羟基化合物。
[0039] 在另一种具体的实施方式中，在pH 5. 0~8. 0的水溶液中，在本发明的醛酮还原 酶、重组醛酮还原酶或催化剂催化下，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶存在下，前手性羰基化合物 进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。
[0040] 上述的葡萄糖和葡萄糖脱氢酶可以被异丙醇替代。
[0041] 其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为10~1000g/L。本发明 的醛酮还原酶用量为催化有效量，较佳地为1~20g/L。本发明的葡萄糖用量较佳为1~ 20g/L，葡萄糖脱氢酶的用量较佳为100~1000U/L。本发明的异丙醇的用量为反应体积的 10%。本发明的NADP +的用量为催化量的，较佳地